El perfil immune longitudinal revela els epítops dominants que medien la immunitat humoral a llarg termini en individus convalescents de COVID-19

Fons: El coronavirus 2 de la síndrome respiratòria aguda severa (SARS-CoV-2) és un coronavirus altament patògen i contagiós que va provocar una pandèmia mundial amb 5,2 milions de víctimes mortals fins ara. Les preguntes sobre les característiques serològiques de la immunitat a llarg termini, especialment els epítops dominants que medien respostes d'anticossos duradores després de la infecció per SARS-CoV-2, queden per dilucidar.

Objectiu: Teníem com a objectiu disseccionar la cinètica i la longevitat de les respostes immunitàries en pacients amb malaltia de coronavirus 2019 (COVID-19), així com els epítops responsables de la immunitat humoral sostinguda a llarg termini contra el SARS-CoV-2.

Mètodes: vam avaluar la dinàmica immune del SARS-CoV-2 fins a 180 a 220 dies després de l'aparició de la malaltia en 31 persones que van experimentar predominantment símptomes moderats de COVID-19, i després vam realitzar un perfil a tot el proteoma dels epítops dominants responsables de Respostes immunitàries humorals persistents.

Resultats: L'anàlisi longitudinal va revelar anticossos específics de proteïna d'espiga per SARS-CoV-2 i anticossos neutralitzants en pacients amb COVID-19, juntament amb l'activació de la producció de citocines en les primeres etapes després de la infecció per SARS-CoV-2. Es va demostrar que els epítops altament reactius que eren capaços de mediar respostes d'anticossos a llarg termini es localitzaven a les proteïnes d'espiga i ORF1ab. Els epítops clau de la proteïna d'espiga SARS-CoV-2 es van cartografiar al domini N-terminal de la subunitat S1 i la subunitat S2, amb diferents graus d'homologia de seqüència entre els coronavirus humans endèmics i una alta identitat de seqüència entre els primers SARS- CoV-2 (Wuhan-Hu{- 1) i variants circulants actuals.

Beneficis del suplement de cistanche: com enfortir el sistema immunitari

Conclusió: La infecció per SARS-CoV-2 indueix una immunitat humoral persistent en individus convalescents per COVID-19 dirigint-se als epítops dominants situats a l'espiga i a les proteïnes ORF1ab que medien les respostes immunes a llarg termini. Les nostres troballes proporcionen un camí per ajudar al disseny racional de vacunes i al desenvolupament de diagnòstic. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Paraules clau:

SARS-CoV-2, COVID-19, resposta immune a llarg termini, immunitat humoral, microarray de pèptids a tot el proteoma, epítop dominant

Síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), el patogen causant de la pandèmia de la malaltia del coronavirus en curs 2019 (COVID-19), pertany al gènere Betacoronavirus, que inclou altres 2 humans altament patògens coneguts. coronavirus: la síndrome respiratòria aguda severa (SARS) i la síndrome respiratòria de l'Orient Mitjà (MERS) coronavirus.1 Des de l'aparició del primer cas registrat a finals de desembre de 2019, la infecció per SARS-CoV-2 ha donat lloc a més de 263 milions casos confirmats i 5,2 milions de morts a tot el món a partir del novembre de 2021, afectant 220 països i regions de 5 continents.2 Després de la infecció, les presentacions clíniques varien àmpliament, incloses infeccions asimptomàtiques, símptomes lleus o moderats, o fins i tot pneumònia greu que amenaça la vida.3 disponibilitat de diversos tipus d'enfocaments de vacunes, molts països encara lluiten per contenir noves onades d'infeccions, amb variants de virus emergents que semblen mostrar una major transmissibilitat i resistència a les respostes immunes antivirals. Una resposta immune humoral eficaç mediada per anticossos neutralitzants hauria de posseir una immunitat adaptativa potent i indispensable per bloquejar la infecció i eliminar els patògens virals. Després de la infecció per SARS-CoV-2, es va observar una taxa elevada (per sobre del 90%) de seroconversió robusta entre els individus infectats entre 7 i 14 dies després de l'inici de la malaltia.4-6 La producció d'IgA, IgG, antigen específic, i IgM que reconeixia la proteïna espiga (S) i la proteïna nucleocàpsida (N) del SARS-CoV-2 es va detectar durant la fase aguda de la malaltia i l'etapa inicial de la convalescència.4,5,7 La magnitud dels anticossos neutralitzadors semblava s'associa amb l'edat, la infecció simptomàtica i la gravetat de la malaltia. Els pacients grans i les persones que presenten símptomes greus de COVID-19 tendeixen a desenvolupar nivells més alts d'anticossos neutralitzants.4,8-10 Diversos estudis sobre la longevitat de les respostes d'anticossos han revelat que malgrat una pèrdua de reactivitat sèrica/plasmàtica al virus antígens i la disminució dels títols d'anticossos neutralitzants amb el pas del temps en alguns casos simptomàtics de COVID-19, es va observar un nivell sostingut d'immunitat humoral a llarg termini durant fins a 8 a 12 mesos després de la infecció en individus convalescents de COVID-19 .10-13 A més, el nombre de cèl·lules B de memòria específiques del SARS-CoV-2 antigen es va mantenir estable durant almenys 6 a 12 mesos,12,13 juntament amb la selecció i acumulació contínua de clons de cèl·lules B que expressaven anticossos neutralitzants,12,14 que indiquen el manteniment de la immunitat humoral persistent després de la infecció per SARSCoV-2.

Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat

Els anticossos neutralitzants tenen un paper fonamental en les defenses de l'hoste contra la infecció viral. S'ha identificat un panell d'anticossos monoclonals altament potents de SARS-CoV-2,15-17 dirigits principalment als epítops situats al domini d'unió al receptor de la proteïna S que s'agrupa en trímers a la superfície del virió i facilita l'entrada del virus. i la fusió en enganxar el receptor 2 de l'enzim convertidor d'angiotensina.18 Altres regions de la proteïna S, inclòs el domini N-terminal (NTD) de la subunitat S1 i la subunitat S2, també contenen epítops immunogènics capaços d'induir anticossos neutralitzants.16 ,19,20 A més de la neutralització, els anticossos del SARS-CoV-2 poden conferir protecció in vivo mitjançant funcions efectores mediades per Fc, com ara la fagocitosi dependent d'anticossos desencadenada per cèl·lules assassines naturals i la citotoxicitat dependent d'anticossos per monòcits o macròfags. 21,22 A més de combatre les infeccions víriques, els anticossos generats per la infecció natural o la vacunació poden facilitar la patogènesi del virus, ja sigui per l'augment de l'activació de la inflamació o per l'augment de la infectivitat del virus mitjançant la formació d'un complex immune d'antigen/anticossos o per funcions dependents de Fc,23-25 tot i que la infecció viral millorada no s'ha observat en el context del SARS-CoV-2 in vivo. Aquests rols divergents de les respostes d'anticossos necessiten una caracterització sistemàtica dels epítops SARSCoV-2, així com les propietats dels anticossos de llarga durada dirigits als epítops neutralitzants o no neutralitzants. Malgrat els avenços recents en la cinètica i la durada de les respostes d'anticossos després de la infecció per SARS-CoV-2, l'anàlisi longitudinal sobre epítops prominents que sostenen respostes immunitàries humorals a llarg termini encara és limitada. Estudis anteriors han perfilat epítops de la resposta d'anticossos en individus infectats per COVID-19, principalment mitjançant assajos basats en ELISA, 26,27 enfocaments basats en visualització de fags o bacteris28-31 i tecnologies basades en microarrays.30,{{ 38}} S'han identificat diversos epítops immunodominants de la proteïna S SARS-CoV-2; les regions detectades amb més freqüència es van cartografiar a prop o abastant el pèptid de fusió (FP) de la subunitat S2, la segona heptada es repeteix dins de la subunitat S2 i al domini C-terminal de la subunitat S1.26,28-30, 32,33 A més, el cribratge serològic també va revelar epítops localitzats en altres proteïnes del proteoma SARS-CoV-2, inclosa la proteïna N, la proteïna de membrana (M) i ORF1ab, ORF3a i ORF7a.28-30, 34,35 Tot i que estudis anteriors han proporcionat una visió important dels epítops antigènics, aquests estudis s'han centrat en gran mesura en el perfil de l'epítop dels pacients amb COVID-19 en la fase de convalescència primerenca. Els epítops exactes que medien les respostes d'anticossos específiques del SARS-CoV-2, així com la dinàmica del reconeixement d'epítops, encara no s'han dilucidat. Aquí, per obtenir una comprensió més profunda de la cinètica i la longevitat de les respostes immunes humorals en pacients amb COVID-19, especialment els epítops responsables de la immunitat sostinguda a llarg termini contra el SARS-CoV{-2, vam realitzar una anàlisi longitudinal exhaustiva. del perfil immune en 31 pacients amb COVID-19 fins a 180 a 220 dies després de l'aparició dels símptomes. A partir de l'avaluació dels anticossos neutralitzants i d'unió a l'antigen, així com dels nivells de citocines sèriques, vam identificar a més un panell d'epítops situats a les proteïnes ORF1ab, S i N de SARSCoV-2 que media les respostes immunes humorals persistents mitjançant un pèptid. microarray que abasta el proteoma complet del SARS-CoV-2. Els nostres resultats il·luminen les característiques de la immunitat a llarg termini per superar la infecció viral i ajudaran a informar el disseny racional de vacunes i el desenvolupament d'eines de diagnòstic serològic millorades.

MÈTODES

Participants en l'estudi i recollida de mostres

Per avaluar longitudinalment la cinètica de les respostes immunes dirigides al SARS-CoV-2, es van recollir 101 mostres de sèrum de 31 persones infectades amb SARS-CoV-2 que van ser ingressades al Tercer Hospital de Nantong afiliat a la Universitat de Nantong (Nantong). , Xina) entre gener i març de 2020. A tots els pacients se'ls va diagnosticar una infecció confirmada per SARS-CoV-2 mitjançant proves PCR quantitatives de transcripció inversa; La gravetat de la malaltia es va definir com a COVID-19 lleu a moderada (no greu) o greu d'acord amb la versió 7 del Protocol de diagnòstic i tractament de la pneumònia per coronavirus publicada per la Comissió Nacional de Salut de la República Popular de la Xina.36 Els pacients van ser seguits. augmenta longitudinalment durant 4 a 8 mesos després de la recuperació d'una infecció aguda. Les mostres de sang es van recollir de manera longitudinal de 4 a 219 dies després de l'aparició dels símptomes per a 20 pacients entre 31 participants a l'estudi (mediana de 4,5 mostres per individu, que van de 2 a 8), mentre que es va realitzar un mostreig puntual per a cadascun dels altres 11 individus que estaven en una fase de convalescència tardana (dels dies 122 al 214 després de l'inici de la malaltia). En conseqüència, els sèrums (n 5 20) de donants sans coincidents per edat i sexe també es van incloure com a grup control. Cap participant de l'estudi tenia una infecció prèvia documentada per SARS o MERS.

L'estudi va ser aprovat pel comitè ètic del Tercer Hospital de Nantong afiliat a la Universitat de Nantong (aprovació EL2020006). Es va obtenir el consentiment informat per escrit de cadascun dels participants de l'estudi. El sèrum es va separar de la sang perifèrica en tubs de gel de sèrum mitjançant centrifugació, es va formar en alíquotes i es va emmagatzemar a 2808C abans de l'ús.

Línies cel·lulars

Les cèl·lules HEK293T i Huh7 es van cultivar en un medi Eagle modificat amb Dulbecco (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví inactivat per calor (Gibco), 100 U/mL de penicil·lina (Gibco) i 100 mg/ ml d'estreptomicina (Gibco) a 378C amb un 5% de CO2.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Detecció d'anticossos IgG mitjançant ELISA

Els nivells d'anticossos IgG que s'uneixen a l'antigen en mostres de sèrum humà es van determinar mitjançant ELISA. Les plaques ELISA de noranta-sis pous (Corning, Corning, NY) es van recobrir prèviament amb proteïna nucleocàpsida SARS-CoV-2 (Sino Biological, Beijing, Xina, núm. de catàleg 40588-V{08B). , 50 ng per pou) o proteïna espiga (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng per pou), proteïna espiga SARS-CoV (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng per pou) bé), o proteïna espiga MERS-CoV (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng per pou) durant la nit a 48ºC. Després de bloquejar amb un 5% de llet sense greix en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) que conté 0,05% de Tween 20 (PBS-T) durant 2 hores a 378ºC, 3-pleguen mostres de sèrum inactivat per calor diluïdes en sèrie a una dilució inicial d'1 Es van afegir 200 a plaques prerevestides durant 2 hores a 378ºC. Els pous es van rentar 3 vegades entre cada pas amb PBS-T. Les reaccions es van visualitzar mitjançant la incubació amb anticossos anti-IgG humans conjugats amb peroxidasa de rave picant (Abcam, Cambridge, Regne Unit, 1:100, dilució 000) durant 1 hora a 378ºC, seguida d'afegir substrat de tetrametilbenzidina (Life Technologies, Carlsbad). , Califòrnia). Les reaccions en desenvolupament es van aturar amb 2 mol H2SO4 i es va mesurar l'absorbància a 450 nm amb la longitud d'ona de correcció establerta a 630 nm (OD450 2OD630). Per calcular el títol del punt final dels anticossos d'unió, les dades es van linealitzar representant el log10 de les dilucions sèriques versus els valors corregits de densitat òptica (OD) (OD450 2 OD630) dins de la part lineal de la corba (y 5 kx 1 b). , r2 > 0,99) i la dilució sèrica a la qual es va calcular el valor de DO ajustat (OD450 2 OD630) 5 0 per donar un títol final. Els anticossos IgG específics d'antigen en ratolins immunitzats amb pèptids es van avaluar mitjançant ELISA basat en pèptids. Breument, les plaques ELISA de 96-pous (Thermo Fisher Scientific) es van recobrir amb 1 mg per pou de 4 pèptids barrejats (pèptids 318, 356, 510 i 530) en tampó carbonat (pH 9,6) durant la nit a 48ºC. Després de bloquejar-lo amb PBS-T que contenia un 5% de llet sense greix, es van incubar els pous amb mostres de sèrum diluïdes a 1:40 durant 1 hora a 378ºC. Posteriorment, les plaques es van rentar i es van incubar amb anticossos IgG anti-ratolí conjugat amb peroxidasa de rave picant (Abcam). Les reaccions es van visualitzar amb substrat de tetrametilbenzidina (Life Technologies) i es va mesurar l'absorbància a 450 nm després d'aturar les reaccions amb 2 mol H2SO4.

Producció i valoració de pseudovirus

El gen optimitzat per codons que codifica per a la proteïna espiga SARS-CoV-2 (NC_045512) o SARS-CoV (AY291315.1) amb supressió C-terminal 19 aa, o MERS-CoV (JX{{10 }}) la proteïna espiga truncada amb el C-terminal 16 aa es va clonar al vector pcDNA3.1(1), respectivament. Les cèl·lules HEK 293T cultivades en un plat de cultiu de teixits de 100 mm es van cotransfectar amb 1 mg d'un plasmidi que codifica la proteïna espiga i 15 mg d'una columna vertebral amb deficiència d'env i que expressa luciferasa (pNL4-3.luc.RE) utilitzant polietilenimina (Polysciences). , Warrington, Pennsylvania). Els sobrenedants de cultiu cel·lular que contenien pseudovirus es van recollir 48 hores després de la transfecció, es van filtrar i es van emmagatzemar a 2808C en alíquotes. Per a la determinació dels títols de virus (dosi infecciosa del 50% de cultiu de teixits), es van afegir dilucions en sèrie de pseudovirus a 1 3 104 cèl·lules Huh7 preconfigurades a 96-plaques de pous. Després de 12 hores d'infecció, el medi que contenia virus es va substituir per un medi de creixement fresc i les cèl·lules es van cultivar durant 48 hores addicionals. L'activitat de la luciferasa de la lisi cel·lular es va mesurar amb el sistema d'assaig de luciferasa Steady-Glo (Promega, Madison, Wisc) mitjançant un lector de microplaques (BioTek Instruments, Winooski, Vt) i es van considerar pous que produeixen unitats de luminescència relativa superiors a 10 vegades el valor mitjà de fons. positiu.

Pseudònimassaig de neutralització de rus

Les mostres de sèrum inactivades per calor de pacients amb COVID-19 o donants sans es van diluir 2-vegades en sèrie i incubar amb 200 pseudovirus a una dosi infecciosa de cultiu de teixits del 50% durant 1 hora a 378ºC. A continuació, les barreges es van aplicar per infectar cèl·lules Huh7 preconfigurades en plaques de 96-pous per duplicat. Els pous es van reposar amb medi de creixement fresc a les 12 hores després de la infecció i es va determinar l'activitat luciferasa de les cèl·lules 48 hores després. Els títols de neutralització del 50% (NT50) contra els pseudovirus SARS-CoV-2 i SARS-CoV es van calcular mitjançant regressió no lineal mitjançant el programari GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, Calif); i el pseudovirus NT50 del MERS-CoV es va definir com la dilució més alta de sèrum que va donar lloc a una reducció del 50% de les unitats de luminescència relativa en comparació amb el control del virus sense aplicar mostres de sèrum.

Detecció de citocines basada en microarrays de proteïnes

La mesura quantitativa de múltiples citocines (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL{-10 , IL-13, MCP{-1, IFN-g i TNF-a) en mostres de sèrum es va realitzar mitjançant una matriu ELISA múltiplex (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) segons el protocol del fabricant. Breument, es van bloquejar diapositives de vidre prerevestides amb anticossos específics de citocines amb diluent de mostra a temperatura ambient durant 30 minuts, seguit de l'addició de mostres de sèrum diluïdes de 60 ml 2- vegades o dilucions estàndard de citocines. Després d'una nit d'incubació a 48 °C, les diapositives es van rentar 5 vegades i es van tacar amb un còctel d'anticossos de detecció biotinilats de 80 ml i després estreptavidina conjugada amb colorant equivalent Cy3 a temperatura ambient durant 1 hora. La intensitat de fluorescència es va detectar amb l'escàner de microarrays InnoScan 300 (Innopsys, Chicago, Ill) a 532 nm i les dades es van analitzar mitjançant el programari Q-Analyzer (RayBiotech).

Síntesi de pèptids i conjugació amb albúmina sèrica bovina

Un total de 515 pèptids (15 aa de longitud, superposats per 11 aa) que cobreixen el proteoma SARS-CoV-2 van ser sintetitzats per GL Biochem (Xangai, Xina) sobre la base de la seqüència d'aminoàcids del SARS-CoV. -2 cep Wuhan-Hu-1. Els pèptids es van conjugar amb albúmina sèrica bovina (BSA) mitjançant el reticulant Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) segons les instruccions del fabricant. Breument, es va afegir Sulfo-SMCC amb un excés molar 30-fold a BSA, seguit de diàlisi a PBS. Posteriorment, el pèptid que conté cisteïna es va afegir en una proporció d'1:1 (pes/pes) incubat durant 2 hores i es va dialitzar més amb PBS per eliminar els pèptids lliures.

Fabricació de microarrays de pèptids

Per preparar el microarray de pèptids, pèptids de SARS-CoV-2, així com el control negatiu (BSA) i controls positius (anticossos IgG anti-humans i anticossos anti-IgM humans; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , es van immobilitzar en diapositives de substrat PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) per triplicat mitjançant una impressora Super Marathon (Arrayjet, Edimburg, Escòcia, Regne Unit). A continuació, es van conservar les microarrays de pèptids a 2808C per a un ús posterior.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Mapatge d'epítops basat en microarrays

L'anàlisi sèrica basada en microarrays es va realitzar com Li et al,37 amb modificacions menors. Per tal de crear cambres individuals per als subarrays idèntics, es va muntar una junta de goma de cambra 14-a cada diapositiva de microarrays de pèptids. Les matrius de diapositives es van escalfar a temperatura ambient abans d'utilitzar-les, després es van bloquejar amb un 3% de BSA en PBS-T durant 3 hores. Les mostres de sèrum de pacients amb COVID-19 o sèrums agrupats de 20 donants sans (grup control) es van diluir a 1:200 en PBS-T per a la majoria de mostres i després es van incubar amb cada subbaixa durant 2 hores a 48C. Les matrius es van rentar amb PBS-T i es van incubar amb Cy3-IgG anti-humana de cabra conjugada i Alexa Fluor 647-IgM anti-humana d'ase conjugada (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) a una dilució 1:1000. cadascun durant 1 hora a temperatura ambient. Després de la incubació, les matrius es van rentar amb PBS-T i després es van assecar completament mitjançant centrifugació a temperatura ambient. Posteriorment, es van escanejar les matrius mitjançant un escàner de microarrays LuxScan 10K-A (CapitalBio, Beijing, Xina) i es van obtenir i analitzar les dades d'intensitat de fluorescència FL mitjançant el programari GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif).

FIG 1. Dinàmica longitudinal de les respostes d'anticossos en pacients amb COVID-19. Un esquema del disseny de l'estudi. En l'estudi es van incloure un total de 31 persones infectades amb SARS-CoV-2 i 20 donants sans. La recollida de mostres de sèrum es va realitzar longitudinalment en diversos moments per a 20 pacients entre 31 individus infectats amb SARS-CoV-2, mentre que es va fer mostreig en un únic moment per als altres 11 pacients. S'enumeren el nombre de participants i les mostres de sèrum utilitzades en diferents assajos. B i C, un total de 101 mostres de sèrum de 31 pacients amb COVID-19 es van provar mitjançant ELISA per a anticossos IgG d'unió a proteïnes N (B) i proteïnes S (C) SARS-CoV-2 en diferents moments. després de l'aparició dels símptomes (dies 1-30, n 5 37; dies 31-61, n 5 18; dies 100-150, n 5 21; dies {{21} }}, n 5 25). Es van incloure mostres de sèrum de 20 donants sans com a grup control. D, NT50 contra pseudovirus SARS-CoV-2 al llarg del temps es va calcular mitjançant regressió no lineal. E, es presenta la distribució de l'activitat neutralitzant sèrica en pacients amb COVID-19 en els moments indicats després de l'inici de la malaltia. Les mostres amb un títol NT50 inferior a 20 es van definir com a no neutralitzants

Anàlisi de dades de microarrays de pèptids

Es van analitzar les dades d'IgG i IgM respectivament. La intensitat del senyal de cada punt es va definir com el primer pla menys el fons i es va fer la mitjana dels punts triples per a cada pèptid. El valor de tall per a la resposta positiva del pèptid de les mostres de COVID-19 es va establir com el doble de la intensitat del senyal del control del donant sa. Els pèptids amb taxes positives per sobre del 80% entre les mostres provades en els 3 moments de mostreig (dies 10-60, 100-150 i 180-220 després de l'inici de la malaltia) es van definir com a pèptids i pèptids dominants i persistents amb una freqüència de resposta positiva superior al 60% en tots els 3-punts temporals es va considerar subdominant i persistent. Es va calcular la intensitat mitjana del senyal de cada pèptid en 3 grups de temps de mostreig; També es van seleccionar pèptids que mostraven una intensitat de senyal alta (per sobre de la mitjana 1 SD de les intensitats del senyal de totes les mostres provades). El processament i l'anàlisi de dades es van realitzar mitjançant el programari R v3.6.3 (https://www.r-project.org/), i es van avaluar canvis significatius d'intensitat del senyal entre diferents grups de temps de mostreig basats en Limma. Les diferències amb P < 0,05 es van considerar estadísticament significatives.

Immunització del ratolí

Les femelles de ratolins BALB/c d'entre 6 i 8 setmanes es van comprar a Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, Xina). Tots els ratolins es van allotjar en instal·lacions específiques lliures de patògens i l'estudi animal va ser aprovat pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat Mèdica de Tianjin (Tianjin, Xina). Per a la immunització, es van injectar intramuscularment grups de ratolins (n ​​5 5) amb 25 mg per dosi de cada pèptid (pèptids 318, 356, 510 i 530 respectivament) barrejats amb 50 mg d'alum (InvivoGen, San Diego, Calif) i adjuvants de CpG de 10 mg, i augmentat dues vegades amb 50 mg per dosi de pèptids en presència d'adjuvants a intervals de 2-setmanes. La vacunació només amb adjuvants va servir de control negatiu. Els sèrums es van recollir de ratolins immunitzats el dia 10 o el dia 14 després de la segona i la tercera immunització.

Anàlisis estadístics i estructurals

Tots els gràfics van ser representats per GraphPad Prism. Les comparacions estadístiques entre els grups de les figures 1, 2 i 4 es van realitzar mitjançant 1-via ANOVA amb comparació múltiple de Tukey. Les correlacions que es mostren a la figura 1, la figura E9 i la figura E10 al dipòsit en línia disponible a www.jacionline.org, es van determinar mitjançant l'anàlisi de correlació de Pearson. Les diferències amb P < 0,05 es van considerar estadísticament significatives. Les estructures de la proteïna espiga del SARS-CoV-2 (Banc de dades de proteïnes [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX i ID PDB: 6ZGI) i el domini de dimerització del SARS-CoV{{ La proteïna nucleocàpsida 13}} (PDB ID: 6YUN) es va utilitzar per disseccionar els detalls estructurals dels epítops identificats situats a la proteïna espiga i el domini de dimerització de la proteïna nucleocàpsida. L'alineació de seqüències i l'anàlisi d'homologia entre diversos coronavirus humans es van realitzar mitjançant l'algoritme Clustal W al programari MEGA v10.1.6.

RESULTATS

La infecció per SARS-CoV-2 indueix anticossos neutralitzants i d'unió a l'antigen específics sostinguts

Per avaluar longitudinalment les respostes d'anticossos després de la infecció per SARS-CoV-2, es van recollir 101 mostres de sèrum de 31 individus amb infecció per SARS-CoV-2 confirmada per PCR (figura 1, A). Els participants de l'estudi van incloure 26 pacients amb COVID-19 moderat, 1 amb presentació asimptomàtica, 2 amb malaltia lleu i 2 amb símptomes greus (vegeu la taula E1 al Repositori en línia disponible a www.jacionline.org). Els pacients inscrits en aquest estudi oscil·laven entre els 17 i els 66 anys (edat mitjana, 45 anys), amb una distribució aproximadament igual de subjectes masculins (51,6%) i dones (48,4%). Els símptomes més comuns entre els participants de l'estudi van incloure febre (83,9%), tos (67,7%), miàlgia (22,6%) i calfreds (22,6%), amb una durada mitjana de la malaltia de 15 dies. Es van recollir un total de 90 mostres de sèrum de 20 pacients amb COVID-19 durant l'hospitalització i l'alta després de la recuperació en diversos moments fins a 219 dies després de l'aparició dels símptomes (figura 1, A i vegeu la taula E2 al repositori en línia). El mostreig dels altres 11 participants es va realitzar en un sol moment durant la convalescència tardana (dels dies 122 al 214 després de l'aparició dels símptomes). A més, es van incloure mostres de 20 donants sans amb distribució d'edat i sexe coincidents com a grup de control (taula E1). Els anticossos IgG específics de l'antigen en mostres de sèrum es van quantificar mitjançant ELISA prerevestit amb proteïna SARS-CoV-2 N o proteïna S. En comparació amb els donants sans, es van desenvolupar anticossos IgG anti-N i anti-S en pacients amb COVID-19 dins dels 30 dies posteriors a l'aparició dels símptomes, amb un títol final mitjà geomètric de 4,10 (log10 anti-N IgG) i 4.20 (log10 anti-S IgG) (Fig 1, B i C; i vegeu la taula E3 al Repositori en línia a www.jacionline.org; Fig E1, A i B; i Fig E2), d'acord amb les observacions anteriors que la seroconversió es produeix entre 1 i 2 setmanes després de la infecció per SARS-CoV-2.5,38 Després, els títols d'anticossos d'unió a l'antigen van disminuir en diferents graus amb el temps. Es va observar una disminució ràpida i dramàtica dels nivells d'anticossos anti-N IgG en pacients amb COVID-19, mentre que els nivells més alts de títols d'IgG anti-S es van mantenir fins a 180 a 220 dies després de l'inici de la malaltia en comparació amb els donants sans (Fig 1, B). , i C). L'anàlisi de correlació va revelar una correlació significativa entre els títols d'IgG anti-N log10 i els títols d'IgG anti-S (r 5 0.50 i P <.001; Fig 1, F). A més de quantificar els anticossos d'unió, la dinàmica d'anticossos neutralitzants funcionals en individus amb COVID-19 es va determinar encara més mitjançant SARS-CoV pseudotipat-2. Més del 95% de les mostres de sèrum de pacients (35/37) recollides entre 4 i 30 dies després de l'aparició dels símptomes tenien activitats neutralitzants sòlides contra el SARS-CoV-2, i una gran proporció de mostres presentaven un nivell moderat (NT50 80-320 ) a una activitat neutralitzadora forta (NT50 > 320) (Fig 1, D i E). Cal destacar que es van recollir 2 mostres amb títols neutralitzants nuls o baixos (NT50 amb una dilució sèrica mínima d'1:20) en un període primerenc després de la infecció viral (al dia 4 i al dia 11 després de l'aparició dels símptomes) abans d'obtenir anticossos neutralitzants potents (Fig. 1, D i Fig E1, C). Malgrat la disminució dels nivells d'anticossos neutralitzants del SARS-CoV-2 en pacients amb COVID-19 al llarg del temps, la majoria de mostres de sèrum de pacients (24/25) obtingudes durant 180 a 220 dies després de l'aparició dels símptomes van mantenir la positivitat per a la neutralització contra el SARS- CoV-2, amb una disminució de 2.8-folds de la mitjana geomètrica dels títols NT50 (Fig 1, D i E; Taula E3; Fig E3). Com era d'esperar, en comparació amb els anticossos IgG anti-N, es va identificar una correlació més forta entre els títols d'IgG d'unió a SARS-CoV-2 S i els títols d'anticossos neutralitzants (r 5 0.61 i P < .001; figura 1). , G i H), d'acord amb les troballes que la proteïna SARS-CoV-2 S és l'objectiu principal dels anticossos neutralitzadors. La proteïna S del SARS-CoV-2 comparteix una gran similitud de seqüència amb el SARS-CoV altament virulent (76% d'identitat de seqüència) i mostra una baixa homologia de seqüència amb MERS-CoV (34% d'identitat de seqüència). S'ha informat de reactivitat creuada serològica entre coronavirus;8,10,28,29, tanmateix, les dades sobre l'avaluació de seguiment longitudinal de la reactivitat creuada dels anticossos contra SARS-CoV-2 cap a altres coronavirus segueixen sent limitades. Hem determinat anticossos d'enllaç creuat i neutralització creuada en sèrums longitudinals d'individus infectats per SARS-CoV-2. Els resultats van mostrar que més del 80% de les mostres de sèrum de pacients es van unir a proteïnes S de SARS-CoV i/o MERS-CoV dins d'un mes després de l'aparició dels símptomes, amb el 27% de les mostres que presenten una doble reactivitat creuada (Fig 1, I). La reactivitat a la proteïna S SARS-CoV tenia una proporció més gran (73%) que MERS-CoV (35%) entre les mostres provades en un període primerenc (1-30 dies després de l'aparició de la malaltia) (Fig 1, I). Els anticossos d'unió creuada doble i SARS-CoV van mostrar una disminució gradual al llarg del temps, amb només un 8% de doble unió i un 20% de mostres d'unió única SARS-CoV entre 180 i 220 dies després de l'inici de la malaltia (Fig 1). , I; al Repositori en línia disponible a www.jacionline.org, vegeu Fig E4, A; Fig E5, A; i Fig E6 al Repositori en línia d'aquest article a www.jacionline.org). Curiosament, la positivitat dels anticossos reactius a la proteïna MERS-CoV S es va mantenir relativament constant al llarg del temps (Fig 1, I). A diferència de l'alta capacitat d'enllaç creuat, només un petit nombre de mostres de sèrum de pacients van neutralitzar creuament pseudovirus SARS-CoV i/o MERS-CoV (Fig 1, I; Fig E4, B; Fig E5, B; i vegeu la Fig E7 a la Repositori en línia). Aproximadament el 27% de les mostres recollides entre 1 i 30 dies després de l'aparició dels símptomes presentaven activitat de neutralització creuada, i aquest nombre va baixar al 20% entre 180 i 220 dies, amb canvis més dramàtics en l'activitat de neutralització creuada del SARS-CoV (Fig 1, I). ). Una proporció més alta de mostres va neutralitzar SARSCoV que MERS-CoV dins dels 30 dies posteriors a l'aparició de la malaltia. Val la pena assenyalar que, malgrat proporcions similars de mostres que mostraven neutralització creuada per SARS-CoV i MERS-CoV, els valors NT50 per a MERS-CoV eren molt inferiors als de SARSCoV entre les mostres de sèrum que eren positives per a la neutralització creuada (Fig E4, B; Fig E5, B; Fig E7).

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

La infecció per SARS-CoV-2 provoca l'activació de la producció de citocines

Per caracteritzar de manera exhaustiva els canvis immunològics després de la infecció per SARS-CoV-2, vam avaluar més els canvis en la dinàmica dels nivells de citocines en sèrums de pacients amb COVID-19. Es van utilitzar cinquanta-cinc mostres de sèrum longitudinals que es van recollir durant els dos primers mesos de l'aparició dels símptomes per a la detecció de la producció de citocines mitjançant microarrays basats en proteïnes. Es va observar un augment dels nivells sèrics de múltiples citocines durant el primer mes de la malaltia, incloent IL-1a (proinflamatòria), IL-6 (proinflamatòria) i IL-10 (antiinflamatòria). ), que s'han relacionat amb la síndrome d'alliberament de citocines en casos greus de COVID-19,39,40, així com amb IFN-g (tipus TH1) i IL-4 (tipus TH2) (Fig 2, A, i Fig E8 al Repositori en línia disponible a www.jacionline.org). Concretament, els nivells sèrics d'IL-6, IL{-10 i IFN-g van augmentar en els 15 dies posteriors a l'aparició dels símptomes en pacients i van disminuir en fases posteriors, mentre que l'alliberament d'IL-1 Es va demostrar que a i IL-4 van augmentar notablement durant 16 a 30 dies des de l'inici de la malaltia, i després van baixar ràpidament a la normalitat (figura 2, A). L'anàlisi de correlació va indicar una associació lineal dèbil o nul·la entre les respostes d'anticossos específics d'antigen i la producció de citocines després de la infecció per SARS-CoV-2, tot i que es va observar una significació estadística entre els nivells d'IL-10 i SARS-CoV{{{ 34}} Anticòs d'unió a proteïnes N (r 5 0.321 i P < .05), entre la producció d'IL{-1b i anticossos d'unió a proteïnes S (r 5 20.335 i P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

El mapatge d'epítops a tot el proteoma identifica els epítops dominants que medien respostes immunes humorals persistents en pacients amb COVID-19

Per caracteritzar millor les característiques distintives de la immunitat humoral al SARS-CoV-2 al llarg del temps, vam aplicar un mapeig d'epítops a tot el proteoma mitjançant microarrays basats en pèptids. Es va generar una biblioteca de pèptids que cobreix el proteoma SARS-CoV-2 i es va immobilitzar en diapositives, en les quals cada pèptid tenia una longitud de 15 aa amb una superposició d'11 aa. Un total de 51 mostres longitudinals de sèrum de 19 pacients amb asimptomàtica (n 5 1) o lleu (n 5 2) a moderada (n 5 15) o greu (n 5 1 ) Es van provar les infeccions per SARS-CoV-2 (taula I). Per aconseguir nombres de mostreig, intervals i punts de temps relativament equilibrats, es van recollir mostres seqüencialment en 2 o 3 moments de cada participant de la COVID-19, que van des dels 16 als 219 dies després de l'aparició dels símptomes. La majoria dels pacients (18/19) van generar anticossos neutralitzants després de la infecció viral, excepte l'individu amb infecció asimptomàtica (taula I). Segons els diferents moments de mostreig, les mostres es van dividir en 3 grups: dies 10-60 (n 5 18), dies 100-150 (n 5 18) i dies {{28 }} (n 5 15). Es va realitzar una avaluació longitudinal dels perfils d'epítops del virus en pacients amb COVID-19 tant per als anticossos IgG com IgM sèrics, amb sèrums agrupats de 20 donants sans utilitzats com a control negatiu. Mitjançant el microarray de proteoma SARS-CoV-2, es va determinar i analitzar la cinètica de les respostes d'anticossos d'unió a pèptids per a (1) la intensitat del senyal d'unió i (2) el percentatge de mostres positives-reactives (taxa positiva) per a cada pèptid. . A partir del valor de tall per a una resposta positiva d'unió a pèptids, que es va establir com el doble de la intensitat del senyal del control negatiu, vam identificar un total de 460 pèptids positius per a IgG i 479 pèptids positius per a IgM que eren reactius amb almenys 1 pacient. mostra de sèrum. Els nombres de pèptids positius i la distribució de respostes entre diferents marcs de lectura oberts (ORF) de SARS-CoV-2 eren relativament estables entre diferents grups de mostreig, amb una tendència a una lleugera disminució del nombre de pèptids positius al llarg del temps (Fig 3, A). La major reactivitat es va identificar a la poliproteïna replicasa ORF1ab, que és l'ORF més gran, que abasta més de dos terços de tot el genoma (Fig 3, A). Curiosament, vam observar graus moderats a forts de correlació entre les respostes positives d'unió a pèptids i els nivells sèrics de citocines aviat després de la infecció per SARS-CoV-2 (dies 10-60 després de l'aparició de la malaltia; vegeu la figura E10 al Repositori en línia a www.jacionline.org). Es va demostrar que el nombre de pèptids d'unió positius per a IgM estava associat amb els nivells sèrics d'IL-6 i IL-10; de la mateixa manera, la intensitat mitjana del senyal dels pèptids reactius totals i la dels pèptids d'unió a ORF1ab per a IgM van presentar associacions positives amb la producció d'IL-6 i IFN-g en mostres de sèrum. Aquestes dades suggereixen que els canvis en els nivells de citocines després de la infecció per SARS-CoV-2 poden influir en la magnitud i l'amplitud dels epítops reconeguts per les respostes humorals específiques de l'antigen. A partir de la identificació d'epítops positius, vam seleccionar a més els epítops més comuns que es van mantenir constantment reactius en més del 80% de les mostres de COVID-19 entre cadascun dels 3 grups de mostreig (anomenats epítops dominants i persistents). Els resultats van revelar que aquests epítops altament dominants capaços de mediar respostes immunitàries humorals a llarg termini es van localitzar a la poliproteïna SARS-CoV-2 ORF1ab i la proteïna S, amb més epítops reconeguts pels anticossos IgM (n 5 33) que Anticossos IgG (n 5 10) (Fig 3, B i Taula II; vegeu Fig E11 i Fig E12 al Repositori en línia a www.jacionline.org). La poliproteïna ORF1ab posseïa el nombre màxim d'epítops dominants que mediaven respostes a llarg termini, i els epítops estaven àmpliament distribuïts a les regions de proteïnes no estructurals (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, i nbsp 16 (Taula II). En particular, vam identificar un epítop immunodominant, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), que podria ser reconegut pels anticossos IgG i IgM del 100% dels pacients amb COVID-19, independentment dels punts de temps de mostreig de sèrum (Fig. 3, B i la taula II; vegeu la figura E13 i la figura E14 al repositori en línia). Aquest pèptid altament reactiu es troba a la regió de l'helicasa (nsp 13) de la poliproteïna ORF1ab, que és essencial per desenrotllar plantilles d'ARN de doble cadena durant la replicació del SARS-CoV-2.41 Entre els pèptids seleccionats d'ORF1ab, 2 pèptids immunodominants amb les intensitats de senyal mitjanes més altes reconegudes pels anticossos IgG, el número 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) i el número 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), es troben tots dos al nsp 13. Per a les respostes IgM, el pèptid 685 (ORF1ab, aa 249-263) a nsp 2 i el pèptid 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) a nsp 13 van presentar les intensitats d'unió més robustes (figura 3, B). Tenint en compte la variació dels senyals de referència (sers agrupats de donants sans) per a diferents pèptids (Fig 3, B), vam calcular més els canvis de plec de les intensitats del senyal pel que fa a cada pèptid clau, en relació amb el grup de control sa. Els resultats van mostrar que el pèptid 2073 (unió IgG) i el pèptid 1985 (unió IgM) situats a la regió nsp 13 van mantenir les intensitats d'unió de pèptids superiors (canvi de vegades) entre els sèrums dels pacients recollits fins a 180 a 220 dies (Fig E13 i Fig E14).

FIG 2. Cinètica de la producció de citocines en pacients amb COVID-19. A, Els nivells de producció de citocines en 55 mostres de sèrum recollides de 16 pacients amb COVID-19 durant la fase aguda i una etapa inicial de convalescència es van detectar mitjançant ELISA basat en microarrays de proteïnes (dies 1-15, n 5 11; dies 16-30, n 5 26; dies 31-61, n 5 18; donants sans, n 5 20). Cada punt representa una mostra de sèrum individual; les línies de punts denoten el límit de detecció. La significació estadística es va determinar mitjançant 1-way ANOVA amb comparacions múltiples de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01 i ****P < 0,0001. B, Canvi de doblega de cada nivell de producció de citocines en pacients amb COVID-19 que es mostra a (A) en comparació amb els valors mitjans de 20 mostres de donants sans. Cada columna indica una mostra de sèrum diferent recollida dels punts de temps indicats després de l'aparició dels símptomes; cada fila representa 1 citocina individual provada.

TAULA I. Característiques dels pacients amb COVID-19 i cohorts de mostres en mapes d'epítops

FIG 3. Reconeixement d'IgM i IgG d'epítops dominants que contribueixen a respostes d'anticossos a llarg termini en individus infectats per SARS-CoV-2. Anàlisi longitudinal del reconeixement sèric d'epítops en 19 individus amb COVID-19 mitjançant un microarray de pèptids que cobreix el proteoma del SARS-CoV-2. El valor de tall per a la resposta positiva de la unió de pèptids a les mostres de pacients (n 5 51) ​​es va establir com el doble de la intensitat del senyal dels sèrums agrupats de 20 donants sans. A, Recompte de pèptids i distribució de pèptids d'unió positius que es van detectar en 1 o més mostres recollides a 10-60 dies (n 5 18), 100-150 dies (n 5 18), i 180- 220 dies (n 5 15) després de l'inici de la malaltia. Els números indiquen el total d'epítops IgG i IgM identificats de cada ORF. B, intensitats de senyal d'epítops IgG i IgM dominants i persistents (eix x) que eren reactius de manera sostenible en més del 80% de les mostres dins dels 3 punts de temps de mostreig. Cada punt indica els sèrums agrupats de donants sans (a dalt) o una mostra de sèrum de pacient diferent recollida dels punts de temps indicats després de l'aparició dels símptomes. E, proteïna de l'embolcall.

TABLE II. Epitopes with >Taxa positiva del 80% en els 3 moments de mostreig

Els epítops dominants i persistents de la proteïna SARS-CoV-2 S es troben a les subunitats NTD i S2

Es van identificar un total de 4 epítops dominants i persistents de la proteïna SARSCoV-2 S: el pèptid 318 (S, aa 45-59) i el pèptid 356 (S, aa 197-211), que es troben dins de la regió NTD; pèptid 510 (S, aa 813-827), que cobreix el lloc d'escissió S2' i parts de la FP de la subunitat S2, i el pèptid 530 (S, aa 893-907), que es troba a la regió de connexió entre FP i la primera regió de repetició d'heptad de la subunitat S2 (Fig 3, B i Taula II). Entre aquests pèptids clau de la proteïna S que vam seleccionar, el pèptid 318, situat a l'NTD de la proteïna S, tenia la intensitat d'unió més robusta (canvi de plecs respecte al control; Fig E13 i Fig E14). Les anàlisis estructurals van revelar que aquests epítops estan totalment exposats a la superfície de la proteïna S monomèrica; tanmateix, alguns residus d'epítops dels pèptids 318, 356 i 530 s'oculten sota la superfície de la proteïna trimèrica S (Fig. 4, A i B), cosa que suggereix que tant les estructures del monòmer S com del trímer són reconegudes de manera eficient pel sistema immunitari de l'hoste sota certes condicions. circumstàncies. Per ser específics, 2 segments de bucle del pèptid 318 (aa 45-46 i aa 56-59) estan exposats a la proteïna trimèrica S, amb la cadena b central enterrada a l'interior; i la majoria dels residus del pèptid 356 són accessibles a la superfície, incloent una cadena b central (aa 203-209) i un segment de bucle (aa 210-211). El pèptid 510 conté un lloc de clivatge S2' i una hèlix central de FP, tots dos es presenten completament a la superfície de la proteïna S; Els residus del pèptid 530 són majoritàriament críptics, amb només una petita fracció del bucle (aa 893-895) exposada a la proteïna S trimèrica (Fig 4, C). L'anàlisi d'homologia de seqüències entre 7 coronavirus humans comuns va revelar que 2 epítops situats a la subunitat S2 (pèptids 510 i 530) comparteixen una alta identitat de seqüència amb altres coronavirus, cosa que suggereix una reactivitat creuada serològica dirigida a aquests epítops entre els coronavirus humans (Fig 4, D). La seqüència del pèptid 318 va mostrar una gran similitud amb SARSCoV, mentre que es va mostrar un baix nivell d'homologia de seqüència per al pèptid 356 entre els coronavirus, cosa que suggereix respostes d'anticossos específiques de SARS-CoV -2 dirigides a aquesta regió (figura 4, D). Tenint en compte les noves variants emergents i circulants del SARS-CoV-2 a nivell mundial, vam realitzar a més l'alineació de seqüències pel que fa als epítops clau de la proteïna S entre la soca primerenca del SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu{{52} }) i 5 variants de preocupació (Alpha, Beta, Gamma, Delta i Omicron), així com 2 variants d'interès (Lambda i Mu), segons la classificació de variants de virus de l'Organització Mundial de la Salut (actualitzada el 30 de novembre de 2021). ). Els resultats van mostrar que les seqüències d'aquests epítops dominants i persistents són gairebé idèntiques entre les variants analitzades, tret d'una única mutació N211I identificada a la nova variant d'Omicron (Fig 4, E). Aquestes dades indiquen que els anticossos generats per les soques primerenques del SARS-CoV-2 poden reconèixer constantment les variants circulants actuals i que aquests epítops dominants poden ser capaços de mediar respostes d'anticossos sostinguts a llarg termini sobre la infecció del SARS-CoV-2 variants. Per determinar encara més les característiques immunològiques dels epítops identificats a la proteïna S i per investigar més el valor potencial d'aquests epítops de proteïna S com a candidats a vacuna de pèptids, vam realitzar un estudi d'immunització amb pèptids seleccionats. Els ratolins BALB/c es van inocular 3 vegades amb cada pèptid en presència d'alum i adjuvants CpG (Fig 4, F). Entre els 4 pèptids seleccionats, la vacunació amb el pèptid 356 va provocar anticossos específics de l'antigen després de la segona i la tercera dosi (Fig 4, G). Els resultats de l'assaig de neutralització sèrica van revelar que la immunització amb pèptids lineals no va generar nivells significatius d'anticossos neutralitzants contra SARS-CoV -2 (Fig 4, H), cosa que suggereix que aquests pèptids lineals funcionen malament per induir respostes d'anticossos neutralitzants robustes.

La proteïna N del SARS-CoV-2 no té la majoria dels epítops reactius que median respostes d'anticossos duradores després de la infecció viral

Diversos estudis han dilucidat la potent antigenicitat de la proteïna SARS-CoV-2 N.4,11,12 No obstant això, no hem pogut identificar epítops dominants i persistents situats a la proteïna N sobre la base dels criteris de selecció actuals. (per sobre del 80% de positiu en els 3 moments de mostreig). Per a l'avaluació longitudinal dels perfils d'epítops de la proteïna N en individus amb COVID-19, vam dur a terme una segona ronda de cribratge d'epítops que es va basar en les dades obtingudes del microarray de pèptids per a la selecció d'epítops subdominants que es van mantenir constantment reactius. en més del 60% de les mostres de COVID-19 per a cadascun dels 3 punts de temps de mostreig (anomenats epítops subdominants i persistents). Es van identificar un total de 4 epítops subdominants i persistents de la proteïna SARS-CoV-2 N, entre els quals el pèptid 2455 (N, aa 213-227) va presentar reactivitat tant amb anticossos IgG com IgM en COVID{{16} }} pacients, amb nivells relativament més alts d'intensitat de senyal (Fig 5, A i B, i vegeu la taula E4 al Repositori en línia a www.jacionline.org). Els 2 pèptids superposats, el pèptid 2455 (N, aa 213-227) i el pèptid 2456 (N, aa 217-231), es troben a la regió enllaçadora rica en Ser/Arg entre el domini d'unió a l'ARN N-terminal. i domini de dimerització C-terminal de la proteïna N. El pèptid 2482 (N, aa 321-335) i el pèptid 2491 (N, aa 357-371) es troben totalment o parcialment dins del domini de dimerització de la proteïna N (taula E4). A causa de la manca d'estructures 3-D pel que fa a la conformació intacta de la proteïna N, només vam realitzar anàlisis estructurals de 2 epítops identificats a l'estructura dimèrica del domini de dimerització C-terminal. Els residus del pèptid 2482 formen 2 cadenes b que estan disposades de manera antiparal·lela a les interfícies de dimerització, mentre que aa 357-364 del pèptid 2491 formen estructures basades en hèlix que es troben als extrems oposats del dímer (Fig 5, C) . L'alineació de seqüències entre el primer SARS-CoV-2 (soca Wuhan-Hu{-1) i 7 variants emergents va revelar a més que les seqüències d'aquests epítops subdominants i persistents a la proteïna N són gairebé idèntiques entre les variants circulants actuals, amb un una única substitució G215C del pèptid 2455 que es produeix a la variant Delta i una única mutació G214C del pèptid 2455 identificada a la variant Lambda, cosa que suggereix que els anticossos dirigits a aquests pèptids reconeixen potencialment l'antigen de les variants emergents del SARS-CoV-2 (Fig 5, D). ).

FIG 4. Epítops dominants de la proteïna espiga del SARS-CoV-2 en termes de mediació de respostes immunitàries humorals duradores. A i B, ubicacions dels epítops dominants i persistents a les estructures 3-D de la proteïna S monomèrica (A) i trimèrica (B) (PDB ID: 6VXX). Els epítops es destaquen en verd (pèptid 356, aa 197-211), vermell (pèptid 318, aa 45-59), blau (pèptid 510, aa 813-827) i violeta (pèptid 530, aa). 893-907), respectivament. Els tres monòmers S en conformació tancada es representen en gris, rosa i cian, respectivament. C, Anàlisi detallada de l'estructura dels epítops dominants a la proteïna S SARS-CoV-2 a l'estat tancat del trímer S (ID del PDB: 6VXX). D, Alineació de seqüències d'epítops identificats entre coronavirus humans comuns. Els residus d'epítops que es conserven entre el SARS-CoV-2 i altres coronavirus humans estan ombrejats en gris. E, anàlisi de conservació d'epítops del primer SARS-CoV-2 (cep Wuhan-Hu-1) i 7 variants emergents. Els punts negres representen residus idèntics entre la soca Wuhan-Hu-1 i la indicada.

FIG 5. Els epítops subdominants situats a la proteïna nucleocàpsida SARS-CoV-2 són capaços de mediar respostes d'anticossos persistents. Freqüències de reconeixement A, IgG i IgM de pèptids subdominants (reactius de manera duradora en més del 60% de les mostres) entre mostres de sèrum de pacients recollides en diversos moments després de l'inici de la malaltia. B, cinètica de la intensitat del senyal dels epítops subdominants identificats al llarg del temps. Cada punt representa una mostra de sèrum de pacient diferent obtinguda de pacients amb COVID-19 en els moments indicats després de l'aparició dels símptomes. Les línies horitzontals de punts indiquen els valors de tall de resposta positiva per a cada pèptid. C, Anàlisi detallada de l'estructura dels epítops del domini de dimerització C-terminal de la proteïna N (PDB ID: 6YUN). Els epítops estan marcats en blau (pèptid 2482, aa 321-335) ​​i marró (pèptid 2491, aa 357-364). Les 2 estructures monomèriques es representen en gris i cian, respectivament. D, Anàlisi de l'alineació de la seqüència dels epítops de proteïnes N identificats entre els primers SARS-CoV-2 (cep Wuhan-Hu{-1) i 7 variants emergents. Els punts negres denoten seqüències idèntiques entre la soca Wuhan-Hu-1 i la variant indicada. Els canvis en la seqüència d'aminoàcids es destaquen en vermell.

FIG 6. Epítops de revestiment amb alta intensitat d'unió i freqüències reactives que disminueixen al llarg del temps, reconeguts pels individus infectats per SARS-CoV-2. A i B, anàlisi longitudinal i distribució dels pèptids identificats que presenten una intensitat de senyal d'unió elevada (per sobre de la mitjana 1 SD de les intensitats del senyal de totes les mostres provades), però que disminueixen la taxa positiva amb el temps. La freqüència de reconeixement (A) i la intensitat del senyal (B) dels epítops es van representar amb 3 punts de temps de mostreig després de l'aparició dels símptomes. Cada punt de (B) representa una mostra de sèrum de pacient individual recollida en els punts de temps indicats després de l'aparició dels símptomes; les línies horitzontals de punts indiquen els valors de tall de positivitat per a cada pèptid. L'anàlisi de significació estadística es va realitzar a partir del programari Limma of R v3.6.3. *P < 0,05 i **P < 0,01. C, Comparacions d'ubicació i seqüència de 2 epítops adjacents, pèptid 510 (dominant i persistent) i pèptid 511 (alta intensitat de senyal i positivitat decreixent amb el temps), a l'estructura de la proteïna SARS-CoV-2 S (PDB ID: 6ZGI) . Les regions superposades entre els 2 epítops es destaquen en verd; les seqüències úniques s'etiqueten en vermell i blau.

L'anàlisi serològica longitudinal identifica epítops amb una intensitat de senyal alta però que disminueixen la reactivitat amb el temps

A més dels epítops altament reactius seleccionats que són responsables de les respostes immunes humorals sostingudes esmentades anteriorment, vam identificar i caracteritzar un panell de 9 pèptids positius que mostraven intensitats d'unió robustes (per sobre de la mitjana 1 SD de les intensitats del senyal de totes les mostres provades) amb una tendència de reactivitat decreixent (canvis de taxa positiva per sobre del 20%) entre les mostres de sèrum de pacients amb COVID-19 al llarg del temps, d'acord amb una tendència general de disminució de les respostes immunes humorals. Aquests epítops es situen dins dels 3 antígens dominants: proteïnes ORF1ab, S i N (Fig 6, A; i vegeu la taula E5 al Repositori en línia a www.jacionline.org). A més, es van observar reduccions significatives de les intensitats del senyal de 4 pèptids de les proteïnes ORF1ab (pèptids 784-IgG, 1617-IgM i 1986-IgM) i N (pèptid 2457-IgG) entre mostres d'un primer període de temps de mostreig (dies 10-60 després de l'aparició de la malaltia) i la fase posterior dels punts de mostreig (dies 100-150 o dies 180-220 després de l'aparició dels símptomes) (figura 6) , B). Notablement, malgrat que es superposen en gran mesura entre si, 2 pèptids del pèptid de proteïna S 510 (dominant i persistent; Fig 3, B) i el pèptid 511 (alta intensitat de senyal i taxa positiva decreixent amb el temps; Fig 6, A) van mostrar diferents patrons de reactivitat entre les mostres de sèrum dels pacients al llarg del temps. L'anàlisi de la seqüència i la ubicació va indicar que el pèptid 510 conté un lloc de clivatge S2' i aminoàcids addicionals de 813-SKRS-816, mentre que el pèptid 511 es troba completament dins de la FP amb 828-LADA{{29 estès. }} residus que estan totalment exposats a la superfície de la proteïna S trimèrica (Fig 6, C). Aquests resultats van revelar noves característiques dels epítops que, en última instància, poden contribuir a una immunitat humoral més duradora i més forta contra el SARS-CoV-2.

DISCUSSIÓ

Una caracterització sistemàtica de les respostes immunes a llarg termini a la infecció per SARS-CoV-2 és fonamental per al desenvolupament de diagnòstics millorats, intervencions terapèutiques efectives i vacunes. En l'estudi actual, hem realitzat una anàlisi longitudinal exhaustiva de pacients amb COVID-19 durant un seguiment de 180 a 220 dies, mostrant respostes immunes humorals persistents i producció de citocines activada després d'una infecció viral.

De manera significativa, aprofitant el microarray basat en pèptids que abasta el proteoma del SARS-CoV-2, vam revelar encara més la cinètica del reconeixement d'epítops i vam identificar un panell d'epítops dominants capaços de mediar la immunitat humoral a llarg termini. Les troballes que informem aquí sobre la longevitat de les respostes immunes humorals després de la infecció per SARS-CoV-2 confirmen algunes dades publicades anteriorment5,10,12,13,42, però les amplien mitjançant la realització de perfils serològics profunds i cribratge d'epítops mitjançant mostres de sèrum longitudinals. d'individus amb COVID-19 mitjançant l'enfocament de microarrays a tot el proteoma. En aquest estudi, hem identificat 4 epítops dominants (pèptids 318, 356, 510 i 530) dins de la proteïna SARS-CoV-2 S que era capaç de reaccionar de manera persistent amb més d'un 80% de pacients amb COVID-19. mostres provades, fins a 180 a 220 dies després de l'aparició dels símptomes. El pèptid 510 (S, aa 813-827), que inclou el lloc de clivatge S2 i la FP de la subunitat S2, s'ha identificat habitualment en estudis anteriors d'altres grups.26,28,32-34 Les anàlisis funcionals van indicar anticossos dirigir-se a aquesta regió pot presentar una potència de neutralització limitada contra SARS-CoV -226,33 tot i estar molt exposat a la superfície de la proteïna S (Fig 4, AC). En el cas del pèptid 530 (S, aa 893-907), que es col·loca entre la FP i la primera regió de repetició heptada de la subunitat S2, els residus generalment s'enterren dins de l'estructura trimèrica de la proteïna S, la qual cosa fa que difícil d'accedir mitjançant anticossos neutralitzants robusts contra SARS-CoV -2 (figura 4, AC). A més, també es van seleccionar 2 pèptids dirigits per S1-NTD que podrien mediar les respostes d'anticossos a llarg termini del SARS-CoV-2. Les anàlisis sobre la seqüència i la ubicació del pèptid van indicar que els residus d'aquests 2 pèptids —pèptid 318 (S, aa 45-59) i pèptid 356 (S, aa 197-211)—estan molt a prop dels epítops reconeguts. per anticossos que milloren la infecció23,25 però a part dels llocs clau d'anticossos neutralitzants altament potents dirigits a NTD de la subunitat S1,16,19,43, cosa que suggereix la possibilitat de reconeixement d'epítops per anticossos no neutralitzants cap a aquests 2 pèptids identificats. A més dels detalls esmentats anteriorment, la immunització del ratolí amb pèptids seleccionats va indicar encara més la baixa eficàcia d'aquests pèptids lineals del domini d'unió no receptors per induir respostes d'anticossos neutralitzants robustes (Fig 4, G). Col·lectivament, aquestes dades suggereixen que els epítops lineals dominants que medien les respostes immunes humorals a llarg termini sobre la infecció per SARS-CoV-2 probablement indueixen anticossos amb potència neutralitzant nula o limitada. Una comprensió més completa del panorama d'epítops dels anticossos SARS-CoV-2, especialment els epítops dirigits a la proteïna S, proporciona una nova visió de la dissecció funcional dels anticossos, que facilita encara més el disseny innovador i racional de vacunes. Els anticossos neutralitzants confereixen protecció per eliminar les infeccions víriques, mentre que els anticossos no neutralitzants poden tenir un paper beneficiós, neutral o fins i tot perjudicial durant l'eliminació del virus. Els anticossos no neutralitzants proporcionen protecció addicional in vivo mitjançant una sèrie de funcions efectores mediades per Fc en el context de la fagocitosi dependent d'anticossos i la citotoxicitat dependent d'anticossos. En canvi, alguns estudis han proposat la possibilitat d'un paper patogènic dels anticossos no neutralitzants en la infecció per coronavirus. Estudis anteriors que utilitzaven diversos tipus de candidats a vacunes per SARS-CoV i MERS-CoV van observar una immunopatologia millorada en animals petits vacunats i primats no humans després del repte del virus.24,44-50 Més recentment, estudis de 2 grups van informar que la no neutralització Els anticossos dirigits a NTD de la proteïna SARS-CoV-2 S eren capaços de millorar la infecció viral in vitro mitjançant mecanismes independents del receptor Fcg,23,25, tot i que s'ha demostrat que els anticossos que milloren la infecció administrats de manera passiva en models animals eren protectors contra el SARS. - Infecció per CoV-2 in vivo. Tenint en compte els papers controvertits dels anticossos durant la infecció per coronavirus, es necessiten més investigacions per validar el paper potencial dels anticossos en el reconeixement d'aquests epítops dominants i persistents en la lluita contra la infecció viral in vivo. La següent etapa del disseny racional de la vacuna contra el SARS-CoV-2 es podria concebre provocant anticossos neutralitzants molt potents i anticossos protectors no neutralitzants, juntament amb una reducció de la presentació d'epítops que milloren la infecció o epítops immunodominants que no tenen efectes beneficiosos. Tot i que diversos estudis anteriors només s'han centrat en la proteïna S del SARS-CoV-2 amb l'objectiu de delimitar les funcions d'anticossos pel que fa a la neutralització, vam realitzar un mapa complet d'epítops a tot el proteoma i vam identificar un panell d'epítops dins de la poliproteïna ORF1ab que va ser reconegut constantment per una proporció elevada de mostres de sèrum de pacients al llarg del temps. Tot i que aquests pèptids dirigits per ORF1ab distribuïts a les múltiples proteïnes no estructurals poden no provocar anticossos funcionals dirigits al virió SARS-CoV-2, podrien ser aplicables com a eina de diagnòstic per ajudar a diferenciar la infecció natural de la vacunació. Amb l'augment del nombre de receptors de vacunes a tot el món, les proves serològiques actuals basades en la proteïna S i la proteïna N s'enfronten a reptes com a enfocament eficaç per ajudar a les proves moleculars per a la detecció de la infecció per SARS-CoV-2 i també per a la Determinació de l'estat immunològic després d'una infecció viral. Aprofitant els pèptids més comuns i persistentment reactius dins de l'ORF1ab entre els individus infectats amb COVID{101}}, el diagnòstic serològic de la infecció natural es realitzarà sense tenir en compte l'estat de vacunació que impliqui proteïna S basada en el domini d'unió del receptor. enfocaments de vacunes basats en virus i inactivats. Es necessiten estudis futurs per avaluar la reactivitat, la sensibilitat i l'especificitat dels pèptids ORF1ab identificats en cohorts més grans que inclouen tant individus infectats per SARSCoV-2 com receptors de vacunes. A més, caldrà una avaluació addicional de l'eficiència de detecció mitjançant estratègies de combinació de pèptids múltiples per superar la menor sensibilitat dels pèptids en comparació amb la proteïna de longitud completa i la possible reactivitat creuada entre els coronavirus humans comuns. Les principals limitacions del nostre estudi són les relativament poques mostres obtingudes d'una mida de cohort de pacients petita i la majoria dels participants van patir malalties COVID{106}} no greus. Aquests poden limitar algunes de les nostres conclusions pel que fa a la freqüència de resposta positiva i la magnitud de les respostes immunes, que poden variar segons la gravetat de la malaltia. No obstant això, les dades presentades en aquest estudi proporcionen informació valuosa sobre la cinètica de les respostes immunitàries al llarg del temps després de la infecció per SARS-CoV-2 i les característiques dels epítops dominants capaços de mediar una immunitat humoral sostinguda en persones amb COVID-19. En conjunt, aquestes troballes ofereixen una comprensió més profunda de la longevitat de la immunitat natural induïda per una infecció viral i tenen àmplies implicacions per a estratègies de vacunació innovadores i enfocaments de diagnòstic millorats.

REFERÈNCIES

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Caracterització genòmica i epidemiologia del nou coronavirus del 2019: implicacions per als orígens del virus i la unió al receptor. Lancet 2020;395:565-74.

2. Organització Mundial de la Salut (OMS). Tauler de control del coronavirus (COVID-19) de l'OMS, 2021. Disponible a: https://COVID19.who.int/. Accés el 30 de novembre de 2021.

3. Wu Z, McGoogan JM. Característiques i lliçons importants del brot de la malaltia del coronavirus 2019 (COVID-19) a la Xina: resum d'un informe de 72.314 casos del Centre xinès per al control i la prevenció de malalties. JAMA 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Immunitat adaptativa específica de l'antigen al SARS-CoV-2 en COVID-19 agut i associacions amb l'edat i la gravetat de la malaltia. Cel·la 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et al. La infecció per SARS-CoV-2 indueix respostes immunes humorals sostingudes en pacients convalescents després de COVID-19 simptomàtic. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, et al. Respostes d'anticossos al SARS-CoV-2 en pacients amb COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, et al. IgA domina la resposta primerenca d'anticossos neutralitzants al SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, et al. Cèl·lules auxiliars T fol·liculars circulants específiques d'espiga i respostes d'anticossos neutralitzants creuats en individus convalescents de COVID-19. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, et al. Les respostes d'anticossos neutralitzants del SARS-CoV-2 són més robustes en pacients amb malaltia greu. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Cinètica i correlacions de la resposta d'anticossos neutralitzants a la infecció per SARSCoV-2 en humans. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, et al. Disminució dels nivells d'anticossos neutralitzants contra SARS-CoV-2 en pacients convalescents amb COVID-19 un any després de l'aparició dels símptomes. Front Immunol 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Ample neutralitzant millorat de manera natural contra el SARS-CoV-2 un any després de la infecció. Nature 2021;595:426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, et al. La memòria immunològica del SARS-CoV-2 s'avalua fins a 8 mesos després de la infecció. Science 2021;371:eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Maduració i persistència de la resposta de cèl·lules B de memòria anti-SARS-CoV-2. Cèl·lula 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, et al. Anticossos neutralitzants humans provocats per la infecció per SARS-CoV-2. Nature 2020;584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, et al. Potents anticossos neutralitzants contra múltiples epítops a l'espiga del SARS-CoV-2. Nature 2020;584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et al. Anticossos humans potencialment neutralitzadors i protectors contra el SARS-CoV-2. Natura 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, et al. Dinàmica conformacional de la glicoproteïna d'espiga trimèrica del SARS-CoV-2 en complex amb el receptor ACE2 revelat per crio-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. El mapatge antigènic del domini N-terminal revela un lloc de vulnerabilitat per SARSCoV-2. Cel·la 2021;184:2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, et al. Base estructural per a una àmplia neutralització del coronavirus. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, et al. Els anticossos humans ultrapotents protegeixen contra el desafiament del SARS-CoV-2 mitjançant múltiples mecanismes. Science 2020;370:950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Neutralització creuada del SARS-CoV-2 per un anticòs monoclonal humà SARS-CoV. Nature 2020;583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. Un lloc que millora la infectivitat a la proteïna d'espiga SARS-CoV-2 dirigida pels anticossos. Cèl·lula 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et al. L'IgG anti-spike causa una lesió pulmonar aguda greu en distorsionar les respostes dels macròfags durant la infecció aguda per SARS-CoV. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, et al. Funcions in vitro i in vivo dels anticossos que milloren i neutralitzen la infecció per SARS-CoV-2. Cel·la 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et al. Dos epítops lineals de la proteïna espiga SARS-CoV-2 provoquen anticossos neutralitzants en pacients amb COVID-19. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, et al. Extracció d'epítops a la proteïna de punta de SARS-CoV-2 de pacients amb COVID-19. Res cel·lular 2020;30:702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et al. El perfil d'epítops revela signatures d'unió de la resposta immune al SARS-CoV-2 en la infecció natural i la reactivitat creuada amb els CoV humans endèmics. Cell Rep 2021;35: 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y, et al. El perfil de l'epítop viral dels pacients amb COVID-19 revela reactivitat creuada i correlacions de gravetat. Science 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan, una canalització de diagnòstic múltiple, analitza sèrums humans per a antígens SARS-CoV-2- 2. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Mapeig d'epítops d'alta resolució i caracterització d'anticossos SARS-CoV-2 en grans cohorts de subjectes amb COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, et al. Avaluació sistemàtica de les respostes d'IgG als pèptids derivats de la proteïna d'espiga del SARS-CoV-2 per controlar pacients amb COVID-19. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, et al. Paisatge d'epítop lineal de la proteïna espiga SARS-CoV-2 construïda a partir de 1.051 pacients amb COVID{-19. Cell Rep 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, et al. Microarray de proteoma SARS-CoV-2 per mapejar les interaccions d'anticossos COVID-19 amb resolució d'aminoàcids. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, et al. Mapatge funcional dels epítops lineals de cèl·lules B del SARS-CoV-2 a la població convalescent de COVID{-19. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. Comissió Nacional de Salut i Administració Nacional de Medicina Tradicional Xinesa. Protocol de diagnòstic i tractament de la pneumònia del nou coronavirus (versió de prova 7). Chin Med J (anglès) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, et al. El perfil longitudinal del repertori d'autoanticossos sèrics identifica biomarcadors associats a la cirurgia en l'adenocarcinoma pulmonar. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et al. Respostes d'anticossos a SARSCoV-2 en pacients amb nova malaltia per coronavirus 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al. Les anàlisis longitudinals revelen errors immunològics en COVID-19 greu. Nature 2020;584: 463-9.

40. Moore JB, juny CH. Síndrome d'alliberament de citocines en COVID greu-19. Science 2020;368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et al. Bases estructurals per a l'acoblament helicasa-polimerasa en el complex de replicació-transcripció del SARS-CoV-2. Cel·la 2020;182:1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Els anticossos neutralitzadors robusts de la infecció per SARS-CoV-2 persisteixen durant mesos. Ciència 2020; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et al. Un anticòs humà neutralitzant s'uneix al domini N-terminal de la proteïna espiga del SARS-CoV-2. Science 2020;369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et al. La immunització amb vacunes contra el coronavirus SARS condueix a una immunopatologia pulmonar en desafiament amb el virus SARS. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et al. Una vacuna contra el coronavirus de la síndrome respiratòria aguda severa doble inactivada proporciona una protecció incompleta als ratolins i indueix una resposta pulmonar proinflamatòria eosinofílica augmentada després del desafiament. J Virol 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Immunització amb el virus de la vacunia modificat La vacuna recombinant basada en Ankara contra la síndrome respiratòria aguda severa s'associa amb una hepatitis millorada en fures. J Virol 2004;78:12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. La immunització prèvia amb la proteïna nucleocàpsida del coronavirus (SARS-CoV) associada a la síndrome respiratòria aguda severa (SARS) provoca pneumònia greu en ratolins infectats amb SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, et al. Eficàcia de la vacuna en ratolins senescents desafiats amb variants epidèmiques i zoonòtiques de SARS-CoV recombinants. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, et al. Els epítops de coronavirus SARS immunodominants en humans van provocar efectes tant de millora com de neutralització sobre la infecció en primats no humans. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, et al. La immunització amb la vacuna inactivada contra el coronavirus de la síndrome respiratòria de l'Orient Mitjà condueix a una immunopatologia pulmonar en desafiament amb virus vius. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.