Caracterització estructural i avaluació de les activitats antiinflamatòries i antitirosinases dels polifenols del melastoma normal part 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

El compost 3 tenia la mateixa fórmula molecular que el compost 2, tal com determinen les seves dades HRESIMS. La comparació entre les dades de RMN de 3 i 2 (taula 2) va revelar que el grup metoxil a galloil-C-4 en 2 es va desplaçar a galoil-C-3' a 3. Això es va confirmar per les correlacions HMBC. (Figura 2) dels protons metoxil (8y 3,88) i el protó aromàtic (bH7,24) amb galloil-C-3'(6c 149,1) en 3, i els desplaçaments químics del grup metoxil, galloil-C{ {24}}, galoil-C-4 i galoil-C-3' que van canviar de bc60.8,151.5,141.3, i 146.5 en 2tobc56.7,146.6,140.7, i 149.1 en 3, respectivament L'efecte cotó a 237 nm i un negatiu a 262 nm a l'espectre CD van indicar la configuració (S) del grup HHDP per a 3 [24]. La configuració del fragment de sucre es va deduir a partir de la constant d'acoblament (=8,5 Hz) del protó anomèric del fragment glucosil. La hidròlisi àcida de 3 amb HCl 1 M va produir D-glucosa, que es va confirmar mitjançant anàlisis TLC i GC. Per tant, el compost 3 es va identificar com a 1-O-galloil-6-O-({3-metoxigalloil){-2,{3-O-(S)-hexahidroxidifenoil{{ 66}}D-glucosa.

La fórmula molecular de 4 es va deduir del seu espectre HRESIMS (m/z 783,1032, [MH]-) com a C35 H28 O21. El seu pes molecular era 16 unitats de massa menor que el de 3, cosa que es pot atribuir a l'absència d'un hidroxil i la presència d'un protó aromàtic (6H6.87) a vanilloil-C-5' en 4 (taula 2) . Això es va confirmar per la presència d'un fragment aromàtic trisubstituït 1,24- （μ7,60 （dd, J=8.3,1,8 Hz）, 6,87 （d, J=8 0,3 Hz） i 7,57 （d, J=1,8 Hz）） i el canvi de desplaçament químic de galloil-C-5' a δc 145,8 in 3 a vanil·loil-C-5 'a bc 115,9 a 4. Les correlacions dels protons metoxil (6H 3,90) i el protó aromàtic (H 6,87) amb vanilloil-C-3' a l'espectre HMBC (figura 2) van confirmar encara més el protó aromàtic (H 6,87) a vanil·loil-C-5'. Es va demostrar que l'atropisomerisme de l'HHDP era una configuració S per l'aparició d'efectes de cotó positius i negatius a 239 nm i 263 nm, respectivament [24]. Les constants d'acoblament del protó anomèric en 4 eren de 8,5 Hz que recordaven la configuració -anomèrica. La hidròlisi àcida va revelar que 4 tenia les mateixes unitats de sucre que 3. Així, el compost 4 es va identificar com a 1-O-galloil-6-O-vanilloil{-2,3-O- (S)-hexahidroxidifenoil- -D-glucosa.

Feu clic aquí per saber-ne més

2.2. Assajos d'activitat antiinflamatòria

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50 uM. S'ha informat que els flavonols coneguts kaempferol(7)[26[, quercetina (10)[27l i miricetina-3-O- -L-ramnopiranòsid(12)28 tenen activitat antiinflamatòria, però el kaempferol -3-ramnòsid (8) [26] i quercetina-3-O- -L-ramnòsid (11)[29] no tenen activitat antiinflamatòria. A partir dels resultats experimentals i de les dades de la literatura, els flavonoides de la planta del títol tenen una millor activitat antiinflamatòria que els elagitanins, pot ser l'ingredient actiu corresponent a l'efecte antiinflamatori d'aquesta planta.

2.3. Assajos d'activitat inhibidora de la tirosinasa

Tots els compostos es van investigar per a una possible activitat inhibidora de la tirosinasa. Com es mostra a la taula 3, els nous compostos 2-4 van mostrar activitats inhibidores de la tirosinasa moderades. El nou compost 1 va mostrar una feble activitat inhibidora de la tirosinasa. La quercetina (10)[30] té una activitat inhibidora significativa de la tirosinasa, i la seva activitat antitirosinasa és millor que la quercetina-3-OwL-ramnòsid(11)[26] i el kaempferol (7) [26], que és coherent. amb les dades de la literatura. Això va indicar que els grups 3'-i 4/-hidroxi de l'anell B i els grups 3-hidroxi de l'anell C dels flavonols eren crucials per a les seves activitats. L'activitat anti-tirosinasa del kaempferol (7)[26] és millor que el kaempferol-3-ramnòsid (8)[26]i els compostos 8 i 12 [31] no tenen activitat anti-tirosinasa significativa, la qual cosa dóna suport a l'anterior. relacions estructura-activitat.

3. Experimental 3.1.Materials

Les arrels de M.normale es van recollir a la ciutat de Yanshan, ciutat de Guilin, província de Guangxi, el setembre de 2018 i autenticades pel professor Yusong Huang (Institut de Botànica de Guangxi). Es va dipositar un exemplar de val (20180912) al Laboratori Clau d'Investigació i Ús de Fitoquímics Funcionals de Guangxi, Institut de Botànica de Guangxi, Xina.

Cistanche pot millorar la immunitat

3.2. Procediments Experimentals Generals

Les rotacions òptiques es van mesurar amb un ADP440 més polarímetre （λ 589 nm, longitud del camí 1.0 cm). Els espectres de RMN es van adquirir en un espectròmetre Bruker Advance 500 （Bruker Biospin AG, Fällanden, Suïssa）, i els pics de dissolvent residuals es van utilitzar com a referències. Les constants d'acoblament i els desplaçaments químics es van donar en Hz i en una escala δ (ppm), respectivament. Les dades ESIMS i HIRESIMS es van registrar en un espectròmetre de masses BRUKER HCT i un espectròmetre LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japó), respectivament. La GC es va realitzar en un sistema Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, EUA) amb una columna Chirasil-Val de 0,32 mm dx × 25 ml. L'HPLC analític es va executar en un sistema HPLC Shimadzu LC-2030C (Shimadzu, Kyoto, Japó) mitjançant una columna Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um) de 4,6id × 250 mm. L'HPLC semipreparativa es va dur a terme en un sistema d'HPLC LC-20AT de Shimadzu utilitzant una columna Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) de 20,0id × 250 mm a un cabal de 4 ml/min. La cromatografia en columna (CC) es va realitzar mitjançant Sephadex LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Suècia), columna de gel de sílice (200-300 malla, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, Xina), gel MCI CHP 20P (75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tòquio, Japó) i columnes Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Alemanya).

3.3. Extracció i separació

Les arrels en pols assecades a l'aire (10 kg) de M. normale es van extreure amb un 8{{20}} per cent d'acetona aquosa (3 × 7 dies) a temperatura ambient i cada extracte es va filtrar. Els filtrats es van assecar a pressió reduïda per obtenir un extracte brut (0,6 kg). L'extracte es va suspendre en H2O (1 L) i es va repartir successivament amb èter de petroli (3 × 2 L), EtOAc (3 × 2 L). L'extracte EtOAc (8{{40}}g) es va dividir en deu fraccions ( Fr.1-10)per gel de sílice CC (8 id×2{0 cm) eluint amb un gradient de CH2Cl-MeOH(100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Es va carregar Fr.4 (32 g) en una columna de gel MCI (6i.d.×20 cm) i es va eluir amb un gradient de MeOH-H,O（0∶100-100∶0,v/ø） a proporcionar divuit subfraccions (Fr4-1-4-18). La separació de la subfracció Fr4-14(3,0 g) es va fer mitjançant una altra columna de gel de sílice (3i.d.×20 cm) eluint amb un gradient de CH2Cl{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) i Sephadex LH-20 CCelució amb CH2Cl{2-MeOH (1:1,v/o) per obtenir 7 (11,3 mg) ), 8 (10,6 mg), 9 (9,3 mg), 10 (20,6 mg), 11 (7,6 mg) i 12 (6,2 mg). Es va aplicar Fr 6 (4, 2 g) a la columna ODS C18 i es va eluir amb MeOH-H2O (20:80-80:20) per obtenir 9 subfraccions (Fr 6-1-6-9). La separació addicional de la subfracció Fr 6-4(1,2 g) utilitzant Sephadex LH-20 CC (eluït amb MeOH-H2O,10:90-100:0) va donar els compostos 1 (9,6 mg),5( 7,2 mg) i 6 (7,3 mg), respectivament. Els compostos 2 (tR 130,5 min, 5,2 mg), 3 (tR 146,8 min, 9,6 mg) i 4 (tR 177,2 min, 15,3 mg) es van obtenir a partir de Fr7 (2,5 g) mitjançant HPLC semipreparatiu diluint amb un gradient de MeOH-H2O ( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4.Dades espectroscòpiques

Taní de whisky C (1): pols amorf marró; [ ]-12,6 graus (c= 0,16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203（2,02）,276（1,19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1 Dades de RMN 13C a mà, vegeu la taula 1; HRESIMSm/z:[MH]{{24} },1240 (calculat per a C4sH33O27-, 1005,1215). 1-O-(4-metoxigaloil)-6-O-galloil{-2,{3-O-(S)-hexahidroxidifenoil- -D-glucosa( 2): pols amorf marró pols amorf; 【 】5-5,5 graus （c=0,17, MeOH）; UV（MeOH） 入max nm （log e）∶203 （2,52）,275（2,01）; CD （MeOH）λmax（△8）264（-8,0）,238（30,6）,218（1,3）.'H i dades de 13C-RMN, vegeu la taula 2; HRESIMS m/z: 799,0983[MH]-(calculat per a C3sH2O22-, 799,099).

{{0}}O-galoil-6-O-({3-metoxigaloil)-2,{3-O-(S)-hexahidroxidifenol-6- D-glucosa (3); Pols amorf marró;【 】7-33,5 graus （c=0,12, MeOH）; UV（MeOH）入max nm （log e）∶203 （2,40）,273（1,68）; CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）. Dades de Hand13CNMR, vegeu la taula 2; HRESIMS m.10:769 [MH]-(calculat per a C35H2O22-, 799,0999). 1-O-galloil-6-O-vanilloil-2,3-O-(S)-hexahidroxidifenoil- -D-glucosa (4): pols amorfa marró; 【 】7-20,6 graus （c=0,15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm （log e）∶203 （2,42）,278（1.86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）,239 （42.5）, 219（0.9）.'H i dades 13CNMR, vegeu la taula 2; HRESIMS m/z: 783 [MH]-1032. (calculat per a C35H27O21-, 783,1050).

3.5. Hidròlisi àcida de 2-4

El compost 2 (2 mg) es va tractar amb HCl 1 M (5 ml) a 8 0 graus durant 4 h, i després es va extreure amb acetat d'etila (3 × 5 ml). La fase aquosa es va assecar sota un corrent de N2 per generar un residu neutre que es va analitzar mitjançant TLC (SiO2) amb EtOAc-piridina-EtOH-H, O (7:1:1:2) com a sistema dissolvent. El valor R del residu neutre era el mateix que el de la glucosa D autèntica, cosa que indica que el component de sucre de 2 era glucosa. El residu neutre i 5 mg de clorhidrat d'èster metílic de L-cisteïna es van dissoldre successivament en 3 ml de piridina anhidra i es van escalfar a 80 graus durant 1 h. Després d'eliminar el dissolvent per evaporació a pressió reduïda, la mescla de reacció es va fer reaccionar posteriorment amb 0,6 ml de N-trimetilsililimidazol a 80 graus durant 1 h. La barreja de reacció es va repartir amb n-hexà i H, O, i després es va analitzar la capa de n-hexà mitjançant un instrument GC. Les temperatures de l'injector i del detector es van establir a 250 graus i 280 graus, respectivament. La temperatura inicial de la columna es va mantenir a 160 graus durant 1 min, després es va augmentar a 280 C a 5 graus / min i es va mantenir durant 10 min. La D-glucosa autèntica i la L-glucosa autèntica es van sililar i analitzar de la mateixa manera, i els seus temps de retenció van ser de 19,09 i 19,25 min, respectivament. Els resultats de l'anàlisi GC van indicar que el component de sucre de 2 era D-glucosa (t 19,1 min). Els components del sucre de 3 i 4 es van determinar mitjançant el mateix procediment.

3.6. Activitat antiinflamatòria

3.6.1.NO Producció per cèl·lules RAW 264.7 estimulades per LPS

Les cèl·lules RAW 264,7 es van cultivar en DMEM complementat amb un 10 per cent de FBS a 37 graus en una atmosfera humidificada d'un 5 per cent de CO2 durant 24 h. Les cèl·lules d'una placa de 24-pous (5 × 104 cèl·lules/pou) es van tractar amb 200 ng/mL de LPS i els compostos de prova. Després de 22 h, es van recollir els mitjans i es va mesurar el nivell de nitrit mitjançant el sistema de reactius de Griess (Promega, Madison, WI, EUA).

3.6.2. Viabilitat cel·lular

Es va realitzar un assaig MTT per mesurar la citotoxicitat de les mostres de prova a la línia cel·lular RAW264.7. Les cèl·lules que estaven en la fase de creixement logarítmic es van sembrar en una placa de 96-pous a la densitat de 5 × 10 més -6 × 10* cèl·lules/pou i es van incubar a 37 graus amb un 5 per cent de CO, durant 24 h. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb 100 μL de medi de cultiu a diverses concentracions de mostres de prova durant 24 h. El medi es va descartar i es van afegir 100 uL de medi lliure de FBS que contenia MTT (1 mg/ml) a cada pou. Després de la incubació a la incubadora durant 4 h, es va descartar el sobrenedant i es van afegir 100 μL de DMSO a cada pou per dissoldre el formazan. L'absorbància es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de microplaques.

3.7. Activitat anti-Ty/rosinasa

Les activitats anti-tirosinasa dels aïllats es van investigar segons el procediment descrit per Aoki et al. amb lleugeres modificacions [21]. La L-DOPA i l'àcid cògic es van utilitzar com a substrat i control positiu, respectivament. Es van preparar una solució de L-DOPA a 5.0 mM, tirosinasa de bolets a 100 U/mL, així com mostres a diferents concentracions en tampó fosfat (pH6.8), 20 μL de la solució de mostra i 10 μL de solució de tirosinasa de bolets es van barrejar i es van preincubar a 37 graus durant 10 min, després es van afegir 40 uL de solució de L-DOPA i es van incubar a 37 graus durant 5 min. El sistema de reacció de l'experiment d'activitat anti-tirosinasa es mostra a la taula 4. L'absorbància es va mesurar a 475 nm mitjançant el lector de microplaques multimode Spark 10M (Tecan Trading AG, Zuric, Suïssa). Tots els assajos es van repetir tres vegades i cada vegada per triplicat. El percentatge d'inhibició de l'activitat de la tirosinasa es va calcular mitjançant la fórmula següent:

on T representa l'absorbància amb mostra i tirosinasa; A representa l'absorbància amb una mostra però sense tirosinasa; C representa l'absorbància amb tirosinasa però sense mostra; Co representa l'absorbància sense tirosinasa i mostra.

4. Conclusions

L'estudi pretén explorar més activitats antiinflamatòries i inhibidores d'enzims dels polifenols de les arrels de M.normale sobre la base dels nostres treballs anteriors [20]. Com era d'esperar, es van obtenir dotze polifenols de la planta de rajoles per primera vegada i el compost 1-4 era elagitanina nova. L'aïllament i la identificació de l'estructura amb èxit de l'elagitanina proporcionen materials per al cribratge de fàrmacs antiinflamatoris i inhibidors d'enzims i també contribueixen al desenvolupament i la utilització de M.normale. Les ellagitanines 1-4 no tenen activitats inhibidores de la tirosinasa ni activitats antiinflamatòries significatives, la qual cosa fa que sigui menys probable que sigui un possible fàrmac antiinflamatori o inhibidor d'enzims. Afortunadament, tenen nous efectes, com la lluita contra l'obesitat [6,7]. Els flavonoides tenen millors activitats enzimàtiques antiinflamatòries i inhibidores que les elagitanines a les arrels de M. normale, i és més probable que siguin inhibidors antiinflamatoris i antienzims. L'estudi de la relació estructura-activitat és útil per trobar nous fàrmacs antiinflamatoris i inhibidors enzimàtics.

Aquest article està extret de Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules