La dieta alta en fòsfor indueix la regulació de l'expressió de l'ARNm Bmp2 i Spp1 al ronyó de rata

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Per aclarir el mecanisme del desenvolupament de la nefrocalcinosi induïda per una dieta alta en fòsfor (P), ens vam centrar en proteïnes relacionades amb l'os com la proteïna morfogenètica òssia 2 i l'osteopontina. Aquest estudi va investigar els efectes d'una dieta alta en P sobre l'expressió d'ARNm de Bmp2 i Spp1 a la rata.ronyó. Les rates Wistar es van dividir en dos grups i es van alimentar amb una dieta control (grup control) o amb una dieta alta en P (grup alt en P).RonyóLes concentracions de calci i P van augmentar significativament en el grup d'alt P en comparació amb el grup control. L'expressió d'ARNm tant de Bmp2 com de Spp1 va augmentar significativament en el grup d'alta P en comparació amb el grup control. Aquests resultats indiquen que una dieta alta en P indueix una regulació positiva de l'ARNm de Bmp2 i Spp1 alronyó.

Paraules clau: dieta alta en fòsfor, nefrocalcinosi, Bmp2, Spp1,ronyó, rata

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:emily.li@wecistanche.com

cistanche per tractar la malaltia renal

Introducció

La nefrocalcinosi és un trastorn caracteritzat per dipòsits de calci (Ca) al parènquima renal. El fòsfor dietètic (P), en particular, és un factor fonamental en el desenvolupament d'aquest trastorn. S'ha demostrat que l'administració d'una dieta alta en P provoca un augment de la concentració de Ca alronyói dipòsits de Ca al parènquima renal1-6）. Tot i que l'efecte d'una dieta alta en P en el desenvolupament de la nefrocalcinosi ha estat el focus d'estudi en curs, se sap poc sobre el mecanisme responsable del desenvolupament d'aquest trastorn. Per tant, cal una resolució oportuna d'aquest problema.

Vam informar que després d'un examen histològic mitjançant microscòpia electrònica de transmissió, es van observar cristalls en forma d'agulla semblants a la hidroxiapatita als túbuls renals de rates alimentades amb una dieta alta en P6, 7). La microanàlisi de raigs X va indicar que els dipòsits de Ca induïts per una dieta alta en P es componen principalment de Ca i P7). Aquests resultats van revelar que els dipòsits de Ca induïts per una dieta alta en P són una forma d'hidroxiapatita. A partir d'aquesta troballa, postulem que el desenvolupament de la nefrocalcinosi està controlat per un mecanisme similar al de la formació òssia. Per tant, el present estudi es va centrar en proteïnes associades als ossos com la proteïna morfogenètica òssia 2 (BMP2). BMP2 és un factor osteogènic que presenta activitat induïdora de l'osteogènesi8, 9). Cal destacar que BMP2 es va identificar com un factor induïdor ectòpicosformació10, 11). Així, vam plantejar la hipòtesi que si BMP2 juga un paper important en el desenvolupament de la nefrocalcinosi, l'expressió d'aquesta proteïna en elronyóestaria regulada per una dieta alta en P. El present estudi tenia com a objectiu determinar si una dieta alta en P afecta l'expressió d'ARNm de Bmp2 a laronyó.

Mentrestant, el nostre estudi anterior va informar que una dieta alta en P augmenta l'expressió d'osteopontina (OPN) als túbuls renals mitjançant anàlisi immunohistoquímica, cosa que suggereix que l'OPN pot estar implicada en el desenvolupament de dipòsits de Ca induït per una dieta alta en P12). Per tant, vam investigar els canvis en l'expressió de l'ARNm de Spp1 alronyótambé.

Els resultats del present estudi poden proporcionar informació valuosa sobre el mecanisme responsable del desenvolupament de la nefrocalcinosi induïda per una dieta alta en P.

Materials i mètodes

Animals i dietes.

El present estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ús Animal de la Universitat d'Agricultura de Tòquio i tots els animals es van mantenir d'acord amb les directrius de la universitat per a la cura i l'ús d'animals de laboratori (aprovació núm. 300049).

És important tenir en compte que les rates femelles desenvolupen nefrocalcinosi més fàcilment que les rates mascles13, 14). A més, vam informar que una dieta alta en P augmenta l'expressió d'OPN als túbuls renals de rates femelles12). El present estudi va utilitzar rates femelles com a animals experimentals. Les rates Wistar femelles de quatre setmanes (Clea Japó, Tòquio, Japó) es van allotjar en gàbies individuals de malla de filferro d'acer inoxidable. Durant el període experimental, les gàbies es van situar en una habitació amb il·luminació controlada sota una llum de 12-h: cicle fosc (llum, 0800-2000 h), temperatura de 22 ± 1 grau i humitat relativa de 60 per cent a 65 per cent.

La composició de les dietes experimentals es mostra aTable 1. Es van preparar dietes experimentals en referència a la dieta AIN{{0}}G15). Les dietes experimentals contenien dues concentracions diferents de P (dieta control, 0,3 per cent; dieta alta en P, 1,5 per cent). La concentració de P a la dieta alta en P es va establir en l'1,5 per cent, ja que els nostres estudis anteriors van observar que una concentració de P en la dieta de l'1,5 per cent indueix

nefrocalcinosi severa6, 7, 12, 14) i alta expressió OPN12). Totes les dietes experimentals tenien la mateixa concentració de Ca (0,5 per cent). Les concentracions de P i Ca, determinades per l'anàlisi de les dietes experimentals, es mostren aTable 1. Abans de l'inici de l'estudi, totes les rates es van aclimatar durant 7 dies, temps durant els quals se'ls va donar accés gratuït a la dieta de control i aigua desionitzada. Després del període d'aclimatació, les rates es van dividir aleatòriament en dos grups amb pes corporals mitjans similars i es van alimentar amb la dieta control (grup control) o amb la dieta alta en P (grup alt en P) durant 14 dies. Les rates van tenir accés gratuït a les dietes experimentals assignades i a l'aigua desionitzada durant tot el període experimental. Al final del període experimental, les rates van ser sacrificades per injecció intraperitoneal de la barreja anestèsica (medetomidina, midazolam i butorfanol) i sang ironyóes van recollir mostres per analitzar-les. Es van centrifugar mostres de sang i es van utilitzar sobrenedants com a mostres de sèrum. Es van extirpar els ronyons i es va descartar la càpsula renal. El sèrum ironyóles mostres es van emmagatzemar a -80 graus fins que es van necessitar per a l'anàlisi. El ronyó dret es va utilitzar per a l'anàlisi quantitativa de l'ARNm Bmp2 i Spp1, i l'esquerraronyóes va utilitzar per a l'anàlisi de les concentracions de Ca i P.

Anàlisi de minerals.

Mostres de les dietes experimentals ironyonses van cendre a 550 graus durant 48 h en un forn de mufla i es van extreure minerals en 1 mol/L de HCl per a l'anàlisi. Concentracions de Ca a les dietes experimentals ironyonses van determinar mitjançant espectrofotometria d'absorció atòmica16). Concentracions de P a les dietes experimentals ironyonses van analitzar mitjançant el mètode de Gomori17）.

Anàlisi quantitativa de l'ARNm de Bmp2 i Spp1.

L'ARN total es va aïllar del ronyó homogeneïtzat mitjançant el reactiu TRIzol (Life Technologies, CA, EUA) segons les especificacions del fabricant. La quantitat i la puresa de l'ARN es van avaluar mitjançant un NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). L'ADNc es va sintetitzar mitjançant el SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix per a qRT-PCR (Life Technologies) i després es va sotmetre a RT-PCR quantitativa en temps real mitjançant SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Es van utilitzar cebadors específics18-20） per a l'anàlisi de Bmp2 (en endavant, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; invers, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA{-3'), Spp1 (en endavant, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; al revés, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') i Gapdh (davant, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; al revés, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). La reacció de PCR en temps real es va realitzar mitjançant un sistema de PCR en temps real StepOne (Applied Biosystems, CA, EUA) i els nivells d'expressió d'ARNm es van normalitzar als nivells d'ARNm de Gapdh. El valor del grup control es va considerar 1,00.

Anàlisi estadística.

Els resultats es presenten com a mitjans ± SEM per a cada grup de 6 rates. Després de realitzar una prova F per determinar l'homogeneïtat de les variàncies, es va utilitzar una prova t de Student per determinar diferències significatives entre els dos grups. Si l'homogeneïtat de les variàncies no era igual, es va utilitzar la prova t de Welch en lloc de la prova t de Student. Les diferències es van considerar significatives a p ＜ 0,05

Resultats

Anàlisi de pes corporal, ingesta d'aliments i sèrum.

El pes corporal final i la ingesta d'aliments es van reduir significativament en el grup d'alta P en comparació amb el grup control (Taula 2). Ronyópes i concentracions de minerals.RonyóEls pesos secs i humits van augmentar significativament en el grup de P alt en comparació amb el grup control (Taula 3). RonyóLes concentracions de Ca i P també van augmentar significativament en el grup d'alt P en comparació amb el grup control.

Expressió d'ARNm de Bmp2 i Spp1 renal.

Els nivells d'ARNm de Bmp2 al grup d'alta P es van augmentar significativament en comparació amb el grup control (Fig.1A). L'expressió d'ARNm de Spp1 també va augmentar significativament en el grup d'alta P en comparació amb el grup control (Fig. 1B).

Discussió

Un dels efectes fisiològics coneguts d'una dieta alta en P és el desenvolupament de la nefrocalcinosi. En el present estudi, les concentracions renals de Ca i P van augmentar en el grup d'alt P en comparació amb el grup control, cosa que és coherent amb els resultats dels estudis anteriors 1-6）. Estudis anteriors van informar que les puntuacions histològiques de la nefrocalcinosi estaven correlacionades positivament amb les concentracions de Ca i P del ronyó4, 21). Així, tot i que en el present estudi no es va realitzar cap observació histològica del ronyó, l'augment de les concentracions de Ca i P del ronyó indiquen que la nefrocalcinosi va ser induïda per la dieta alta en P.

Com que els dipòsits de Ca induïts per una dieta alta en P es creu que són una forma d'hidroxiapatita6, 7), vam plantejar la hipòtesi que el desenvolupament de la nefrocalcinosi està controlat per un mecanisme similar al de l'osteogènesi. Així, vam examinar els efectes d'una dieta alta en P sobre l'expressió d'ARNm de Bmp2 al ronyó. Els resultats

va demostrar que l'expressió d'ARNm de Bmp2 renal va augmentar en el grup d'alta P i que una dieta alta en P indueix la regulació de l'expressió d'ARNm de Bmp2 al ronyó. Aquesta troballa pot ajudar a explicar el mecanisme de desenvolupament de la nefrocalcinosi induït per una dieta alta en P. Tot i que no hi ha proves definitives que donin suport a la nostra hipòtesi, una possibilitat és que l'expressió dels factors de transcripció osteogènics estigui elevada a les regions calcificades del ronyó. BMP2 indueix la diferenciació dels osteoblasts i la formació òssia mitjançant la regulació de factors de transcripció osteogènics com Osterix, Runx2 i Msx28, 9）; així, BMP2 pot promoure la nefrocalcinosi mitjançant la regulació d'aquests factors de transcripció osteogènics. Actualment, el paper detallat de BMP2 en el desenvolupament de la nefrocalcinosi encara no està clar. A més, com que només es va mesurar l'expressió d'ARNm de Bmp2 en aquest estudi, no se sap si hi ha una diferència en l'expressió de la proteïna BMP2. Tanmateix, els nostres resultats suggereixen un possible mecanisme pel qual les alteracions en l'expressió de BMP2 tenen un paper potent en la patogènesi de la nefrocalcinosi induïda per la dieta alta en P.

El present estudi es va centrar en l'expressió d'ARNm Spp1 a més de l'expressió d'ARNm Bmp2. El nostre estudi anterior amb anàlisi immunohistoquímica va indicar nivells elevats d'expressió d'OPN en els túbuls renals de rates alimentades amb una dieta alta en P12). El present estudi va trobar que l'expressió d'ARNm de Spp1 va augmentar aproximadament 10- vegades en el grup d'alta P. Els resultats dels estudis actuals i anteriors revelen que una dieta alta en P indueix l'expressió d'OPN al ronyó. D'altra banda, altres investigadors han demostrat que l'OPN com a matriu de càlculs és un factor important en la formació de càlculs urinaris22, 23）; per tant, el nostre informe anterior va suggerir que l'OPN podria tenir un paper com a component de la matriu en la formació de dipòsits de Ca induïts per una dieta alta en P12). Tanmateix, Paloian et al. va informar recentment que l'OPN juga un paper en la prevenció de la nefrocalcinosi induïda per la dieta alta en P en ratolins OPN KO24). És a dir, el paper fisiològic de l'OPN en la nefrocalcinosi induïda per la dieta alta en P sembla ser la supressió més que la promoció de la calcificació en elronyó. A més, es descriuen informes anteriors que els nivells d'OPN augmenten per compensar la calcificació ectòpica patològicaronyói la vasculatura, ja que l'OPN està regulada a l'alça al lloc de la calcificació patològica.

Com s'ha esmentat anteriorment, el present estudi va suggerir la importància de BMP2 i OPN en la nefrocalcinosi induïda per la dieta alta en P. Cal destacar que els efectes de BMP2 i OPN sobre el desenvolupament de la nefrocalcinosi es creu que estan regulats per diferents mecanismes. Aquestes diferències mecàniques poden indicar que el mecanisme subjacent de la nefrocalcinosi és complicat. El següent punt a tenir en compte és que la inhibició del creixement pot haver afectat l'expressió d'ARNm de Bmp2 i Spp1 a laronyóperquè el present estudi va observar una reducció del pes corporal final en un grup de P alt. Les observacions dels nostres estudis anteriors i actuals poden ajudar a explicar aquest punt. Anteriorment, vam informar d'un augment de l'expressió de proteïna OPN en túbuls renals de rates el creixement de les quals

no va ser inhibida per una dieta alta en P12). A més, el present estudi va mostrar una inhibició del creixement en el grup d'alta P, però nivells elevats d'expressió d'ARNm Spp1 al ronyó. A partir d'aquestes observacions, el present estudi sembla tenir poc efecte sobre la inhibició del creixement de l'expressió d'ARNm de Bmp2 i Spp1. Tanmateix, els detalls de la relació entre la inhibició del creixement i l'expressió dels gens Bmp2 i Spp1 encara no estan clars. Per tant, calen més investigacions per aclarir aquest punt.

En conclusió, per aclarir el mecanisme del desenvolupament de la nefrocalcinosi induïda per una dieta alta en P, el present estudi va determinar els efectes d'una dieta alta en P sobre l'expressió d'ARNm de Bmp2 i Spp1 en elronyó. Les concentracions de Ca i P del ronyó van augmentar significativament en el grup d'alt P en comparació amb el grup control. A més, l'expressió d'ARNm de Bmp2 i Spp1 va augmentar significativament en el grup d'alta P en comparació amb el grup control. Aquests resultats indiquen que una dieta alta en P promou la regulació de l'expressió de l'ARNm de Bmp2 i Spp1 en elronyó.

Referències

1) Hitchman AJ, Has any SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: calcificació renal induïda per fosfats a la rata. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2) Parker HE: interrelacions de magnesi i fòsfor a nivells adequats de fòsfor en la dieta. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3） Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: nefrocalcinosi induïda per fòsfor i funció renal en rates femelles. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Les concentracions i la proporció de calci i fòsfor de la dieta influeixen en el desenvolupament de la nefrocalcinosi en rates femelles. J Nutr 132: 252-256, 2002

5） Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Efectes de la suplementació dietètica de calci sobre el metabolisme ossi, les concentracions de minerals renals i la funció renal en rates alimentades amb una dieta alta en fòsfor. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: la dieta alta en fòsfor indueix ràpidament nefrocalcinosi i lesions tubulars proximals a les rates. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Efectivitat de la medicina tradicional xinesa, Wulingsan, en la supressió del desenvolupament de la nefrocalcinosi induïda per una dieta alta en fòsfor en rates joves. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: La interrupció dirigida a les cèl·lules murines revela un requisit variable per a Smad4 en la senyalització relacionada amb el factor de creixement transformant. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 regula Osterix mitjançant Msx2 i Runx2 durant la diferenciació d'osteoblasts. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR: Os: Formació per autoinducció. Science 150: 893-899, 1965

11） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Reguladors novells de formació òssia: clons i activitats moleculars. Science 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: la dieta alta en fòsfor indueix l'expressió d'osteopontina dels túbuls renals a les rates. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Cousins ​​FB, Geary CPM: una calcificació renal determinada pel sexe en rates. Nature 211 : 980-981, 1966

14) Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: diferències de sexe en les concentracions de minerals renals i l'excreció d'albúmina urinària en rates amb alimentació alta en fòsfor. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 dietes purificades per a rosegadors de laboratori: informe final del comitè de redacció ad hoc de l'Institut Americà de Nutrició sobre la reformulació de l'AIN-76Una dieta de rosegadors . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16）Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: determinació de calci i magnesi en sèrum, orina, dieta i femta per espectrofotometria d'absorció atòmica. Clin Chem 13 : 204-214, 1967

17）Gomori G: una modificació de la determinació colorimètrica de fòsfor per utilitzar-la amb el colorímetre fotoelèctric. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: el grup prenil contribueix a les activitats dels fitoestrògens 8-prenynaringenin en la millora de la formació òssia i inhibint la reabsorció òssia in vitro. Endocrinologia 154: 1202-1214, 2013

19) Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: el flux de fluids estimula l'expressió de l'osteopontina i la sialoproteïna òssia per part de les cèl·lules estromals de la medul·la òssia de manera temporalment dependent. Bone 36: 1047-1055, 2005

20）Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Caracterització del complex del receptor d'oncostatina M de rata que s'assembla a l'humà però difereix del receptor de citocines murí. PLoS One 7: e43155, 2012

21）Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Influència de la proporció dietètica de calci: fòsfor en l'excreció de minerals i la nefrocalcinosi en rates femelles. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: clonació molecular i seqüenciació d'ADNc que codifica una proteïna de pedra urinària, idèntica a l'osteopontina. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Estructura i expressió de l'ARNm que codifica la proteïna de pedra urinària (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24) Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Protestes d'osteopontina contra nefrocalcinosi induïda per fosfats i calcificació vascular. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25) Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: L'osteopontina s'eleva durant la formació de neoíntima a les artèries de rata i és un nou component de les plaques ateroscleròtiques humanes. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993