Respostes de favonoides i fitoxilipina a les fulles de magrana (Punica Granatum L.) Part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:El jasmonat de metil (MeJA) produït a les plantes pot mediar la seva resposta a les tensions ambientals. També s'ha demostrat que l'aplicació exògena de MeJA activa les vies de senyalització i indueix l'acumulació de fitoalexina en moltes espècies vegetals. Per entendre com les plantes de magrana responen bioquímicament a les tensions ambientals, es va realitzar una anàlisi de metabòlits en fulles de magrana sotmeses a l'aplicació de MeJA i van revelar canvis únics en tanins hidrolitzables, flavonoides i fito-oxilipines. A més, les anàlisis de transcriptoma i qPCR en temps real de fulles de magrana tractades amb simulacre i MeJA van identificar gens metabòlics expressats de manera diferent i factors de transcripció que estan potencialment implicats en el control dehidrolitzablevies de tanins, flavonoides i fitoxilipina. Caracterització molecular, bioquímica i bioinformàtica de l'úniclipoxigenasaamb una expressió sostinguda induïda per MeJA va demostrar que és capaç d'oxidar àcids grassos poliinsaturats, encara que no es troba al compartiment subcel·lular on es van produir fitoxilipines no jasmonats (no JA). Aquests resultats van suggerir col·lectivament que, mentre que la supressió àmplia de flavonoides i antocianines està controlada almenys parcialment a nivell transcripcional, la biosíntesi induïda de no JA.Fito-oxilipinesprobablement no estigui regulat transcripcionalment. En general, una millor comprensió de com responen les fulles de magrana a les tensions ambientals no només promourà la salut i la productivitat de les plantes, sinó que també tindrà un impacte en la salut humana, ja que els fruits produïts per les plantes de magrana són una font rica de compostos nutritius.

Paraules clau:Jasmonat de metil.Flavonoide·Antocianina· Àcids grassos.Fito-oxilipina·Lipoxigenasa

Feu clic aquí per saber-ne més

Introducció

Quan són ferides o atacades per herbívors i patògens, les plantes produeixen i emeten metil jasmonat (MeJA), que és percebut pels teixits vegetals no ferits i les plantes veïnes per activar la resposta de defensa (Cheong i Choi 2003). A més, s'ha demostrat que l'aplicació exògena de MeJA a una planta provoca vies de senyalització, així com la producció de proteïnes relacionades amb la patogènesi i productes químics de defensa coneguts com fitoalexines. Les fitoalexines fenòliques, com ara flavonoides i antocianines, han mostrat una acumulació augmentada en resposta al tractament amb MeJA en diferents plantes, com ara Arabidopsis thaliana, raïm (Vitis vinifera), plàtan (Musa acuminate), poma (Malus Domestica) i gerd vermell (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res i Ruiz del Castillo 2014). La biosíntesi de flavonoides i antocianines comença amb la formació de naringenina calcona a partir de cumaroil CoA i tres molècules de malonil CoA catalitzades per la calcona sintasa (CHS) i la posterior isomerització de la naringenina calcona a naringenina per la calcona isomerasa. Aleshores, la naringenina s'utilitza per generar els esquelets bàsics de flavonoides i antocians, que es modifiquen encara més amb grups funcionals glicosil, metil, hidroxil i prenil per donar lloc a diverses estructures i funcions (Tian et al. 2008).

Cistanche pot millorar la immunitat

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 per cent de semblança) i no contenen un pèptid senyal, mentre que els LOX tipus II tenen una semblança general de seqüència baixa (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

La magrana (Punica granatum L.) és un cultiu hortícola especialitzat apreciat pels abundants compostos fenòlics del seu fruit, com ara flavonoides, antocians i tanins hidrolitzables (HT) que es deriven d'un intermedi de la via dels shikimats (Ono et al.2016). ). Fins ara, molts estudis s'han centrat en el paper dels fenòlics de la magrana per alleujar l'estrès i les malalties en humans (Wu i Tian 2017). ferides, patògens, inducció de MeJA) en fulles i fruits. Dos informes recents van avaluar el tractament MeJA abans de la collita sobre la qualitat postcollita de fruits de magrana (Koushesh Saba i Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Les antocianines, els flavonoides i els fenòlics totals de les fruites tractades amb MeJA, però no les fulles, es van analitzar col·lectivament mitjançant un espectrofotòmetre. Un dels estudis també va analitzar antocianines individuals mitjançant espectrometria de masses (Garcia-Pastor et al.2020). No obstant això, encara no està clar com els teixits de la planta de magrana, ja siguin fulles o fruites, responen a les tensions ambientals abans de la cuallada.

Per començar a disseccionar les interaccions entre les plantes de magrana i els factors ambientals, es va investigar la resposta metabòlica de les fulles de magrana a l'aplicació exògena de MeJA mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) i espectrometria de masses en tàndem de cromatografia líquida-ionització electrospray (LC-ESI-MS/MS) . Es van observar canvis únics en HT, flavonoides i antocianines, així com alteracions en lípids, àcids grassos i fito-oxilipines a les fulles de magrana tractades amb MeJA. L'anàlisi comparativa del transcriptoma, validada per l'anàlisi qPCR en temps real, va revelar que els gens estructurals i/o reguladors implicats en el metabolisme de HT, flavonoides, antocianines i fito-oxilipina es van expressar de manera diferent en fulles de magrana tractades amb simulacre i MeJA. L'únic gen LOX que va mostrar una expressió regulada sostinguda a les fulles tractades amb MeJA va ser sotmès a una caracterització molecular, bioquímica i filogenètica addicional.

Materials i mètodes

Els estàndards de glucosa -glucogallina i pentagalloil es van comprar a Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Xangai, Xina). Els productes químics utilitzats en l'assaig LOX es van obtenir dels venedors següents: 3-àcid (dimetilamino)benzoic (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Xangai, Xina), àcid linoleic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) i hemoglobina (Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, Xina).

Materials vegetals Fruits i llavors de magrana (cv. Meravellós) van ser proporcionats generosament per l'Acadèmia Panzhihua de Ciències Agrícoles i Forestals i identificats pel Dr. Binjie Ge al Jardí Botànic de Xangai Chenshan. Es va dipositar un exemplar de val (núm. CSHO173966) a l'herbari del Jardí Botànic de Xangai Chenshan, Xangai, Xina. Les plàntules de magrana es van cultivar en una sala de creixement a temperatura controlada durant 6 setmanes a 25 graus i 16 h de llum / 8 h de foscor. La concentració de MeJA per a l'aplicació d'esprai als teixits vegetals oscil·la entre 100 i 250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Inicialment es van aplicar diferents concentracions de MeJA a les fulles de magrana, de les quals 200 μM de MeJA van donar lloc a una resposta metabòlica perceptible en l'anàlisi preliminar i es van utilitzar per a les anàlisis de metabòlits i expressió gènica descrites en aquest estudi. Abans del tractament MeJA, la meitat de les plantes de magrana es van traslladar a una altra sala de creixement amb condicions similars. Mentre que les plantes d'una sala de creixement es van ruixar amb 200 μM de MeJA, les de l'altra sala de creixement es van ruixar amb aigua (és a dir, control simulat). A les 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h i72-h després del tractament, surt de3 es van agrupar 5 plantes tractades amb simulacres o MeJA, que constitueixen una rèplica biològica. Es van recollir tres rèpliques biològiques per als experiments de tractament simulat i MeJA; cada rèplica biològica es va dividir en alíquotes per al perfil de metabòlits i anàlisis d'expressió gènica.

Anàlisi de perfils de metabolits

Les fulles de magrana es van liofilitzar, es van pesar i es van triturar en una pols fina utilitzant perles de zirconi en un batedor de comptes (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Alemanya) durant els anys 90 a 30 Hz. Per a l'anàlisi HPLC, la mostra de fulla es va extreure en metanol al 70 per cent durant 60 min sota sonicació i es va centrifugar a 13, 000 rpm durant 10 min. El sobrenedant es va transferir a un vial de HPLC, dels quals 30 μL es van injectar en un HPLC de fase inversa (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) i es va analitzar tal com es va descriure anteriorment (Wil-son et al.2019). Els metabòlits es van detectar per absorció UV a 254 nm, 280 nm, 320 nm i 360 nm. Es van construir corbes de calibratge estàndard de -glucogallina i pentagalloil glucosa; es van utilitzar per convertir les àrees de pics que coincideixen amb els temps de retenció i els espectres d'absorció de -glucogallina i pentagalloil glucosa a les concentracions respectives.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>Es va considerar que =1 havien canviat significativament.

Anàlisi del transcriptoma

L'ARN total es va extreure de fulles de magrana mitjançant el reactiu TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) i es va quantificar mitjançant Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA). La integritat de les mostres d'ARN es va verificar mitjançant la separació en gel d'agarosa (sense degradació visible) i la determinació de la relació OD20/28o (entre 1,8 i 2,2) mitjançant Nanodrop2000. L'enriquiment de l'ARNm a partir de l'ARN total es va dur a terme mitjançant les perles magnètiques oligo (dT) (Invitrogen). Les biblioteques d'ARNm-Seq es van construir mitjançant el kit de preparació de biblioteques d'ARN Truseq (Illumina, San Diego, CA, EUA). L'anàlisi del transcriptoma es va dur a terme a Illumina HiSeq4000 i es van obtenir 55-60 milions de 150-pb de lectures aparellades (PE150) per a cada biblioteca de mostres. Les dades de la seqüència en brut es van processar eliminant les seqüències de l'adaptador així com les seqüències curtes (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 i valor P ajustat<>

Anàlisi qPCR en temps real

L'ARN total es va extreure de fulles de magrana tractades amb simulacre i MeJA mitjançant el kit de plantes pures RNAprep (Tiangen Biotech Co., Ltd., Pequín, Xina). La transcripció inversa (RT) es va realitzar mitjançant l'ARN total i el kit de reactius PrimeScriptTM RT (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japó). La PCR quantitativa (qPCR) es va dur a terme mitjançant el kit TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) i un sistema de PCR en temps real StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Es va realitzar una anàlisi de la corba de fusió i va mostrar un únic producte d'amplificació per a cada parell d'imprimadors. Per a l'anàlisi RT-qPCR, es van examinar tres rèpliques biològiques i cadascuna amb tres rèpliques tècniques per a mostres tractades amb simulacre i MeJA. L'expressió gènica es va analitzar mitjançant el mètode comparatiu C,(△AC) (Livak i Schmittgen 2001) i es van determinar els nivells de significació mitjançant una prova t de Student de dues cues. Les seqüències d'imprimació per a l'anàlisi de qPCR en temps real i les eficiències d'amplificació dels parells d'encebadors es mostren a la taula S1.

Expressió i purificació de proteïnes recombinants i assaigs enzimàtics

El marc de lectura obert de Pgr025417 (que codifica una LOX putativa) es va sintetitzar per a un ús òptim de codons a E. coli (Genewiz, Suzhou, Xina) i es va clonar a pET28a. El plasmidi recombinant es va transformar en E. coli BL21 (DE3) cèl·lules. Es va iniciar un cultiu de 5-ml Luria Bertani (LB) amb 50ug ml-Ikanamicina a partir d'una sola colònia i es va incubar durant la nit amb agitació a 37ºC. El cultiu durant la nit es va utilitzar per inocular un medi LB de 100-mL amb 50 ug mL de kanamicina i es va deixar créixer fins a una DO600 de 0,5. A continuació, es va afegir isopropil- -D-tiogalactoside (IPTG) a una concentració final de 0, 1 mM per a la inducció de l'expressió de proteïnes. Després de la incubació amb agitació a 16 graus durant 18 h, les cèl·lules es van recollir per centrifugació. Els pellets de cèl·lules es van tornar a suspendre al tampó de lisi (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 10 mM imidazol) i es van homogeneïtzar mitjançant un disruptor cel·lular (Constant Systems Ltd, Northants, Regne Unit). Les proteïnes marcades amb ell es van purificar mitjançant Perles de Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) amb el tampó de rentat (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 25 mM imidazol) i el tampó d'elució (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 500 mM) imidazol). Les proteïnes purificades es van separar en un gel SDS-PAGE al 10% per visualitzar la puresa de les proteïnes. La concentració de les proteïnes purificades es va determinar mitjançant l'assaig de Bradford (Bradford 1976).

Per a l'assaig LOX, l'àcid linoleic es va utilitzar com a substrat en un mètode colorimètric de dos passos amb lleugeres modificacions (Anthon i Barrett 2008). La mescla de reacció de 500-μL, que inclou 50 mM de Na-fosfat, pH 6, 10 mM de DMAB, 0,5 mM d'àcid linoleic i diverses quantitats de proteïnes recombinants purificades (1,5 mg mL -), es va incubar a 25 graus durant 10 min. Es va afegir una segona solució (500 μL) que contenia 0,2 mM de MBTH i 0,1 mg mL d'hemoglobina a la barreja de reacció, que es va incubar durant 5 minuts addicionals. La reacció es va acabar afegint 500 μL 1 per cent (p/v) de laurilsulfat de sodi. Es va determinar l'absorció de llum a 598 nm. Localització subcel·lular i anàlisis filogenètiques Una cerca del genoma anotat de la magrana (Qin et al. 2017) va identificar 1l LOX de longitud completa putatius (786 aa a 970 aa), incloent Pgr025413, Pgr020032, Pgr025413, Pgr020032, Pgr0254032, Pgr0254032, Pgr025418188542, Pgr025412 -seqüència de longitud a GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 i PgrO13780. La localització subcel·lular i els llocs d'escissió dels pèptids senyal per als LOX de magrana es van predir mitjançant TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

Anàlisi del lloc d'unió de TF

Per predir els llocs d'unió dels TF, es van obtenir 1000 pb aigües amunt del codó d'inici ATG dels gens objectiu de GenBank i es van cercar contra els Eucalyptus Grandis TF a PlantRegMap (versió 5) (Tian et al. 2020). El valor llindar per a la unió la identificació del lloc es va establir a P Menor o igual a le-4. L'anàlisi estadística de la quantificació de metabòlits, el transcriptoma i les dades de qPCR en temps real es descriuen a les seccions respectives.

Resultats

MeJA modula la senyalització cel·lular i les vies metabòliques a les fulles de magrana

Per entendre la resposta transcripcional de tot el genoma de la magrana a l'obtenció de MeJA, els transcriptomes de les fulles de la magrana surten a 2-h,6-h,24-h i 72-h després de MeJA o es van analitzar el tractament simulat (cadascun amb tres rèpliques biològiques) (Fig. S1). Es van obtenir aproximadament 55 milions de lectures de seqüències en brut (2 × 150 pb parell d'extrems) per a cada transcriptoma amb un contingut de GC al voltant del 52 per cent i valors de Q30 que van del 91, 6 al 95 per cent (taula S2). Per a tots els transcriptomes, més del 96 per cent de les lectures de la seqüència netejada es van assignar al genoma de la magrana de referència (Qin et al.2017) (taula S3). La majoria de les transcripcions reunides eren menys de 1000 pb (34,3 per cent), 1000 pb— 2000 pb (32,9 per cent), o 2000 pb—3000 pb (18,1 per cent) (taula S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, P ajustat<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Per determinar si els canvis en la quantitat de transcripcions de gens biosintètics de shikimat i HT poden afectar el nivell de metabòlits derivats d'aquestes vies, es van extreure metabòlits fenòlics de les fulles collides a 24-h, 30-h. 36-h,48-h i 72-h després de MeJA o aplicació simulada i analitzat per HPLC (Fig.2). Cal tenir en compte que aquests punts de temps es van escollir per tenir en compte el temps necessari per a la síntesi de proteïnes i la producció i acumulació de metabòlits després dels canvis d'expressió observats dels gens biosintètics de shikimat i HT a 6-h. Els temps de retenció i els espectres d'absorció de dos metabòlits es van eluir a 4, 57 min (pic 1) i 24, 98 min (pic 2) coincidint amb els dels intermedis de la via HT: glucogallina i aliatges Penta-glucosa, respectivament (Figs. la i 2a). Tots dos pics van mostrar canvis significatius a les zones pics integrades en diversos moments (Fig. 2b). Concretament, el pic 1 va augmentar a les fulles tractades amb MeJA en relació amb els controls simulats a 30-h, 36-h i 48-h (Fig.2b). Curiosament, el pic de 2 polzades de fulles tractades amb MeJA va disminuir inicialment a 24-h, però posteriorment va augmentar a 30-h i 36-h abans de tornar a un nivell similar als controls simulats a 48- h i 72-h (Fig.2b). La reducció de la majoria de flavonoides i antocianes, així com l'augment de flavones i flavonols metilats, es va fer evident a les fulles de magrana tractades amb MeJA.

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Taules S5 i S6). Per als metabòlits acumulats de manera diferencial, hi va haver un enriquiment global de metabòlits implicats en el metabolisme secundari/especialitzat de les plantes (67 de 102), especialment els compostos fenòlics (63 de 102) (taula S6).

Entre els fenòlics, es va observar una reducció concertada d'una àmplia gamma de flavonoides i antocians (42 dels 73 compostos disminuïts) a les fulles tractades amb MeJA (Fig. 3; Taula S6). Curiosament, tres flavones i flavonols mono- o di-O-metilats, incloent di-O-metil quercetina, crisoberil O-hexosil-O-hexòsid i la venda d'5-O-hexòsids, es van augmentar a les fulles tractades amb MeJA. (Fig. 3; Taula S6). Diversos intermedis de les vies de flavonoides i antocianines, com la luteolina, el crisoberil, el dihidrokaempferol, la dihidroquercetina, la dihidromiricetina, l'epicatequina, la delfinidina i la pelargonidina, van ser detectables, però no van mostrar canvis significatius a les fulles tractades amb MeJA (Fig.3; Taula S5). Els derivats d'hidroxicina-namoil, les isoflavones i les cumarines es trobaven entre altres fenòlics que van mostrar una acumulació reduïda a la inducció de MeJA (taula S6). Per contra, dos àcids fenòlics, àcid 2,3-dihidroxibenzoic i àcid protocatecuic (àcid 3,4-dihidroxibenzoic) i una cumarina, 6-metil cumarina, es van incrementar a les fulles tractades amb MeJA (Taula S6).

En consonància amb els flavonoides i antocians en gran mesura reduïts a les fulles de magrana tractades amb MeJA, les transcripcions de dos enzims clau per a la biosíntesi de flavonoides i antocianines. CHS (Pgr005566) i CHI (Pgr025966), es van reduir significativament a les 6- h i 24- h després de l'aplicació de MeJA segons l'anàlisi del transcriptoma (figura 4). Es va realitzar una anàlisi qPCR en temps real per examinar l'expressió CHS i CHI amb punts de temps addicionals, com ara 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h i 72-h (Fig.4). Les transcripcions de CHS van caure a les fulles tractades amb MeJA a les 3-h i van continuar sent significativament inferiors a les de la simulació. controla fins a 72-h, amb la disminució més gran a 12-h. En canvi, la reducció de l'expressió CHI només va ser significativa a 24-h, 48-h i 72-h després del tractament amb MeJA (figura 4).

Aquest article està extret de Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9