FOXO regula l'expressió dels pèptids antimicrobians i promou la fagocitosi dels hemòcits a la immunitat antibacteriana de gambetes
Aug 31, 2023
Resum
Els invertebrats depenen de la immunitat innata, inclosa la immunitat humoral i cel·lular, per resistir la infecció patògena. Estudis anteriors van demostrar que el factor de transcripció O (FOXO) participa en les respostes immunes de la mucosa dels mamífers i en la regulació immune humoral intestinal dels invertebrats. Tanmateix, encara es desconeix si FOXO està implicat en la regulació de la immunitat sistèmica i cel·lular en invertebrats. En el present estudi, vam identificar un FOXO de gambes (Marsupenaeus japonicus) i vam trobar que s'expressava a nivells relativament basals en gambes normals, però es va regular significativament en gambes desafiades per Vibrio anguillarum. FOXO va tenir un paper crític en el manteniment de l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microbiota intestinal mitjançant la promoció de l'expressió de Relish, el factor de transcripció de la via de la deficiència immune (IMD) per a l'expressió de pèptids antimicrobians (AMP) a les gambes. També vam trobar que la infecció per patògens va activar FOXO i va induir la seva translocació nuclear reduint l'activitat de la serina/treonina quinasa AKT. Al nucli, FOXO activat va regular directament l'expressió dels seus gens objectiu Amp i Relish contra la infecció bacteriana. A més, es va identificar que FOXO estava implicat en la immunitat cel·lular mitjançant la promoció de la fagocitosi dels hemòcits mitjançant la regulació a l'alça de l'expressió del receptor fagocitòtic scavenger receptor C (Src) i dues petites GTPases, Rab5 i Rab7, que estan relacionades amb el tràfic de fagosoma al lisosoma. al citoplasma. En conjunt, els nostres resultats van indicar que FOXO exerceix els seus efectes sobre l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microbiota entèrica activant la via IMD en gambetes normals, promovent directament o indirectament l'expressió d'AMP i millorant la fagocitosi dels hemòcits contra patògens en gambes infectades per bacteris. Aquest estudi va revelar les diferents funcions de FOXO en la immunitat antibacteriana mucosa (local) i sistèmica dels invertebrats.
Beneficis del suplement de cistanche: com enfortir el sistema immunitari
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Introducció
Les proteïnes de la família O del factor de transcripció de la caixa de forkhead (FOXO) estan implicades en diversos processos biològics crítics dels organismes, inclosa la regulació del cicle cel·lular, la reparació de l'ADN danyat, la immunitat contra el càncer i la regulació de la vida útil [1,2]. Els mamífers tenen quatre proteïnes FOXO diferents (FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6); tanmateix, els invertebrats només tenen un FOXO, que també es coneix com Daf-16 a Caenorhabditis elegans [3]. L'activitat transcripcional de FOXO està regulada per diversos tipus de modificacions post-traduccionals, com ara la fosforilació, l'acetilació, la metilació i la ubiquitinació [4]. Aquestes modificacions afecten la translocació o sortida nuclear de FOXO del nucli, i la seva interacció amb co-repressors i coactivadors, que poden promoure o disminuir l'activitat de FOXO i mediar les seves diferents funcions biològiques [5,6]. Després de l'activació, FOXO participa en moltes funcions fisiològiques regulant la transcripció d'una varietat de gens diana [7]. Els FOXO s'activen per diversos estímuls extracel·lulars, inclosos factors de creixement, citocines i hormones [8]. Els senyals de creixement, com la insulina o el factor de creixement semblant a la insulina 1 (IGF-1), interaccionen amb els receptors de la via de la insulina i activen la senyalització de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), donant lloc a la fosforilació de FOXO per part del serina/treonina quinasa, proteïna quinasa B (AKT) [9]. El FOXO fosforilat es transloca del nucli al citosol, o impedeix la seva translocació del citosol al nucli, on s'ubiquitina, donant lloc a la seva degradació pel proteasoma [10]. Per contra, en absència de senyals de creixement externs, la via de senyalització PI3K-AKT està inactiva i FOXO no fosforilada es transloca al nucli per promoure la transcripció del gen objectiu [11]. FOXO també participa en les respostes immunes innates antibacterianes i antivirus dels invertebrats [12,13]. L'activació crònica de FOXO als intestins envellits de Drosophila reprimeix l'expressió de la proteïna de reconeixement de peptidoglicans SC2 (un regulador negatiu de la via de la deficiència immune (IMD)) i trenca l'homeòstasi immune intestinal [14]. FOXO regula directament els gens de pèptids antimicrobians (AMP) als teixits epitelials de Drosophila no infectada en resposta a l'estrès de fam, que és independent de les vies d'immunitat innata que responen als patògens [15]. Tanmateix, la infecció per patògens també pot induir l'enteròcit FOXO a entrar al nucli des del citoplasma directament als intestins de Drosophila [12]. La regulació dels AMP depenent de FOXO també es produeix en teixits epitelials de mamífers, cosa que suggereix que es conserva evolutivament en animals [16]. Diversos estudis van demostrar que els FOXO s'activen per patògens o estimulació de citocines en les respostes immunitàries de la mucosa [17]. La seva translocació al nucli i la unió als promotors dels seus gens objectiu és estimulada per la via de la proteïna activada per mitògens (MAP) quinasa i inhibida per la via PI3K/AKT. Els gens objectiu dels FOXO inclouen molècules de senyalització proinflamatòries, molècules d'adhesió i receptors de quimiocines [17]. No està clar si els FOXO estan implicats en les respostes immunes sistèmiques contra patògens. Promoure l'expressió d'AMP contra patògens és un mecanisme important de la immunitat innata humoral en invertebrats [18]. En la immunitat innata de Drosophila, les vies Toll i IMD estan implicades en la regulació de l'expressió d'AMP, i els AMP tenen un paper important en l'eliminació dels patògens invasors [19-21]. De manera similar a la immunitat dels insectes, les vies Toll, IMD i Janus cinasa (JAK) / transductor de senyal i activador de la transcripció (STAT) estan implicades en la regulació de l'expressió d'AMP en crustacis [22, 23]. Cal aclarir si FOXO pot regular l'expressió d'AMP independentment de les vies Toll, IMD i JAK/STAT contra la infecció per patògens en crustacis. A més de la immunitat humoral, els invertebrats també depenen de la immunitat cel·lular per realitzar funcions d'immunitat innata contra la infecció per patògens. La fagocitosi per hemòcits és un dels mecanismes importants per a la immunitat cel·lular contra la infecció per patògens [24]. Estudis anteriors han trobat que l'autofàgia mediada per FOXO1-és necessària per al desenvolupament de cèl·lules assassines naturals (NK) [25]. A més, FOXO està implicat en la promoció de la fagocitosi bacteriana pels neutròfils [26]. Encara que no hi ha cèl·lules immunitàries especialitzades en els crustacis, com les cèl·lules NK o els neutròfils, els hemòcits de gambes poden exercir una immunitat innata sistèmica contra la infecció per bacteris patògens mitjançant la fagocitosi [27]. Tanmateix, no està clar si FOXO participa en la fagocitosi dels patògens dels hemòcits de les gambes. L'aqüicultura de gambes és una de les indústries de més ràpid creixement del món per a la producció de proteïnes animals i ha fet una contribució important per satisfer l'augment de la demanda mundial de proteïnes animals. Actualment, la producció mundial de gambes és d'aproximadament 4,88 milions de tones amb un valor d'uns 39.000 milions de dòlars [28]. Tanmateix, la cria d'un gran nombre d'animals junts provoca un estrès animal substancial, que facilita els patògens, inclosos els bacteris i els virus, la multiplicació i les malalties clíniques, la qual cosa provoca grans pèrdues econòmiques per a la indústria [29]. Els estudis dels mecanismes immunitaris de les gambes podrien proporcionar noves estratègies per a la prevenció i el control de malalties [30]. En el present estudi, hem identificat un FOXO en gambes kuruma (Marsupenaeus japonicus). Després de l'expressió de derrocament de Foxo, després del repte de Vibrio anguillarum, vam trobar que la capacitat d'eliminació bacteriana i la taxa de supervivència de les gambes van disminuir significativament. Un estudi posterior va indicar que FOXO va promoure l'expressió d'AMP directament o indirectament i va millorar la fagocitosi dels bacteris a les gambes. Es van analitzar els possibles mecanismes dels efectes de FOXO contra la infecció per patògens a les gambes.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Resultats
FOXO s'expressa a nivells basals en gambes no desafiades i està regulada a l'alça en gambes desafiades amb V. anguillarum
A partir de la seqüenciació del transcriptoma d'hemòcits de M. japonicus, vam obtenir la seqüència d'ADNc de longitud completa de Foxo (número d'accés GenBank: MW080526). La comparació de dominis va demostrar que la proteïna FOXO prevista té un domini Forkhead (FH), que és similar als Homosapiens FOXO, inclosos FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6, i té una fosforilació AKT similar (Fig S1A). Els resultats de l'anàlisi filogenètica van mostrar que els FOXO es van dividir en dos grups, inclosos els FOXO de vertebrats i invertebrats, i que el FOXO de gambes es va agrupar a la branca d'invertebrats de l'arbre filogenètic (Fig S1B). De manera semblant als FOXO humans [31], la gambeta FOXO té llocs de modificació de la fosforilació de la cinasa regulada extracel·lular (ERK) i llocs de modificació d'acetilació de la proteïna d'unió CREB (CBP), però no té llocs de modificació de desacetilació sir tuin 1 (SIRT1) i el terminal N c-JUN. llocs de modificació de la fosforilació de la cinasa (JNK) (S2 Fig). Els anticossos policlonals que reconeixen FOXO de gambes es van preparar mitjançant el domini FH recombinant de FOXO expressat a Escherichia coli (Fig 1A). L'anàlisi de la distribució dels teixits de FOXO als nivells d'ARNm i proteïnes va revelar que s'expressava en tots els teixits provats (Fig 1B). El curs temporal de l'expressió de FOXO als hemòcits i intestins de gambes desafiats per V. anguillarum es va analitzar mitjançant qPCR i western blotting. Els resultats van mostrar que FOXO estava regulat en els hemòcits i els intestins a nivell d'ARNm (Fig 1C i 1D) i a nivell de proteïna (Fig 1E i 1F). Aquests resultats van suggerir que FOXO està implicat en la resposta a la infecció per V. anguillarum i ens van impulsar a explorar la funció de FOXO en la immunitat de les gambes.
FOXO participa en la regulació de l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microflora intestinal en gambes sanes
Per explorar la funció de FOXO en l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microflora intestinal en gambes, es va realitzar una interferència d'ARN i es va analitzar la càrrega bacteriana. Els resultats van mostrar que l'expressió de Foxo va disminuir significativament a les gambes Foxo-RNAi (Fig 2A i 2B). També es van analitzar els efectes fora de l'objectiu de Foxo RNAi detectant l'expressió d'altres gens de la família Fox (inclosos Foxk2 i Foxn3). Els resultats van mostrar que la derrota de Foxo no va disminuir els nivells d'expressió de Foxk2 o Foxn3 (Fig S3A-S3C). Utilitzant assajos d'immunocitoquímica fluorescent i western blotting, vam observar a més la distribució subcel·lular de FOXO als intestins i als hemòcits de gambes desafiats pels bacteris després del silenciament de Foxo. Els resultats van mostrar que, en comparació amb el grup dsGfp, el nivell de FOXO al nucli va disminuir significativament a la gamba Foxo-RNAi, fins i tot si la gamba estava infectada per V. anguillarum (Figs S3D–S4E'). Tots els resultats anteriors van suggerir que el nostre assaig de Foxo RNAi podria silenciar específicament Foxo en hemòcits i intestins (inclosos al citoplasma i al nucli). A continuació, es va analitzar la càrrega bacteriana a l'hemolinfa i els intestins després de la derrota de Foxo a les gambes en condicions normals (sense desafiament bacterian). Els resultats van mostrar que el nombre de bacteris a l'hemolinfa i als intestins va augmentar significativament després que l'expressió de Foxo es va eliminar amb èxit (Fig 2C i 2D). Vam analitzar encara més la taxa de supervivència de les gambes Foxo-RNAi sense desafiament bacterian, i els resultats van mostrar que la taxa de supervivència de les gambes Foxo-knockdown va disminuir significativament en comparació amb la del control (Fig 2E). Per verificar encara més aquests resultats, es va analitzar la taxa de supervivència de les gambes Foxo-RNAi tractades amb antibiòtics i els resultats van mostrar que, en comparació amb el grup dsGfp, la taxa de supervivència de les gambes lliures de gèrmens no es va reduir significativament (Fig 2F). Tots els resultats van suggerir que FOXO juga un paper en l'homeòstasi de la microbiota in vivo (incloent-hi l'hemolimfa i la microbiota entèrica) de les gambes en condicions normals.
Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat
FOXO participa en la regulació de l'hemolinfa i l'homeòstasi de la microflora intestinal promovent l'expressió de Relish i Amp en gambes sanes
Estudis anteriors demostren que les gambes sanes contenen un nombre baix però estable de bacteris a l'hemolinfa circulant, i quantitats elevades, encara que constants, de bacteris al tracte gastrointestinal, i els efectors immunològics, com els pèptids antimicrobians (AMP) regulats pel factor nuclear kappa B (NF). -κB) i les espècies reactives de l'oxigen (ROS) regulades per la via de l'oxidasa dual (DUOX), tenen un paper essencial en l'hemolimfa de l'homeòstasi i la microbiota intestinal [32-34]. Per explorar el mecanisme de la implicació de FOXO en la regulació de l'hemolinfa i l'homeòstasi de la microflora intestinal en condicions normals, primer vam detectar la distribució subcel·lular de FOXO en hemòcits i intestins en condicions normals. Els resultats van mostrar un senyal feble de FOXO als nuclis dels hemòcits de gambes i les cèl·lules intestinals en condicions normals (Fig 3A i 3B), cosa que suggereix que una mica de FOXO va ser activat per la microbiota in vivo de les gambes en condicions normals. L'expressió d'AMP està regulada per la via IMD als intestins de Drosophila [35]. Per tant, vam suposar que el factor de transcripció Relish podria ser un gen objectiu de FOXO. Vam detectar l'expressió d'ARNm de Relish, el factor de transcripció de la via IMD, en hemòcits i intestins de gambes després de la derrota de Foxo. Els resultats van mostrar que l'expressió de Relish va disminuir significativament a les gambes Foxo-knockdown (Fig 3C i 3D) i es van obtenir resultats similars a nivell de proteïnes (Fig 3E i 3E'). Els resultats van suggerir que FOXO podria promoure l'expressió de Relish i activar la via IMD. Per confirmar que FOXO participa en l'hemolimfa i l'homeòstasi del tracte gastrointestinal mitjançant la senyalització IMD, es van obtenir gambes lliures de gèrmens (Fig 3F) i es va detectar l'activació de RELISH i l'expressió AMP. En comparació amb el control, la quantitat de FOXO i RELISH als nuclis de cèl·lules intestinals i hemòcits va disminuir significativament (Fig 3G i 3H). Mentrestant, es va examinar al germen l'expressió d'AMP, incloent Crustins (CrusI-2 a 5) i factors antilipopolisacàrids (Alf A1, B1, C1, D1 i E1), possiblement regulats per FOXO i/o RELISH. gambes lliures, i els resultats van mostrar que l'expressió de CrusI -3, Alf-B1 i Alf-C1 va disminuir significativament als hemocits i intestins de les gambes (Fig 3I i 3J). Atès que l'expressió d'Alf-B1 i Alf C1 estava regulada per la via IMD [36], aquests resultats van suggerir que FOXO participa en la regulació de l'homeòstasi de l'hemolinfa i el tracte gastrointestinal en condicions normals a través de la via IMD per promoure l'expressió de AMPs.
Fig 1. FOXO va ser regulat a l'alça en gambes desafiades per V. anguillarum. (A) Expressió recombinant del domini FH de FOXO a E. coli i western blotting per detectar FOXO mitjançant anticossos policlonals contra FOXO preparats en conills. Carril 1, les proteïnes totals d'E. coli amb Foxo-pGEX4T-1. Carril 2, les proteïnes totals dels bacteris després de la inducció d'IPTG. Carril 3, FOXO recombinant purificat. El carril 4, FOXO als intestins de gambes no tractades es va detectar mitjançant western blotting. M, Marcadors de massa molecular de proteïnes. (B) La distribució de teixits de Foxo als nivells d'ARNm (panel superior) i proteïnes (panel inferior) es va detectar mitjançant RT-PCR i western blot, respectivament. ACTB és l'abreviatura de -actina. (C, D) Els patrons d'expressió d'ARNm de Foxo en hemòcits (C) i intestins (D) es van analitzar mitjançant qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef-1 com a gens de control endògens. (E, F) Els patrons d'expressió de proteïnes de FOXO en hemòcits (E) i intestins (F) es van detectar mitjançant western blotting. Els resultats de l'anàlisi estadística de tres rèpliques es van mostrar als panells inferiors. Les bandes del western blot es van digitalitzar mitjançant el programari ImageJ escanejant les bandes a partir de tres repeticions independents. Els nivells d'expressió relatius de FOXO/-actina es van expressar com a mitjana ± SD i el valor de la gambeta de control es va establir com a un. Les barres d'error de la figura indiquen SD (tres rèpliques).
FOXO s'activa a les gambes pel desafiament de V. anguillarum i participa en l'eliminació de patògens de l'hemolinfa i els intestins.
S'informa que FOXO es pot activar per estimulació bacteriana o de citocines i es trasllada al nucli per regular l'expressió de certs gens diana en mamífers [17]. Per detectar si FOXO es va activar en gambes desafiades per bacteris, es va analitzar la distribució subcel·lular de FOXO als intestins de les gambes mitjançant western blotting. Els resultats van mostrar que la quantitat de FOXO al citoplasma de les cèl·lules intestinals va disminuir gradualment de 2 a 4 h després del repte de V. anguillarum (Fig 4A). En canvi, la quantitat de FOXO al nucli de les cèl·lules intestinals va augmentar significativament després de la infecció per V. anguillarum (Fig 4B). Per analitzar el paper de FOXO en la immunitat sistèmica, es va utilitzar un assaig immunocitoquímic fluorescent per observar la translocació nuclear de FOXO en hemòcits de gambes 2 h post V. estimulació anual de larum. Vam trobar que la translocació de FOXO induïda pel repte bacterian al nucli va augmentar significativament, però no hi va haver cap canvi evident en les gambes desafiades amb PBS (Fig 4C i 4C'). Per explorar si el FOXO translocat nuclear està implicat en l'eliminació de patògens, es va analitzar la càrrega bacteriana a l'hemolinfa i els intestins a les gambes Foxo-knockdown a les 6 h després del repte bacterià. Vam trobar que després de la derrota de Foxo, la càrrega de bacteris a l'hemolinfa i els intestins va augmentar significativament en comparació amb la dels grups de control (Fig 4D). A més, la taxa de supervivència de les gambes Foxo-knockdown infectades amb V. anguillarum va disminuir significativament en comparació amb la del control (Fig 4E). Aquests resultats van indicar que FOXO es va activar en cèl·lules enteriques i hemòcits, i van suggerir que FOXO participa en respostes immunitàries locals i sistèmiques contra la infecció bacteriana.
Fig 2. FOXO participa en les respostes immunes antibacterianes intestinals (locals) i sistèmiques. (A, B) Eficiència de Foxo-RNAi en hemòcits (A) i intestins (B) de gambes, tal com es determina mitjançant qPCR (A) i western blotting (B). L'anàlisi de la data qPCR utilitzant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef-1 com a gens de control endògens. Les barres d'error mostren SD. (C) Detecció de bacteris hemolimfàtics de gambes Foxo-knockdown mitjançant cultiu sòlid de LB (tres repeticions); Es va utilitzar la injecció dsGfp com a control. La relació de dilució era 1:10. (D). El nombre de bacteris de l'hemolinfa i els intestins a les gambes derrocadores de Foxo i les gambes amb injecció dsGfp sense desafiament bacterian. (E). La taxa de supervivència de les gambes Foxo-RNAi sense desafiament bacterian. Es va utilitzar la injecció dsGfp com a control. (F). La taxa de supervivència de les gambes Foxo-RNAi tractades amb antibiòtics. La injecció dsGfp es va utilitzar com a control. Normal: gambes de tipus salvatge no tractades amb antibiòtics.
Fig 3. Una quantitat basal de FOXO es transloca als nuclis dels hemòcits i les cèl·lules intestinals afavoreix l'expressió de Relish i, posteriorment, activa la via IMD per regular l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microbiota intestinal en condicions normals. (A) Es va utilitzar la immunocitoquímica per detectar la distribució subcel·lular de FOXO als hemòcits de gambes normals. Barra d'escala=20 μm. Cy: Citoplasma; Nu: Nucli. (B) Es va utilitzar Western blotting per detectar la distribució subcel·lular de FOXO a les cèl·lules intestinals de gambes normals i gambes infectades amb V. anguillarum. ( C ) L'expressió de Relish a nivell d'ARNm es va detectar en hemòcits de gambes després de la derrota de Foxo per qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef -1 com a gens de control endògens. (D) L'expressió de Relish a nivell d'ARNm als intestins de les gambes després de la derrota de Foxo es va detectar mitjançant qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef -1 com a gens de control endògens. (E) El nivell de RELISH es va detectar mitjançant western blotting en gambes després de la derrota de Foxo. (E') Es van digitalitzar tres rèpliques del panell E mitjançant el programari ImageJ. (F) La càrrega bacteriana de l'hemolinfa i els intestins a les gambes 24 h després del tractament amb antibiòtics. (G) Es va detectar FOXO al nucli mitjançant western blotting en hemòcits i intestins de gambes 24 hores després del tractament amb antibiòtics. (H) Es va detectar RELISH al nucli mitjançant western blotting en hemòcits i intestins de gambes a les 24 hores posteriors al tractament amb antibiòtics. (I, J) L'expressió d'Amps en hemòcits (I) i intestins (J) de gambes lliures de gèrmens es va determinar mitjançant qPCR utilitzant -actina i Ef-1 com a gens de referència interns. Es van utilitzar gambes normals (injecció d'H2O) com a control.
Estudis anteriors van indicar que l'activitat transcripcional de FOXO està regulada per la modificació de la fosforilació i que la serina/treonina quinasa AKT regula l'activitat dels factors de transcripció de Forkhead fosforilant-los i inhibint la seva translocació poc clara [9,37]. Per investigar si l'augment de FOXO al nucli després de la infecció per bacteris patògens es veu afectat per AKT, primer vam detectar el contingut de FOXO al citoplasma i al nucli mitjançant western blotting després de la derrota de Akt de gambes. Els resultats van mostrar que la quantitat de FOXO al nucli dels hemòcits i les cèl·lules intestinals va augmentar significativament després de la derrota de l'expressió Akt (Fig 5A i 5B) a les gambes 2 h després de la infecció amb V. anguillarum (Fig 5C i 5C'). Per verificar els resultats experimentals, també hem utilitzat un assaig d'immunocitoquímica per observar la distribució subcel·lular de FOXO als hemòcits de gambes després de la derrota d'Akt. Els resultats van mostrar que FOXO va augmentar significativament al nucli dels hemòcits quan Akt ha enderrocat 2 h després de la infecció amb V. anguillarum (Fig 5D i 5D'). Per explorar si la infecció per patògens afecta l'activitat AKT, vam detectar el canvi de fosforilació d'AKT després de la infecció per patogens mitjançant un anticòs p-AKT humà (Ser473) (el lloc de fosforilació de l'AKT de gambes és Ser486) i vam trobar que el nivell d'AKT fosforilat va disminuir significativament en hemòcits i intestins de gambes després de 30 min d'infecció per V. anguillarum (Fig 5E i 5F). Aquests resultats van suggerir que la infecció per patògens pot reduir el nivell de l'AKT fosforilat, que inhibeix l'activitat enzimàtica i disminueix la capacitat de l'AKT per fosforilar FOXO. El FOXO no fosforilat entra al nucli i indueix l'expressió dels seus gens diana. la figura indica SD.
extracte de cistanche
La infecció per patògens disminueix l'activitat de l'AKT i indueix la translocació nuclear de FOXO
FOXO exerceix una defensa immune contra els bacteris invasors mitjançant la regulació de l'expressió de pèptids antimicrobians en gambes infectades per bacteris
Per explorar el mecanisme pel qual FOXO afecta la resposta contra la infecció bacteriana a les gambes, primer vam identificar els gens efectors immunitaris regulats per FOXO. Després de l'èxit de la derrota de Foxo en hemòcits i intestins de gambes amb o sense desafiament de V. anguillarum, els nivells d'expressió de CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 i Alf-E1 van disminuir significativament en les gambes silenciades en comparació. amb els del grup control (Fig 6A i 6B). Per verificar encara més els resultats, també vam detectar l'expressió de quatre AMP després de la derrota d'Akt. Els resultats van mostrar que l'expressió dels quatre AMP va augmentar significativament 6 h després de la infecció per V. anguil larum en comparació amb la del grup control (Fig 6C i 6D). En comparació amb els AMP regulats a l'alça (inclosos Alf-B1 i Alf-C1) en condicions normals (Fig 3I i 3J), el gen addicional d'AMP (CrusI-3, Alf-E1) també es va regular a l'alça a les gambes infectades per V. anguillarum (Figs 6A i 6B). El nostre estudi anterior va indicar que RELISH va promoure l'expressió d'Alf-B1 i Alf-C1 a les gambes [36]. Aquests resultats indiquen que FOXO podria regular directament l'expressió d'AMP, com ara CrusI-3 i Alf-E1, independentment de la via de senyalització IMD. Per confirmar la hipòtesi, es va realitzar un assaig ChIP per detectar si FOXO es podia unir al promotor d'Alf-E1. Es va obtenir la seqüència promotora d'Alf-E1 (Fig S4) i es va predir els llocs d'unió de FOXO (Fig 6E). El resultat de ChIP va mostrar que FOXO podria unir-se al promotor Alf-E1 (Fig 6F). Aquests resultats van suggerir que FOXO també participa en la immunitat antibacteriana regulant directament l'expressió d'AMP a les gambes.
Fig 4. FOXO translocat al nucli en gambes desafiades per V. anguillarum. (A, B) Els patrons de distribució de FOXO al citoplasma (A) i al nucli (B) de les cèl·lules intestinals de gambes desafiades per bacteris, tal com s'han analitzat mitjançant western blotting (panells inferiors d'A i B). Les bandes de western blotting es van digitalitzar mitjançant el programari ImageJ escanejant les bandes a partir de tres repeticions. Els nivells d'expressió relatius de FOXO/-actina o FOXO/Histone 3 es van expressar com a mitjana ± SD, i el valor de la gambeta de control es va establir com a un. ( C ) La translocació nuclear de FOXO en hemòcits de gambes 2 h post-V. anguillarum es va detectar mitjançant assaigs immunocitoquímics fluorescents. La injecció de PBS es va utilitzar com a control. Barra d'escala=20 μm. (C') Anàlisi estadística del panell C La colocalització dels nuclis tenyits de FOXO i DAPI als hemòcits es va analitzar mitjançant el programari WCIF ImageJ. (D) El nombre de bacteris a l'hemolinfa i els intestins de la gamba Foxo-knockdown va seguir la injecció de V. anguillarum; La injecció dsGfp en gambes després de la injecció bacteriana es va utilitzar com a control. (E) La taxa de supervivència de gambes Foxo-RNAi infectades per V. anguillarum. Es va utilitzar la injecció dsGfp com a control.
FOXO promou la fagocitosi dels hemòcits contra els bacteris mitjançant la promoció de l'expressió SRC
Estudis anteriors han informat que FOXO interactua directament amb les regions promotores de CXCR2 i CD11b per regular la fagocitosi dels neutròfils en mamífers [26]. Per provar si FOXO s'associa amb la fagocitosi dels hemòcits en la immunitat antibacteriana de gambetes, vam examinar la taxa de fagocitat després d'interferències amb Foxo mitjançant diferents mètodes. Després de la derrota de Foxo, la taxa fagocítica i l'índex fagocític del grup Foxo-knockdown van ser significativament inferiors als del grup control (dsGfp) (Fig 7A i 7A'). També hem utilitzat citometria de flux per quantificar la taxa fagocítica dels hemòcits després del silenciament de Foxo. Els resultats van mostrar que la taxa de citosi del fag del grup Foxo-RNAi també va disminuir significativament en comparació amb la del grup dsGfp (Fig 7B i 7B'). Per validar encara més aquests resultats, també vam examinar la taxa de fagocitat després de la derrota d'Akt. Els resultats van mostrar que, en comparació amb els del grup control, la taxa fagocítica i l'índex fagocític van augmentar significativament (Fig 7C i 7C'). Aquests resultats van suggerir que FOXO afavoreix la fagocitosi dels hemòcits a les gambes. Per explorar com FOXO millora la fagocitosi dels hemòcits a les gambes, vam detectar l'expressió de gens anteriorment informats implicats en la fagocitosi de les gambes. S'ha informat que els receptors de classe B (SRB) i la classe C (SRC) estan implicats en la fagocitosi dels hemòcits [38,39]. Vam trobar que el nivell d'expressió d'ARNm de Src, en lloc de Srb, va disminuir significativament després de silenciar Foxo als hemòcits i intestins (Fig 7D i 7E), mentre que l'expressió de Src va augmentar significativament després de la derrota d'Akt a les gambes (Fig 7F). Es van obtenir resultats similars a nivell de proteïnes (Fig 7G i 7G'). Aquests resultats van suggerir que FOXO promou la fagocitosi dels hemòcits dels patògens a les gambes mitjançant la promoció de l'expressió SRC.
FOXO promou l'expressió de RAB5 i RAB7 durant la fagocitosi en gambes
Estudis anteriors han demostrat que les petites GTPases, RAB5 i RAB7, són els reguladors clau del transport de vesícules recentment endocitades a endosomes precoç i tardà [40]. RAB5 és un regulador clau dels esdeveniments de fusió inicial i és un marcador dels primers endosomes [41,42]. RAB7 és necessari per a la fusió fagosoma-lisosoma tardana i és un marcador d'endosomes tardà [43]. Per explorar si RAB5 i RAB7 estan implicats en l'eliminació de patògens a les gambes, primer vam analitzar els patrons d'expressió de Rab5 i Rab7 i vam trobar que les dues petites GTPases estaven regulades a les gambes desafiades amb bacteris (Fig S5A-S5D). Vam analitzar més la taxa de supervivència de les gambes Rab5-RNAi i Rab7-RNAi després del desafiament bacterian, i els resultats van mostrar que la taxa de supervivència de les gambes derrocadores Rab5 i Rab7 va disminuir significativament en comparació amb la del control ( S5E i S5F Fig). Aquests resultats van suggerir que RAB5 i RAB7 tenen funcions importants en la resistència als patògens bacterians. Per explorar si RAB5 i RAB7 estan implicats en la fagocitosi mediada per FOXO, vam examinar els nivells d'expressió d'ARNm de Rab5 i Rab7 després de la interferència amb l'expressió de Foxo a les gambes. Els resultats van mostrar que els nivells d'expressió de Rab5 i Rab7 van disminuir significativament als hemòcits i els intestins (Figs 8A i S6A). mentre que l'expressió de Rab5 i Rab7 va augmentar significativament després de la derrota d'Akt a les gambes (figura 8B). Per confirmar encara més els resultats anteriors, també es van detectar els nivells de proteïnes de RAB5 i RAB7 a les gambes derrocadores Foxo o Akt. En comparació amb el grup d'injecció dsGfp, els nivells de RAB5 i RAB7 també van disminuir significativament en els hemòcits i els intestins de les gambes Foxo-knockdown, però van augmentar significativament en les gambes Akt-knockdown a les 2 h després de l'estimulació per V. anguillarum (Figs 8C–8D'; S6B). i S6B'). Aquests resultats van suggerir que RAB5 i RAB7 participen en la citosi del fag dels hemòcits de gambes mediada per FOXO. També vam detectar que RAB5 i RAB7 estaven co-localitzats amb V. anguillarum en hemòcits de gambes (Fig 9). En conjunt, els resultats van suggerir que RAB5 i RAB7 estan implicats en la fagocitosi mediada per FOXO a les gambes.
Fig 5. La infecció per patògens va disminuir l'activitat de l'AKT, que va promoure la translocació nuclear de FOXO en hemòcits i cèl·lules entèriques de gambes. (A, B) Eficiència d'Akt-RNAi als hemòcits i intestins de gambes, tal com es determina mitjançant qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef -1 com a gens de control endògens (A) i western blotting (B). (C) La quantitat de FOXO al citoplasma i al nucli dels intestins de les gambes Akt-knockdown es va analitzar mitjançant western blotting. dsGfp es va utilitzar com a control. (C') L'anàlisi estadística del panell (C). El programari ImageJ es va utilitzar per digitalitzar les bandes escanejant imatges de tres repeticions. ( D ) La translocació nuclear de FOXO en hemòcits de gambes Akt-knockdown es va detectar 2 h després del repte de V. anguillarum mitjançant un assaig immunocitoquímic fluorescent. dsGfp es va utilitzar com a control. Barra d'escala=20 μm. (D') Anàlisi estadística de (D). El programari WCIF ImageJ es va utilitzar per analitzar la co-localització per la relació d'intensitat de fluorescència del nucli anti-FOXO (verd) i tenyit de DAPI (blau) als hemòcits després de fixar el valor d'exposició. (E, F) Canvi de contingut d'AKT fosforilat (p-AKT) en hemòcits (E) i intestins (F) de gambes desafiades per V. anguillarum. Els panells inferiors són figures digitalitzades de (E) i (F) basades en bandes de western blotting i anàlisi estadística, respectivament.
Té de Cistanche
Discussió
FOXO, com a factor de transcripció molt important, participa en moltes funcions fisiològiques i metabòliques [44,45]. En el present estudi, hem identificat un FOXO de gambes (M. japonicus) i hem trobat que participa en la regulació de l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microbiota entèrica regulant l'expressió d'AMP en condicions normals. FOXO es pot activar per infecció bacteriana a les gambes i traslladar-se al nucli, on regula directament i indirectament (per la via IMD) l'expressió dels AMP. FOXO va regular l'expressió de gens relacionats amb la fagocitosi, com ara SRC i petites GTPases, RAB5 i RAB7, per promoure la fagocitosi dels hemòcits contra patògens. Per tant, la gambeta FOXO té diferents papers en les respostes immunes sistèmiques i locals (enteriques) contra patògens (Fig 10). En comparació amb els FOXO humans, el FOXO de gambes té una seqüència d'aminoàcids relativament conservada i llocs de fosforilació AKT; tanmateix, el segon lloc de fosforilació AKT de la gamba FOXO és la treonina en lloc de la serina. La fosforilació AKT de FOXO controla el transport nuclear i citoplasmàtic de FOXO [9]. En aquest estudi, hem trobat que l'AKT està relacionada amb el control de l'entrada nuclear de FOXO. Després de la infecció per V. anguillarum, el nivell d'AKT fosforilat es va reduir significativament, la qual cosa va indicar que l'activitat de l'AKT es va reduir en les gambes infectades amb patògens, augmentant així la retenció nuclear o la translocació nuclear de FOXO i, posteriorment, induint l'expressió de gens diana. com Relish i Amp, per resistir la infecció per patògens. Estudis anteriors han trobat que FOXO participa en l'homeòstasi de la microflora intestinal de Drosophila reprimint l'expressió de la proteïna de reconeixement de peptidoglicans SC2 (el regulador negatiu de la via IMD) per activar la via per a l'expressió d'AMP [14]. RELISH es va informar com un gen objectiu clau de FOXO en el control de la tolerància a la hipòxia a Drosophila [46]. Com altres animals, el tracte gastrointestinal de les gambes conté una microbiota relativament alta i constant. L'evidència creixent també revela que l'hemolimfa d'alguns invertebrats aquàtics sans, incloses les gambes, també alberga quantitats estables de bacteris [47]. El nostre estudi anterior va trobar que una lectina de tipus C participa en la regulació de l'homeòstasi de la microbiota hemolinfa mantenint l'expressió d'AMPs [34], però no sabem quines vies de senyal estan implicades en la regulació de l'expressió d'AMP. Aquí, els nostres resultats van suggerir que FOXO està implicat en la regulació de l'hemolimfa i l'homeòstasi de la microflora entèrica mitjançant la senyalització IMD en condicions normals. En gambes no infectades, la derrota de Foxo va provocar una reducció significativa de l'expressió de Relish i la taxa de supervivència de les gambes va disminuir significativament, fins i tot sense infecció bacteriana. També vam trobar una petita quantitat de FOXO al nucli de les cèl·lules normals de gambes. Per tant, pensem que FOXO participa en la regulació de l'homeòstasi de l'hemolinfa i la flora entèrica en condicions normals promovent l'expressió de Relish i, posteriorment, millorant l'expressió d'AMP per la via IMD. Aquests resultats suggereixen que FOXO participa en la immunitat local i sistèmica per promoure l'homeòstasi de la microbiota de l'hemolinfa i el tracte gastrointestinal de les gambes. La immunitat humoral té un paper crític en la resistència a la infecció per patògens a taxes inverses mitjançant la producció d'una bateria d'AMPs [21,48]. La resposta humoral comprèn la síntesi i la secreció inducibles d'AMP, que s'alliberen a l'hemolinfa com a resposta sistèmica, o s'alliberen a la superfície epidèrmica o a la cavitat del tracte gastrointestinal com a resposta local [19]. L'expressió d'AMP està regulada principalment per les vies de senyalització Toll/Dif i IMD/Relish a les mosques de la fruita [49]. Actualment, s'han identificat diverses famílies d'AMP a les gambes, incloses les crustines, els factors anti-lipopolisacàrids (Alfs) i les peneidines [50]. El present estudi va demostrar que FOXO pot regular directament o indirectament (mitjançant la senyalització IMD/Relish) l'expressió d'AMP, inclosos CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 i Alf-E1. Vam pensar que una baixa activació de FOXO als hemòcits i intestins de les gambes en condicions normals podria regular el gen objectiu clau de Foxo, és a dir, Relish, per mantenir l'homeòstasi de la microbiota in vivo. Durant la infecció, els patògens invasors activen FOXO, la majoria del qual es trasllada al nucli, on regula més gens diana, inclosos alguns AMP, com Alf-E1 i CrusI-3, a més de Relish. En conjunt, FOXO participa en la regulació de l'hemolinfa i l'homeòstasi de la microbiota intestinal en gambes sanes mitjançant l'activació a nivell basal de la senyalització IMD a l'hemolinfa i el tracte gastrointestinal. La infecció per patògens activa FOXO disminuint l'activitat AKT i promou l'expressió d'AMPs directa i indirectament en la immunitat sistèmica i la immunitat local (intestinal). La fagocitosi és un fenomen mediat pel receptor, depenent de l'actina i de l'ATP, que es desencadena per la unió de partícules o patògens a receptors específics de la citomembrana i representa un procés immunitari important mitjançant el qual l'hoste pot protegir-se dels patògens [24]. Les petites GTPases, com RAB5 i RAB7, estan implicades en la remodelació continuada de la membrana i en el trànsit de vesícules en la fagocitosi. El nostre estudi anterior va informar que els receptors carronyaires SRB i SRC estan implicats en la fagocitosi dels hemòcits com a receptors de les gambes [38,39]. En el present estudi, vam trobar que després de la derrota de Foxo, l'expressió de Src va disminuir notablement i la taxa de fagocitosi dels hemòcits va disminuir significativament, cosa que suggereix que Src és un gen objectiu de FOXO i que FOXO està implicat en la fagocitosi de bacteris patògens mediada per SRC. FOXO també podria promoure l'expressió de dues petites GTPases, RAB5 i RAB7. Aquestes petites GTPases estan implicades en el transport seqüencial i són els determinants clau dels fagosomes primerencs i tardans [51]. Els fagosomes migren des de la perifèria de la cèl·lula a la regió intracel·lular, amb RAB5 substituït per RAB7 durant el transport, i els béns finals es transporten al lisosoma per a la seva degradació [52,53]. També vam trobar que RAB5 i RAB7 es podien co-localitzar amb els patògens dels hemòcits, cosa que indicava que els patògens eren fagocitats pels hemòcits de les gambes passant per fagosomes primerencs i tardans abans de ser finalment degradats als lisosomes. Per tant, FOXO està implicat en la resposta immune cel·lular promovent la fagocitosi dels hemòcits. En conclusió, els nostres resultats indiquen que FOXO no només participa en la regulació de l'homeòstasi de la microbiota en condicions normals, sinó també en l'eliminació de bacteris patògens en gambes infectades mitjançant la promoció de l'expressió d'AMP i la fagocitosi dels hemòcits.
Fig 6. FOXO realitza els seus papers antibacterians en les gambes regulant l'expressió dels AMP. (A, B) L'expressió d'Amps en hemòcits (A) i intestins (B) de gambes Foxo-knockdown, tal com es determina per qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef{3} com a gens de control endògens; Es va utilitzar la injecció de dsGfp en gambes com a control. Les dades es van analitzar estadísticament mitjançant la prova U de Mann-Whiteny. (C, D) L'expressió d'Amps en hemòcits (C) i intestins (D) de gambes derrocament Akt es va analitzar mitjançant qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef -1 com a gens de control endògens; Es va utilitzar la injecció de dsGfp en gambes com a control. Les diferències significatives es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional. (E) Diagrama esquemàtic dels llocs d'unió predits de FOXO al promotor Alf-E1. (F) Es van utilitzar ChIP i RT-PCR per detectar la unió de FOXO a la seqüència del promotor Alf-E1 mitjançant primers (Alf-E1-F i Alf-E1-R, taula 1). La RT-PCR també es va utilitzar per amplificar la regió de codificació d'Alf-E1 amb cebadors RT-PCR (Alf-E1-RT-F i Alf-E{1-RT-R. Taula 1) mitjançant el ChIP ADN obtingut com a plantilla. Es va utilitzar anticossos IgG com a control i es va utilitzar el fragment amplificat d'ADN genòmic normal per confirmar la banda objectiu.
Fig 7. FOXO millora la fagocitosi dels hemòcits dels patògens de les gambes afavorint l'expressió SRC. (A) Fagocitosi d'hemòcits de V. anguillarum observada mitjançant un assaig immunocitoquímic fluorescent sota un microscopi de fluorescència. V. anguillarum es va marcar amb FITC (verd) i els nuclis cel·lulars es van tenyir amb DAPI (blau). La fletxa vermella indica els hemòcits fagocítics. Barra d'escala=20 μm. (A') Anàlisi estadística de la taxa fagocítica i l'índex fagocític en gambes Foxo-knockdown. El grup d'injecció dsGfp es va utilitzar com a control. Es van comptar cinc-cents hemòcits al microscopi de fluorescència en cada experiment. Les dades es van analitzar estadísticament mitjançant la prova t de Student. (B) Fagocitosi bacteriana per hemòcits analitzada mitjançant citometria de flux. Els hemòcits fagocitats que contenien bacteris (R2) es van separar dels hemòcits no fagocitats (R3) basant-se en un senyal de fluorescència de bacteris marcats en hemòcits mitjançant el programari IDEAS Application v6.0. (B') La velocitat fagocítica dels hemòcits basada en les dades de citometria de flux. Es van comptar tres mil hemòcits per a cada anàlisi i es van realitzar tres repeticions. El grup dsGfp es va utilitzar com a control. (C) Fagocitosi d'hemòcits de V. anguillarum en gambes derrocament Akt observar sota el microscopi de fluorescència. Barra d'escala=10 μm. (C') Anàlisi estadística de la taxa fagocítica i l'índex fagocític a partir de les dades del panell (C). (D) El nivell d'expressió d'ARNm de Srb i Src en hemòcits de gambes derrocament de Foxo analitzat per qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef-1 com a gens de control endògens. Es va utilitzar la injecció dsGfp com a control. (E) L'expressió d'ARNm de Srb i Src als intestins de gambes Foxo-RNAi analitzada per qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef-1 com a gens de control endògens. (F) L'expressió d'ARNm de Src en hemòcits de gambes Akt-RNAi analitzada per qPCR mitjançant l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef-1 com a gens de control endògens. (G) El nivell de proteïna de SRC en hemòcits de gambes Foxo-RNAi o Akt-RNAi, tal com s'ha analitzat mitjançant western blotting. Injecció dsGfp utilitzada com a control. (G') L'anàlisi estadística basada en dades de tres rèpliques de panell (G).
Materials i mètodes
Declaració ètica
Tots els experiments amb animals es van realitzar d'acord amb les directives nacionals de la Xina (GB 14922.2–2011 i GB 14925–2010). Els experiments de conill per a la preparació d'anticossos de l'estudi es van dur a terme d'acord amb els protocols aprovats pel Comitè de Cura i Benestar dels Animals de l'Escola de Ciències de la Vida de la Universitat de Shandong (SYDWLL-2021-54). L'aprovació segons la normativa sobre l'ús de gambes en el nostre estudi no va ser necessària perquè la nostra investigació va utilitzar un nombre limitat de gambes comuns consumides freqüentment per la comunitat en general.
Els animals
Es van obtenir gambes saludables (Marsupenaeus japonicus), amb un pes d'uns 6-10 g cadascuna, del mercat de productes aquàtics de Qingdao, província de Shandong, Xina. Abans de l'experiment, les gambes es van cultivar durant almenys 1 dia al sistema de cultiu de gambes amb aigua de mar airejada a 23-25 °C per aclimatar-se al nou entorn.
Fig 8. RAB5 i RAB7 estan implicats en la fagocitosi mediada per FOXO dels hemòcits de les gambes. (A, B) qPCR es va utilitzar per analitzar els nivells d'expressió d'ARNm de Rab5 i Rab7 en els hemòcits de gambes Foxo-knockdown (A) i Akt-knockdown gamba (B) amb i sense infecció bacteriana. La qPCR va utilitzar l'expressió mitjana geomètrica de -actina i Ef-1 com a gens de control endògens. ( C ) Els nivells de proteïnes de RAB5 i RAB7 en hemòcits de gambes Foxo-knockdown a 2 h després del repte de V. anguillarum determinats mitjançant western blotting. (C') L'anàlisi estadística basada en dades de tres rèpliques del panell (C). ( D ) Els nivells de proteïnes de RAB5 i RAB7 en hemòcits de gambetes Akt-knockdown a 2 h després del repte de V. anguillarum determinats mitjançant western blotting. (D') L'anàlisi estadística basada en dades de tres rèpliques del panell (D).
Anàlisi bioinformàtica
La seqüència d'ADNc de longitud completa de Foxo es va obtenir a partir de la seqüenciació d'hemòcits i transcripció intestinal de M. japonicus (BGI, Shenzhen, Xina). El marc de lectura obert (ORF) de Foxo es va amplificar mitjançant un parell de primers (Foxo-EX-F i Foxo-EX-R; Taula 1) per a la confirmació de la seqüència. L'ADNc corresponent es va traduir conceptualment per obtenir la seqüència de proteïnes deduïda mitjançant l'eina ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). L'anàlisi de similitud es va realitzar mitjançant BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), i la predicció de l'arquitectura del domini es va realitzar mitjançant SMART (http://smart.emblheidelberg.de). Es va construir un arbre filogenètic de FOXOs de diferents espècies mitjançant el programa MEGA 6.0 [54].
Fig 9. RAB5 i RAB7 co-localitzen amb V. anguillarum. La co-localització de RAB5 i RAB7 amb FITC etiquetat-V. anguillarum en hemòcits de gambes, analitzat mitjançant un assaig immunocitoquímic fluorescent. Els bacteris es van etiquetar amb FITC (verd) i es van injectar a les gambes. Els hemòcits es van recollir de cinc gambes als 30 min i 1 h després de la injecció bacteriana i es van incubar amb anticossos anti-RAB5 o anti RAB7. L'anticòs secundari era IgG anticonill Alexa-546 (vermell). Els nuclis es van tacar amb DAPI (blau). La co-localització als hemòcits s'indica amb fletxes blanques. Barra d'escala=10 μm.
Fig 10. Representació esquemàtica de la implicació de FOXO en la immunitat innata local i sistèmica en gambes. (A) En condicions no infectades, FOXO manté l'homeòstasi de l'hemolinfa i la microbiota intestinal mitjançant la promoció de Relish i, posteriorment, l'expressió d'AMP. (B) En condicions infectades, la fosforilació AKT es redueix per la infecció per patògens, donant lloc a un augment del contingut de FOXO al nucli. FOXO promou directament l'expressió de Relish i AMPs per eliminar patògens invasius; d'altra banda, FOXO promou la fagocitosi dels patògens mitjançant la via de fagocitosi mediada per SRC.
Repte bacterià i recollida de mostres
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) obtingut del Marine College de la Universitat de Shandong (Wei hai, Xina) i ara es conserva al nostre laboratori. V. anguillarum es va cultivar durant la nit a 37 °C en medi LB i es va tornar a cultivar durant 4 hores a la inoculació 1:100 el segon dia. Els bacteris en fase de creixement logarítmic es van recollir per centrifugació a 5000 × g durant 5 min a 4˚C i es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS: Na2HPO4 10 mM, NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM i KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4). V. anguillarum resuspès en solució salina tamponada amb fosfat per al repte de gambes. Es van injectar aproximadament 2 × 107 unitats formadores de colònies (CFU)/gamba a l'abdomen de cada gambeta mitjançant una microxeringa. El grup control es va injectar amb el mateix volum de PBS. Els hemòcits, el cor, l'hepatopàncrees, les brànquies, l'estómac i els intestins es van recollir d'almenys tres gambes per a l'extracció d'ARN i proteïnes. Per a la recollida d'hemòcits, l'hemolimfa es va extreure del si ventral mitjançant una xeringa precarregada amb 0, 8 ml de tampó anticoagulant (10% citrat de sodi) i després es va centrifugar ràpidament a 700 × g durant 8 min a 4 ° C per aïllar els hemòcits.
Extracció d'ARN i proteïnes, i síntesi d'ADNc
L'ARN total es va extreure dels hemòcits i diferents òrgans de gambes mitjançant el TRIzol (ET101, Transgen, Beijing, Xina). Les proteïnes dels diferents òrgans es van extreure mitjançant l'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) Lysis Buffer (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Xina). La síntesi d'ADNc de la primera cadena es va realitzar mitjançant un kit de síntesi d'ADNc (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canadà), seguint les instruccions del fabricant.
Taula 1. Seqüències d'encebadors utilitzats en aquest estudi.
MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canadà), seguint les instruccions del fabricant.
Expressió recombinant i preparació d'anticossos
La seqüència d'ADNc de Foxo es va amplificar mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT-PCR) mitjançant els primers Foxo-EX-F i Foxo-EX-R (taula 1). Els productes de PCR purificats es van digerir després mitjançant enzims de restricció i es van lligar al plasmidi pGEX-4T{-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). i els plasmidis construïts es van transformar en cèl·lules d'Escher ichia coli Rosseta (DE3). L'expressió de proteïnes es va induir mitjançant isopropil- - D-thio galactopiranòsid 1 mM a 37 °C. Les proteïnes recombinants es van sotmetre a cromatografia d'afinitat mitjançant resina de glutatió (GST) (C600031, BBI, Xangai, Xina), seguint les instruccions del fabricant. Els antisers de conill contra FOXO es van preparar segons un mètode descrit anteriorment [55].
Occidental blotting
Les proteïnes extretes de diferents òrgans o hemòcits es van separar mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de dodecilsulfat de sodi a l'1 0%. Les proteïnes dels gels SDS-PAGE es van transferir a una membrana de nitrat de cel·lulosa mitjançant tampó de transferència (25 mM Tris-HCl, 20 mM glicina, 0,037% mM SDS i 20% etanol) i s'incuba en 5% de llet desnatada o 3% d'albúmina sèrica bovina (BSA) en solució salina tamponada amb Tris (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8, 0) durant 1 h amb agitació suau a temperatura ambient. A continuació, es van incubar les membranes amb antisèrum primari: Anti-FOXO a una dilució 1:100, anti-RAB5 a 1:25, anti Rab7 a 1:25, anti-beta actina (ACTB) a 1:250 (preparat al nostre laboratori). ); Anticossos policlonals histones-3 (A2348, ABclonal, Wuhan, Xina, 1:2500); anticossos policlonals antifosforilats (p)-AKT (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Xina, 1:500) i agitats suaument durant la nit a 4 °C. Després de rentar tres vegades amb TBST (0,1% Tween-20 afegit a TBS), les membranes es van incubar amb anticossos secundaris (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, Xina, 1:5,000) o ( ZB2301 ZSGB-Bio, Pequín, Xina, 1:5,000) durant 3 h a temperatura ambient amb una suau agitació. Les bandes de proteïnes immunoreactives es van desenvolupar mitjançant una solució de clorur de blau de nitrotetrazoli (A610379, BBI) i sal de P-toluidina (A610072, BBI) en condicions fosques o utilitzant quimioluminescència millorada (ECL). -actina o histona-3 es va utilitzar com a referèncias.
Patrons de distribució i expressió dels teixits en gambes desafiades per bacteris
La distribució de teixits de Foxo/FOXO als hemòcits, cor, brànquies, esputo, estómac i intestins es va analitzar mitjançant RT-PCR amb primers Foxo-F i Foxo-R (taula 1) i mitjançant western blotting amb anticossos anti-FOXO, respectivament. El procediment de PCR va consistir en una incubació inicial a 94˚C durant 3 min; seguit de 35 cicles de 94˚C durant 30 s, 50˚C durant 30 s i 72˚C durant 30 s; seguit de 72˚C durant 10 min. Els productes de PCR es van analitzar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa (1,5% d'agarosa). El gen -actina (-actina-F i -actina-R; Taula 1) es va utilitzar com a control intern. Els patrons d'expressió temporal de Foxo/FOXO als nivells d'ARN i proteïnes en gambes desafiats amb V. anguillarum es van analitzar mitjançant PCR quantitativa en temps real (qPCR) en un termociclador (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Alemanya) i mitjançant west ern blotting, respectivament. El procediment de qPCR va incloure: 95˚C durant 10 min; 40 cicles a 95˚C durant 10 s i 60˚C durant 50 s; i després un període de fusió de 65˚C a 95˚C. Els fitxers pro d'expressió de Foxo es van produir mitjançant el mètode 2-ΔΔCT [56] utilitzant la mitjana geomètrica dels dos gens de control intern de -actina i Ef-1 per a la normalització. L'eficiència del parell d'encebadors en qPCR es va analitzar seguint el mètode MIQE [57] amb una dilució logarítmica 10-plegada d'una barreja d'ADNc per generar una corba estàndard lineal.
Aïllament de proteïnes nuclears i citoplasmàtiques
El teixit intestinal es va disseccionar de gambes i es va rentar en PBS tres vegades. L'extracció de proteïnes es va dur a terme mitjançant un kit d'extracció de proteïnes nuclears i citoplasmàtiques (R0050, Solarbio, Beijing, Xina) seguint les instruccions del fabricant. Es van utilitzar almenys tres gambes per a l'extracció de proteïnes per eliminar les diferències individuals.
Assaig d'interferència d'ARN
Per analitzar la funció gènica, vam realitzar assajos d'interferència d'ARN (RNAi). Diversos parells d'encebadors que contenen la seqüència del promotor T7 (Foxo-RI-F i Foxo-RI-R; Rab5-RI-F i Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F i Rab7 -RI-R; Akt-RI-F i Akt-RI-R. Taula 1) es van dissenyar per amplificar les plantilles per a la síntesi d'ARNdc. Utilitzant l'ARN polimerasa T7 (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) i la plantilla d'ADNc, vam sintetitzar els fragments dsRNA. L'ARN dsGfp de proteïna fluorescent verda de doble cadena va servir com a control, que es va amplificar mitjançant Gfp-RI-F i Gfp -RI-R (taula 1) com a cebadors per a la síntesi de dsGfp. A continuació, es van injectar els fragments d'ARNdc (50 ug/cada un) al segment abdominal de M. japonicus mitjançant una microxeringa i es va realitzar una segona injecció 12 h després amb la mateixa dosi. L'eficiència de la interferència de l'ARN es va analitzar mitjançant PCR de transcripció inversa en temps real quantitativa (qRT-PCR, que inclou la transcripció inversa d'ARN per formar ADNc, que es va utilitzar com a plantilla en un assaig qPCR) o western blotting 24 h després de la segona injecció. -L'actina es va utilitzar com a referència interna.
Referències
1. Calnan DR, Brunet A. El codi FoxO. Oncogen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Via de reparació de l'ADN estimulada pel factor de transcripció FOXO3a a través de la proteïna Gadd45. Ciència. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Visca FOXO: desvelant el paper de les proteïnes FOXO en l'envelliment i la llarga vida. Cèl·lula d'envelliment. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Control de triple capa-fosforilació, acetilació i ubiquitinació de proteïnes FOXO. Cicle cel·lular. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Regulació dels factors de transcripció FoxO per acetilació i interaccions proteïna-proteïna. Res cel·lular Bba-Mol. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Factors de transcripció FOXO: la seva importància clínica i regulació. Biomed Res Int. 2014; 2014: 1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Gens que actuen aigües avall del DAF-16 per influir en la vida útil de Caenorhabditis elegans. Naturalesa. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Vies de la insulina/IGF-1R, SIRT1 i FOXO: una forma d'interacció intrigant per a l'os i l'osteosarcoma. Front Endocrinol (Lausana). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt promou la supervivència cel·lular mitjançant la fosforilació i la inhibició d'un factor de transcripció forkhead. Cèl·lula. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 inhibeix FOX01 en la supressió del tumor mitjançant la degradació mediada per la ubiquitina. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. El factor de transcripció Fork Head DAF-16 transdueix senyals metabòliques i de longevitat semblants a la insulina a C. elegans. Naturalesa. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. La senyalització de FoxO intestinal és necessària per sobreviure a la infecció oral a Drosophila. Immunol de la mucosa. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO regula la interferència d'ARN a Drosophila i protegeix de la infecció pel virus d'ARN. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 promou l'homeòstasi immune intestinal per limitar la disbiosi comen sal i allargar la vida útil. Cèl·lula. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. Regulació dependent de FOXO de l'homeòstasi immune innata. Naturalesa. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Els factors de transcripció FOXO regulen els mecanismes immunitaris innats a les cèl·lules epitelials respiratòries. J Immunol. 2013; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Immunitat de la mucosa i factors de transcripció FOXO1. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Pèptids antimicrobians: dels invertebrats als vertebrats. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Immunity in Drosophila melanogaster: des del reconeixement microbià fins a la fisiologia de l'organisme sencer. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Immunitat innata de Drosophila: una perspectiva evolutiva. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Immunitat de Drosophila: camins i patrons. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Avenços recents en les investigacions sobre la immunitat innata de les gambes a la Xina. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. La unió d'un domini de bobina enrotllada de lectina de tipus C al receptor Domeless activa directament la via JAK/STAT en la resposta immunitària de les gambes a la infecció bacteriana. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Fagocitosi: un procés immunobiològic. Immunitat. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. L'autofàgia mediada per FoxO1-és necessària per al desenvolupament de cèl·lules NK i la immunitat innata. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 regula l'activitat dels neutròfils induïda pels bacteris. Front Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. La lectina de tipus C s'uneix a la beta-integrina per promoure la fagocitosi hemocítica en un invertebrat. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. L'ensenyament de l'autodefensa de les gambes per combatre les infeccions. Tendències Biotecnologia. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Emergència històrica, impacte i estat actual dels patògens de gambes a Àsia. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Defensa antiviral en gambes: de la immunitat innata a la infecció viral. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. Relacions estructura/funció subjacents a la regulació dels factors de transcripció FOXO. Oncogen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.