Com redueix el polisacàrid de Cistanche la melanogènesi i l'estrès oxidatiu?

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:Joanna.jia@wecistanche.com

El polisacàrid de Cistanche deserticola indueix la melanogènesi en els melanòcits i redueix l'estrès oxidatiu

1Departament de Dermatologia, Tercer Hospital Xiangya, Universitat Central Sud, Changsha, Xina

2Departament d'Urologia, Tercer Hospital Xiangya, Universitat Central Sud, Changsha, Xina

3Medicine Experimental Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Xina

Cistanchedeserticolaté molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

Resum: Com a part principal dels trastorns de la pigmentació, les malalties de la despigmentació de la pell com el vitiligen i el nevus acròmic són molt freqüents i reben més atenció ara. La patogènesi de la despigmentació inclou la disfunció i la pèrdua dels melanòcits, que possiblement són causades per l'herència, l'autoimmunitat i l'estrès oxidatiu. Entre ells,estrès oxidatiuté un paper clau; tanmateix, pocs tractaments clínics poden tractar l'estrès oxidatiu. Tal com es va informar,Cistanchedeserticola polisacàrid(CDP) és un antioxidant eficaç; a partir d'això, vam avaluar el seu paper en els melanòcits i vam revelar encara més els mecanismes. En aquest estudi, vam trobar que el CDP podria promoure la melanogènesi en melanòcits epidèrmics humans (HEM) i cèl·lules B16F10 de melanoma de ratolí, també va induir la pigmentació en el peix zebra. A més, el CDP podria activar la via de senyal de la proteïna quinasa activada per mitogens (MAPK), i després augmentar l'expressió del factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF) i els gens aigües avall TYR, TRP1, TRP2 i RAB27A. En cas contrari, vam trobar que el CDP podria atenuar la citotoxicitat i l'apoptosi induïda per H2O2- als melanòcits. Més proves van revelar que el CDP podria millorar la via antioxidant de NRF2/HO-1 i eliminar les ROS intracel·lulars. En resum, el CDP pot promoure la melanogènesi i prevenir els melanòcits de lesions per estrès oxidatiu, cosa que suggereix que el CDP ajuda a mantenir l'estat normal dels melanòcits. Així, el CDP pot ser un fàrmac nou per al tractament de les malalties de la despigmentació.

PARAULES CLAU:

Cistanche deserticola polisacàrid, malaltia de despigmentació, melanòcit, melanogènesi, NRF2,estrès oxidatiu

1. INTRODUCCIÓ

Les malalties de despigmentació de la pell, com el vitiligen i el nevus acròmic, es caracteritzen per una despigmentació de la pell irregular o extensa.1 Tot i que les lesions cutànies rarament causen lesions físiques greus, afecten l'aspecte del pacient i creen una càrrega psicològica severa, fins i tot trastorns de salut mental.2 Els principals canvis patològics en la despigmentació inclouen la disfunció i la pèrdua dels melanòcits, que afecta molt la síntesi i el transport de melanina,3 provocant així una acumulació insuficient de melanina a la pell.

Actualment es desconeixen els mecanismes implicats en la despigmentació, però els estudis han identificat alguns factors relacionats. D'una banda, la funció dels melanòcits depèn en part del factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), que és ben conegut per promoure l'expressió de gens relacionats amb la melanogènesi, inclosa la tirosinasa (TYR), la proteïna 1 relacionada amb la tirosinasa (TRP1), la tirosinasa. proteïna 2 (TRP2), proteïna relacionada amb ras Rab-27a (RAB27A) i proteïna fascina-actina 1 (FSCN1).4 Entre aquests gens, TYR té un paper clau en la síntesi de melanina mitjançant l'oxidació de l-dopa en dopaquinona.5 D'altra banda, els estudis suggereixen una combinació de diversos factors que poden ser responsables de la pèrdua de melanòcits, com ara l'herència, el medi ambient, la autoimmunitat i l'estrès oxidatiu.6-9 Entre aquests factors, l'estrès oxidatiu es considera el més important. .

Els mecanismes deestrès oxidatiucausant despigmentació s'han revelat en part; La sobrecàrrega d'espècies reactives d'oxigen (ROS) és un factor clau.10 La sobrecàrrega de ROS en la despigmentació implica un desequilibri entre els sistemes pro-i antioxidants.11 Un dels elements que participen en aquest desequilibri és el factor nuclear 2-eritroide relacionat factor 2/element de resposta antioxidant (NRF2/ARE) deteriorament de la via antioxidant.12 La via consisteix en NRF2 i enzims antioxidants com l'hemoxigenasa-1 (HMOX-1, HO-1) , catalasa (CAT), glutatió peroxidasa 1 (GPX1) i NAD(P)H quinona deshidrogenasa 1 (NQO1).13 Quan els melanòcits estan exposats a un excessiu ROS, NRF2 es pot translocar al nucli i unir-se a l'ARE conservat, i després promoure l'expressió d'enzims antioxidants. Tanmateix, en algunes malalties de despigmentació, com el vitiligen, una via antioxidant NRF2/ARE alterada no pot eliminar eficaçment els ROS.14 Les teràpies clíniques que s'utilitzen habitualment en la despigmentació inclouen corticoides tòpics o sistèmics, inhibidors de la calcineurina, ultraviolat B de banda estreta (NBUVB; 311 nm) , llum excímer de 308-nm, trasplantament epidèrmic autòleg i teràpia de medicina tradicional xinesa (MTC). Els corticoides i els inhibidors de la calcineurina poden reduir l'activació immune anormal15, mentre que les fototeràpies s'utilitzen com a tractaments de primera línia; en particular, NBUVB estimula la proliferació de melanòcits i la destrucció de cèl·lules T16, mentre que 308-nm la llum excímer indueix l'apoptosi de les cèl·lules T.17 A més, els efectes de les teràpies de TCM estan relacionats amb la promoció de la melanogènesi.18 En certa mesura, aquests mètodes són útils per millorar la despigmentació, però controlar la progressió de la malaltia continua sent un repte. És necessari desenvolupar noves teràpies, especialment per a l'estrès oxidatiu, que abans es descuidava.

Cistanche deserticolaes coneix com "ginseng del desert".19 Els seus components són útils en lesions hepàtiques induïdes per etanol i hiperplàsia inflamatòria intestinal; també es pot utilitzar com a reactiu antifatiga, antiinflamatori i antitumoral.20-22 Recentment, Guo et al van informar queCistanche deserticola polisacàrid(CDP), un dels seus components principals, posseïa activitat antioxidant i hepatoprotectora20; altres dos estudis van identificar el seu paper en la protecció de les cèl·lules d'una lesió en condicions de privació/reperfusió d'oxigen-glucosa i osteoporosi.23,24 No obstant això, el paper del CDP en les malalties de despigmentació no s'ha dilucidat. Aquí, teníem com a objectiu confirmar si CDP cestrès oxidatiuPodria afectar la melanogènesi i protegir els melanòcits de l'estrès oxidatiu.

2.|MATERIAL I MÈTODES

2.1|Productes químics i anticossos

Cistanche deserticolapolisacàrid(CDP) i l-dopa es van comprar a Yuanye Biotec (puresa superior o igual al 98 per cent; Xangai, Xina). Peròxid d'hidrogen (H2O2), sulfòxid de dimetil (DMSO), NaOH, Tritó X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il{-2,5-bromur de difeniltetrazoli ( MTT) i un kit de detecció d'apoptosi Annexin V-FITC es van comprar a Sigma-Aldrich. El 4% de paraformaldehid neutre es va comprar a Biosharp (Hefei, Xina); i es va comprar un kit de tinció d'immunofluorescència (Alexa Fluor 488) i 2,7-diacetat de diclorofluoresceïna (DCFH-DA) a Beyotime Biotec (Xangai, Xina). Es van comprar un kit de taques Fontana-Masson i un kit d'extracció de proteïnes nucleoplàsmiques a Sloarbio (Beijing, Xina). El suplement de creixement de melanòcits humans (HMGS), el medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) i el medi 254 es van comprar a Gibco. El sèrum boví fetal (FBS) es va comprar a BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). Anticossos primaris per a -actina, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 i HO-1 es van comprar a Cell Signaling Technology, es va comprar un anticòs primari per a MITF al St John's Laboratory, es va comprar un anticòs primari per a p-MITF a Affinity Biosciences, un anticòs primari per GAPDH es va comprar a Bioworld i l'anticossos primari per a TRP1 es va comprar a EMD Millipore.

2.2| Cultiu i tractament cel·lular

Les cèl·lules B16F10 de melanoma de ratolí es van cultivar en DMEM mitjà complementat amb un 10% de FBS i un 1% de barreja antibiòtica penicil·lina-estreptomicina. Els melanòcits epidèrmics humans (HEM) es van separar del prepuci humà (consulteu el nostre estudi anterior25) i es van cultivar en medi 254 suplementat amb HMGS, 5 per cent de FBS i 1 per cent de barreja d'antibiòtics penicil·lina-estreptomicina. Totes les cèl·lules es van cultivar en una incubadora humida a 37 graus amb un 5% de CO2. El CDP es va dissoldre en DMSO i es va diluir

amb el medi abans de l'ús, la concentració final de DMSO era inferior al 0,1 per cent. L'H2O2 es va diluir amb el medi abans del seu ús.

2.3|Cultiu i tractament de peix zebra

Els embrions i el medi de peix zebra es van comprar a EzeRinka Biotech. El protocol experimental va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de la Universitat Central South. El peix zebra es va cultivar en 12-plaques de pous a 37 graus de distància de la llum i es van tractar amb diferents concentracions de CDP. Es va utilitzar un microscopi invertit per observar i registrar diàriament les melanines del cap i la cua del peix zebra. Després de l'observació, vam canviar el medi i vam tornar a afegir el CDP. La densitat de melanina a les cues del peix zebra es va mesurar amb la imatge J i els valors es presenten com a densitats òptiques integrades (IOD).

2.4| Viabilitat cel·lular

La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant un assaig MTT. Per investigar la citotoxicitat de CDP, es van implantar cèl·lules HEM i B16F10 a 96-plaques de pou a una densitat de 2 × 1{{30}}3 cèl·lules/pou i es van cultivar fins que les cèl·lules estaven unides a plaques. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb diferents concentracions (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 i 320 ug/mL) de CDP durant 24, 48 o 72 hores. Abans de la mesura, es van afegir 20 μL de MTT a cada pou i les plaques es van incubar a 37 graus durant 4 hores. Després d'això, vam descartar el sobrenedant i vam afegir 160 μL de DMSO a cada pou per dissoldre els cristalls de formazan. El valor d'absorbància a 490 nm es va mesurar mitjançant un lector de plaques multimode (PerkinElmer). Per investigar l'efecte del CDP en la condició de citotoxicitat induïda per H2O2-, es van xapar HEM i cèl·lules B16F10 en plaques de 96-pous a una densitat de 4 × 103 cèl·lules/pou. Les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions de CDP (0, 20, 40 o 80 ug/mL) durant 24 hores, moment en què vam afegir H2O2 (concentracions finals: 500 μm per a HEM i 1,0 mm per a cèl·lules B16F10) a cada pou. i va incubar les cèl·lules durant 24 hores més. Vam establir grups tractats amb CDP i control negatiu (NC). Els passos de detecció eren els mateixos que els descrits anteriorment.

2,5|Assaig de NaOH del contingut de melanina

Les cèl·lules es van cultivar en plaques de Petri de {{0}}mm i es van tractar amb CDP a diferents concentracions (0, 20, 40 i 80 ug/mL) durant 48 hores, després es van digerir amb tripsina i es van recollir en 1. Tubs de 5-ml. Vam rentar les cèl·lules dues vegades amb aigua doble destil·lada, les vam tornar a suspendre en 1 ml d'etanol i les vam vortexar per alliberar la melanina. A continuació, vam centrifugar (200 g, 5 minuts) la barreja i vam descartar el sobrenedant, vam afegir 1 ml de DMSO al 10 per cent (diluït amb 1 mm de solució de NaOH) a cada tub i vam suspendre el sediment. Incubem la suspensió en un bany maria a 80 graus durant 1 hora per dissoldre la melanina. Finalment, vam transferir 200 μL de líquid a una placa 96-pou i vam utilitzar un lector de plaques multimode per mesurar el valor d'absorbància a 470 nm.

2,6|Mesures de l'activitat tirosinasa

Les cèl·lules es van cultivar en plaques de Petri de {{{0}}mm i es van tractar amb CDP abans de la mesura, es van digerir amb tripsina i es van recollir en tubs d'1,5-mL i es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS). ). Vam traslladar 106 cèl·lules de cada mostra a un tub nou i vam descartar el sobrenedant després de la centrifugació, després vam afegir 1 ml 0,5 per cent de Tritó X{-100 al sediment cel·lular i vam emmagatzemar el barreja a 0 graus durant 15 minuts. A continuació, vam afegir 1 mL de L-dopa (1 mm, diluït amb tampó fosfat 0.1 M) com a substrat i vam barrejar la solució, vam traslladar 200 µL de la barreja a una placa de 96-pou. immediatament i va mesurar el valor d'absorbància (A0) a 475 nm mitjançant un lector de plaques multimode, repetint la mesura als 10 minuts (A10). L'activitat de la tirosinasa es va calcular per (A10-A0)/105, i els resultats s'expressen com a percentatge (per cent) enfront del control negatiu.

2,7| Tinció de melanina Fontana-Masson

Les cèl·lules es van cultivar en plaques de 12-pous fins a aconseguir un 50 per cent de densitat. Després del tractament, les cèl·lules es van fixar amb un 4% de paraformaldehid neutre durant 30 minuts i es van rentar amb aigua destil·lada. A continuació, vam afegir 500 μL de solució d'amoníac i plata de Fontana a cada pou i vam emmagatzemar les plaques a la foscor durant 16 hores per tenyir la melanina. A continuació, hem rentat les cèl·lules amb aigua destil·lada cinc vegades (1 minut cada vegada) i les hem remullat en 500 μL d'hiposulfit durant 5 minuts; finalment, vam retirar l'hiposulfit i vam tornar a esbandir les cèl·lules amb aigua destil·lada durant 1 minut. Després vam utilitzar un microscopi invertit per observar i registrar les melanines.

2,8|Extracció d'ARN i transcripció inversa quantitativa-reacció en cadena de la polimerasa

Les cèl·lules es van cultivar en 6-plaques de pous. Després del tractament, les cèl·lules es van digerir amb tripsina i es van recollir en tubs d'1,5-ml. Vam rentar les cèl·lules dues vegades amb PBS, després vam afegir 1 ml de tampó de lisi, vam vortexar la barreja i vam col·locar els tubs sobre gel durant 5 minuts per lisar les cèl·lules completament. L'ARN es va extreure mitjançant un kit d'ARN total (Omega Bio-Tek) i es va transcriure inversament (RT) mitjançant ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). La reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa quantitativa (PCR) es va realitzar mitjançant KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). El volum de reacció de la barreja de RT va ser de 20 μL, mentre que el volum de reacció de la barreja de PCR era de 20 μL (ADNc 1-8 μL, MIX 10 μL, cebador F 1 μL, cebador R 1 μL, afegir DEPC H2O a 20 μL). ). Els experiments es van realitzar segons els protocols. Les seqüències dels cebadors es mostren a la taula S1.

2,9|Extracció de proteïnes i Western blotting/immunofluorescència

Les cèl·lules es van cultivar en plaques de Petri de 100- mm. Després del tractament, les cèl·lules es van digerir amb tripsina i es van recollir en tubs d'1,5-ml. Vam rentar les cèl·lules dues vegades amb PBS, després vam afegir 500 μL de tampó de lisi RIPA (Thermo Fisher) complementat amb fluorur de fenilmetilsulfonil d'1 mm (Thermo Fisher) i còctel d'inhibidor de fosfatasa diluït 1:100 (Roche). La proteïna nuclear i del citoplasma es va extreure mitjançant el kit d'extracció de proteïnes nucleoplàsmiques segons el protocol del fabricant. Vam col·locar els tubs sobre gel durant 30 minuts i els vam vortexar cada 5 minuts per lisar completament les cèl·lules. Vam centrifugar les cèl·lules (200 g, 4 graus, 15 minuts), vam traslladar el sobrenedant a un tub nou i vam mesurar la concentració de proteïna total mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (KeyGEN Biotec). Vam bullir les proteïnes amb un tampó de càrrega 5 × (Beyotime Biotec, Xina) a 100 graus durant 10 minuts, i després les vam emmagatzemar a -80 graus. Es va utilitzar el mètode d'electroforesi en gel de poliacrilamida (PAGE) en Western blotting i es van separar 20 ug de proteïna de cada grup i es van transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè. Després del bloqueig de l'antigen, vam incubar la membrana en un anticòs primari diluït 1:1000 durant 16 hores a 4 graus, després vam rentar la membrana amb PBST i la vam incubar en 1:10 000 anticossos secundaris fluorescents diluïts durant 1 hora a 37 graus. . La intensitat de fluorescència es va detectar mitjançant un sistema d'imatge Odyssey CLx (LI-COR). La immunofluorescència es va realitzar mitjançant el kit de tinció d'immunofluorescència (Alexa Fluor

488) amb una dilució 1:100 de l'anticòs primari.

2.10|Mesura de l'apoptosi cel·lular

Les cèl·lules es van cultivar en plaques de Petri de {{{0}}mm i es van tractar amb diferents concentracions (0, 20, 40 i 80 ug/mL) de CDP durant 24 hores, i es va afegir H2O2 ( concentracions finals: 500 μm per a HEM, 1,0 mm per a cèl·lules B16F10) a cada pou i incubat durant 24 hores més. També vam crear grups tractats amb CDP i NC. Després del tractament, vam digerir les cèl·lules amb tripsina lliure d'EDTA i les vam recollir en tubs, després vam rentar les cèl·lules dues vegades amb PBS i les vam tornar a suspendre en 100 μL de PBS. Les cèl·lules es van tacar amb un kit de detecció d'apoptosi Annexin V-FITC segons el protocol i es van detectar mitjançant citometria de flux (FCM). Es va utilitzar el programari FlowJo per analitzar la taxa d'apoptosi.

2.11| Mesura intracel·lular de ROS

Les cèl·lules es van cultivar en plaques de {{{0}}pous i es van tractar amb diferents concentracions (0, 20, 40 i 80 ug/mL) de CDP durant 24 hores, a les quals vam afegir H2O2 (concentracions finals: 500). μm per a HEM,

1.0 mm per a cèl·lules B16F10) a cada pou, les va incubar per a un altre

24 hores i configureu grups tractats amb CDP i NC. Després del tractament, vam rentar les cèl·lules dues vegades amb PBS per eliminar tot el medi i l'FBS, després vam diluir la sonda DCFH-DA a 1:1000 amb medi i la vam afegir a cada pou. Vam incubar les cèl·lules a 37 graus durant 30 minuts i les vam rentar tres vegades amb un medi sense sèrum. Hem utilitzat un

microscopi de fluorescència invertida per observar i registrar la fluorescència, després va utilitzar ImageJ per mesurar la intensitat de la fluorescència.

2.12|Estadística i anàlisi

Les dades d'aquest treball es presenten com a mitjana ± desviació estàndard (DE) i l'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant GraphPad Prism (versió 7.0) o SPSS (versió 22.0) i Student's Es va utilitzar la prova t o l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA) per a comparacions de grups múltiples. El valor gris de les bandes de proteïnes WB es va estandarditzar amb GAPDH o -actina. Els valors de P < 0,05="" es="" van="" considerar="" significatius.="" tots="" els="" experiments="" es="" van="" repetir="" almenys="" tres="">

3|RESULTATS

3.1|La melanogènesi induïda per CDP a les cèl·lules HEM i B16F10

Abans de començar, vam utilitzar l'assaig MTT per investigar la citotoxicitat potencial de CDP en cèl·lules HEM i melanoma B16F10 de ratolí. Les cèl·lules es van tractar amb CDP a diferents concentracions durant 24, 48 o 72 hores. Les proves de viabilitat d'HEM van demostrar que quan les concentracions eren inferiors a 320 ug/ml, el CDP no tenia cap influència en la viabilitat cel·lular; tanmateix, la viabilitat va disminuir significativament a mesura que la concentració va assolir els 320 ug/mL a les 24, 48 i 72 hores (P <.05; figura="" 1a).="" la="" viabilitat="" de="" les="" cèl·lules="" b16f10="" també="" va="" disminuir="" a="" les="" 48="" i="" 72="" hores="" quan="" el="" cdp="" va="" arribar="" a="" 320="" ug/ml="" (p=""><.01), però="" no="" es="" va="" observar="" cap="" canvi="" a="" concentracions="" més="" baixes="" (figura="" 1b).="" a="" continuació,="" vam="" explorar="" preliminarment="" el="" paper="" del="" cdp="" en="" la="" melanogènesi="" i="" vam="" comparar="" els="" seus="" efectes="" amb="" els="" de="" l'hormona="" estimulant="" dels="" melanòcits="" (-msh;="" concentracions:="" 20,="" 100="" i="" 400="" nm)="" i="" dmso="" (0,="" 1="" per="" cent)="" en="" hem.="" els="" resultats="" dels="" assajos="" de="" tinció="" de="" melanina,="" activitat="" de="" tirosinasa="" i="" contingut="" de="" melanina="" van="" suggerir="" que="" cdp="" era="" comparable="" amb="" -msh="" per="" promoure="" la="" melanogènesi,="" mentre="" que="" el="" tractament="" amb="" dmso="" al="" 0,1="" per="" cent="" no="" va="" fer="" cap="" diferència="" (figura="">

Hem perfeccionat encara més la nostra exploració en conseqüència. Els HEM es van tractar amb CDP a diferents concentracions (20, 40 i 80 ug/mL) durant 48 hores; es van realitzar assajos de tinció de melanina, contingut de melanina i activitat de tirosinasa, i tots van mostrar augments significatius després del tractament amb CDP de manera dependent de la concentració que van assolir el màxim en el grup de 80 ug/mL (P <.05, figura="" 2a-c)="" .="" a="" continuació,="" vam="" mesurar="" els="" nivells="" d'arnm="" i="" proteïnes="" dels="" gens="" relacionats="" amb="" la="" melanogènesi="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" i="" fscn1).="" el="" cdp="" va="" augmentar="" significativament="" els="" nivells="" d'arnm="" d'aquests="" gens="" als="" hem="" (p=""><.05; figura="" s2a).="" a="" més,="" els="" nivells="" de="" proteïnes="" mitf,="" tyr,="" trp1="" i="" rab27a="" van="" augmentar,="" igual="" que="" la="" proporció="" de="" mitf="" fosforilat="" amb="" mitf="" total="" (p=""><.05), mentre="" que="" trp2="" i="" fscn1="" no="" van="" mostrar="" cap="" diferència="" (figura="" 2d,="" e).="" els="" resultats="" van="" indicar="" que="" el="" cdp="" pot="" promoure="" la="" melanogènesi="" i="" regular="" l'expressió="" de="" gens="" relacionats="" amb="" la="" melanogènesi="" en="" melanòcits="">

A més, vam tornar a verificar els efectes de CDP amb cèl·lules B16F10 i vam trobar que el contingut de melanina de les cèl·lules B16F10 augmentava significativament (P <.01; figura="" s2b).="" a="" més,="" cdp="">

3.2|El CDP va promoure la melanogènesi en el peix zebra

Per investigar si CDP podria promouremelanogènesiin vivo, hem utilitzat embrions de peix zebra. Els embrions de peix zebra es van dividir en quatre grups i es van tractar contínuament amb medi sol (NC) o CDP a diferents concentracions (20, 40 i 80 ug/mL); la densitat i la distribució dels grànuls de melanina es van observar i registrar cada dia. A mesura que els embrions de peix zebra van créixer, vam trobar que la densitat de melanina augmentava gradualment als caps i les cues. El tercer dia, les diferències entre grups es van distingir i la diferència va continuar augmentant fins que vam acabar l'experiment el sisè dia (figura 3A). Hem utilitzat la imatge J per mesurar la densitat de melanina a les cues del peix zebra; la densitat de melanina en els grups tractats amb CDP va ser significativament superior a la del grup control (P <.05; figura="">

3.3|La via del senyal MAPK activada per CDP a les cèl·lules HEM i B16F10

Revelar els mecanismes pels quals CDP va promouremelanogènesi, vam tractar HEM amb CDP a diferents concentracions (20, 40 i

80 ug/mL) durant 48 hores i després es va investigar els nivells fosforilats i totals de les proteïnes ERK, JNK i p38 a la via de senyalització MAPK. Tal com es va mesurar mitjançant Western blotting, els nivells de p-ERK, p-JNK i p-p38 van augmentar després del tractament amb CDP (P <.05), mentre="" que="" els="" nivells="" totals="" d'ells="" no="" van="" canviar="" (figura="" 4a,="" b).="" els="" experiments="" es="" van="" repetir="" amb="" cèl·lules="" b16f10="" i="" es="" van="" augmentar="" els="" nivells="" fosforilats="" de="" les="" proteïnes="" erk,="" jnk="" i="" p38="" (p=""><.05), però="" els="" nivells="" totals="" de="" mapk="" no="" van="" canviar="" (figura="" 4c,="" d),="" d'acord="" amb="" els="" resultats="" en="" hem.="">

3.4|H2O2-atenuat per CDP

citotoxicitat i apoptosi en cèl·lules HEM i B16F10

Hem utilitzat H2O2 per simularestrès oxidatiuentorn i va explorar encara més el paper del CDP en els melanòcits sotaestrès oxidatiu. La concentració final d'H2O2 utilitzada als HEM va ser de 500 μm, mentre que a les cèl·lules B16F10 era d'1,0 mm. Per investigar l'efecte del CDP sobre la citotoxicitat induïda per H2O2-, vam tractar prèviament les cèl·lules HEM i B16F10 amb CDP a diferents concentracions (20, 40 i 80 ug/mL) durant 24 hores, després vam afegir H2O2 i vam continuar tractant-les. durant 24 hores abans de realitzar l'anàlisi d'observació i MTT.

L'H2O2 va provocar un aparent vessament de la membrana i una contracció cel·lular en els HEM, en els grups pretractats amb CDP, la situació es va alleujar. El tractament només amb CDP no va tenir cap efecte (figura 5A). L'assaig MTT va mostrar un resultat similar, ja que el tractament amb H2O2 va disminuir la viabilitat de l'HEM, mentre que el CDP va millorar significativament aquest impacte nociu.

3,5|ROS intracel·lular induït per H2O2- CDP a les cèl·lules HEM i B16F10

Per investigar els mecanismes de CDP per disminuir la citotoxicitat i l'apoptosi induïda per H2O2-, vam detectar encara més el ROS intracel·lular en cèl·lules HEM i B16F10 mitjançant una fluorescència DCFH-DA.

4|DISCUSSIÓ I CONCLUSIONS

En aquest estudi, hem investigat el paper del CDP en les cèl·lules HEM i B16F10. Per primera vegada, vam descobrir que CDP podia promouremelanogènesien melanòcits i promouen la pigmentació en peixos zebra. Un experiment posterior va demostrar que la via de senyalització MAPK estava activada sota tractament amb CDP. Hem investigat més el seu paperestrès oxidatiui va trobar que el CDP podria atenuar la citotoxicitat i l'apoptosi induïda per H2O2- als melanòcits; Mentrestant, el CDP podria activar la via antioxidant NRF2/HO-1 i eliminar les ROS intracel·lulars sotaestrès oxidatiucondicions.

La proteïna cinasa activada per mitògens és una via vital implicada en la regulació de MITF, un factor clau de transcripció que promou l'expressió demelanogènesi-gens relacionats i, posteriorment, afecta la síntesi i el transport de melanina.26,27 En el nostre estudi, l'activació d'ERK, JNK i p38 en melanòcits va augmentar significativament després del tractament amb CDP; mentrestant, les expressions de MITF/p-MITF i MITF-driven TYR, TRP1, TRP2 i RAB27A

es van regularitzar en conseqüència. Per tant, suggerim que CDP pugui

promouremelanogènesimitjançant l'activació de la via MAPK, però encara es desconeix com el CDP activa els MAPK. Segons estudis recents, el receptor toll-like 4 (TLR4) està molt expressat en melanòcits i implicat en la melanogènesi.28,29 El TLR4 és una proteïna transmembrana important que pot unir específicament els lipopolisacàrids (LPS)30; els estudis van informar que el LPS pot induir la melanogènesi.29 Curiosament, diversospolisacàridsextret de plantes o bolets, s'informa que van activar TLR i vies de senyalització aigües avall, com ara MAPK i el factor nuclear kappa beta (NF-κB). ling camí i promoumelanogènesi. A més, se sap que els receptors semblants al domini d'oligomerització d'unió a nucleòtids (NLR) reconeixen lligands intracel·lulars i impulsen l'activació de les vies de senyalització MAPK i NF-κB.33,34 Tal com es va informar, els polisacàrids extrets de Ganoderma lucidum i Astragalus poden entrar a les cèl·lules. i afecten els NLR.35,36 Així, és possible que la CDP pugui entrar als melanòcits i regular la via de senyalització de MAPK a través dels NLR. No obstant això, calen més estudis per verificar aquesta hipòtesi.

Alguns estudis fins ara van informar de l'aplicació d'herbespolisacàridsen la melanogènesi per inhibir la producció de melanina.37,38 No obstant això, en aquest estudi, CDP va promoure la melanogènesi en

melanòcits, i aquest efecte es va confirmar després de la comparació amb -MSH. CDP també és una mena depolisacàridextret d'herbes, sospitem que l'efecte contrari del CDP pot estar relacionat amb les diferències estructurals entre CDP i altrespolisacàrids. Els polisacàrids es formen per polimerització de monosacàrids però són variables pel que fa al tipus de monosacàrids, composició de monosacàrids, enllaç glicosídic, estructura de cadena lateral i pes molecular39,40; Es creu que aquests factors determinen les seves funcions biològiques.41 Els estudis existents han proposat l'estructura del CDP i han suggerit que l'estructura del CDP influeix posteriorment en la seva funció.42 Per tant, calen més proves per entendre completament el CDP i confirmar la nostra hipòtesi.

La melanogènesi és un important mecanisme protector de resistència

dany ultraviolat i manteniment de l'homeòstasi corporal43; al mateix

temps, els melanòcits s'exposen fàcilment a entorns desfavorables com la sobrecàrrega de ROS.11 Se sap que les ROS participen en la promociómelanogènesi, un dels mecanismes és l'activació dels MAPK.44 Però els estudis també van revelar que aquest efecte només existeix dins d'un cert nivell de ROS, mentre que la sobrecàrrega de ROS perjudica significativament la melanogènesi.45 La relació entre ROS, MAPK i melanogènesi és variable en diferents condicions, per tant, l'equilibri entre els sistemes pro-i-anti-oxidants és òbviament important. En malalties de despigmentació com el vitiligen, un sistema antioxidant desequilibrat i la sobrecàrrega incontrolable de ROS danyarà els melanòcits i disminuirà la viabilitat cel·lular.11,46 En aquest estudi, hem utilitzat diferents concentracions d'H2O2 per simular la sobrecàrrega de ROS a les cèl·lules, i els HEM van mostrar una tolerància més baixa a les cèl·lules. H2O2 que les cèl·lules B16F10. Quan els melanòcits van ser sotmesos a tractament amb H2O2, la seva viabilitat i taxa d'apoptosi van empitjorar, però

El pretractament CDP podria revertir parcialment la tendència. Al mateix temps, es va eliminar ROS. Tal com es va informar, l'activació de la via d'antioxidació NRF2/ARE és un mètode important d'eliminació de ROS a les cèl·lules de la pell.14 En els nostres experiments, els nivells de proteïnes de NRF2 i HO-1 als melanòcits es van regular després del tractament amb H2O2 sense CDP; això vol dir que H2O2-ha induïtestrès oxidatiupot activar la via NRF2/HO-1, però és insuficient per mantenir un equilibri redox i protegir la cèl·lula de lesions. Tanmateix, el pretractament amb CDP va millorar la via d'antioxidació NRF2/HO-1 i va restablir l'equilibri. Per tant, suggerim que el CDP pot protegir els melanòcits de la lesió per estrès oxidatiu mitjançant l'activació de la via d'antioxidació NRF2/HO-1 i l'eliminació de ROS.

Hem trobat que el tractament amb CDP per si sol no té cap influència en ROS o NRF2/HO-1 als melanòcits. Aquest resultat suggereix que el CDP pot afectar l'equilibri redox sota estrès oxidatiu, però no en condicions normals. A més, la via d'antioxidació NRF2/HO-1 està regulada per les vies de senyalització PI3K, NF-κB i MAPK.47,48 En el nostre estudi, CDP va poder activar la via de senyalització MAPK. És possible que CDP pugui activar la via NRF2/HO-1 mitjançant la regulació positiva de MAPK. Com va informar Slominski, els melanòcits són sensors d'estrès implicats en una xarxa reguladora, i les seves funcions poden canviar ràpidament en resposta al medi ambient.49 Suggerim que el paper del CDP està influenciat per l'estat dels melanòcits, pot promoure la melanogènesi sense afectar l'antioxidant. sistema en condicions normals, però restabliu l'equilibri redox sotaestrès oxidatiucondicions. Per tant, la funció i la supervivència dels melanòcits es poden mantenir de dues maneres diferents mitjançant CDP. El CDP ajuda els melanòcits a mantenir l'homeòstasi, que també és una funció important de la melanogènesi50,51.

En conclusió, CDP pot promoure elmelanogèneside melanòcits

mitjançant l'activació de la via de senyalització MAPK. El CDP pot millorar la supervivència dels melanòcits mitjançant l'activació de la via antioxidant NRF2/HO-1 i l'eliminació de ROS intracel·lulars en condicions d'estrès oxidatiu. Les nostres troballes són significatives perquè demostren que CDP pot promouremelanogènesii protegir els melanòcitsestrès oxidatiulesió, que és possiblement responsable de la disfunció i la pèrdua dels melanòcits. Els resultats d'aquest estudi indiquen que el CDP podria ser un fàrmac nou en el tractament de les malalties de la despigmentació.

AGRAÏMENTS

Aquest treball va comptar amb el suport de la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (núm. 81703101), els Projectes de Talent New Xiangya del Tercer Hospital Xiangya de la Universitat Central del Sud (núm. JY201623 i núm. 20170301), la Fundació de Ciències Naturals de la província de Hunan (núm. núm. 2018JJ3788 i núm. 2018JJ3793) i la comissió de salut del Projecte de Hunan (núm. C2019173). El doctor Yibo Hu va realitzar la part principal de l'estudi i va escriure el manuscrit; El professor Jing Chen i Qinghai Zeng van dissenyar l'estudi i van guiar l'escriptura del manuscrit; El professor Jinhua Huang, Lihua Huang i Hong Xiang van oferir suport tècnic i van analitzar les dades; Els doctors Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang i Xiaojiao Zhao van contribuir a part dels experiments.

CONFLICTE D'INTERESSOS

Els autors confirmen que no hi ha conflictes d'interessos.

DECLARACIÓ DE DISPONIBILITAT DE DADES

Les dades que donen suport a les conclusions d'aquest estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.

REFERÈNCIES

1. Bleuel R, Eberlein B. Gestió terapèutica del vitiligen. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Hem de prioritzar les intervencions psicològiques en el tractament del vitiligen? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, et al. Vitiligo. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentació de melanina a la pell dels mamífers i la seva regulació hormonal. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tirosina i L-dihidroxifenilalanina com a reguladors semblants a les hormones de les funcions dels melanòcits. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA. Relacions genètiques compartides subjacents al vitiligen generalitzat i la malaltia tiroïdal autoimmune. tiroide. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Vitiligen infantil a la Xina: perfils clínics i troballes immunològiques en 620 casos. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Limfòcits T autoreactius en malalties inflamatòries de la pell. Front Immunol. 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, et al. Vitiligo: patogènesi, variants clíniques i enfocaments de tractament. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, et al. Espècies reactives d'oxigen en senyalització metabòlica i inflamatòria. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Melanòcits com a instigadors i víctimes de l'estrès oxidatiu. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Estrès oxidatiu i vitiligen: els Nrf2-ARE

connexió de senyalització. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. La xarxa reguladora Nrf2 proporciona una interfície entre el metabolisme redox i intermediari. Tendències Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Pérez P, Meunier JR. La importància de Nrf2

via en la resposta a l'estrès (foto)-oxidatiu en melanòcits i queratinòcits de l'epidermis humana. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, et al. Model d'inducció i teràpia de vitiligen in vivo: un assaig clínic aleatoritzat doble cec. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Fototeràpia ultraviolada B de banda estreta i làser excímer 308-nm en el tractament del vitiligen: una revisió. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, et al. Làser ultraviolat B de clorur de xenó

és més eficaç per tractar la psoriasi i per induir l'apoptosi de les cèl·lules T que l'ultraviolat de banda estreta B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, et al. Efectes d'extractes aquosos d'Eclipse herba, preparador de radix Polygoni multiflora i preparador de radix Rehmanniae sobre la melanogènesi i la migració de melanòcits humans. J Etnofarmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": una revisió. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, et al. Caracteritzacions preliminars, l'activitat antioxidant i hepatoprotectora depolisacàriddes deCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, et al. Activitat antifatiga de l'extracte ric en feniletanoidesCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X, et al. Efectes antitumorals i antiinflamatoris dels oligosacàrids deCistanche deserticolaextracte sobre lesió medul·lar. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M, et al.Cistanche deserticola polisacàridsprotegir les cèl·lules PC12 contra lesions induïdes per OGD/RP. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.

24. Song D, Cao Z, Liu Z, et al.Cistanche deserticola polisacàridatenua l'osteoclastogènesi i la reabsorció òssia mitjançant la inhibició de la senyalització RANKL i la producció d'espècies reactives d'oxigen. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J, et al. La baixada de TUG1 promou la melanogènesi i la melanogènesi induïda per UVB. Exp Dermatol. 28;2019:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Un programa de llinatge de melanòcits confereix resistència a la inhibició de la via de la MAP cinasa. Naturalesa. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Fisiologia de la transcripció" de la formació de pigments en melanòcits: paper central del MITF. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F, et al. Els melanòcits humans cultivats expressen els receptors funcionals 2–4, 7 i 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Els melanòcits humans expressen el receptor funcional Toll-like 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C, et al. Correlacions de les activitats dels adjuvants de la família GLA. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, et al. Una novel · lapolisacàridobtingut a partir de Craterellus cornucopioides millora l'activitat immunomoduladora en models de ratolins immunosupressors mitjançant la regulació de la via TLR4-NF-kappaB. Funció Alimentació. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR, et al. TLR-4 pot mediar les vies de senyalització d'AstragaluspolisacàridRAP va induir l'expressió de citocines de cèl·lules RAW264.7. J Etnofarmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F, et al. L'efector bacterià T6SS EvpP prevé l'activació de l'inflamsoma NLRP3 mitjançant la inhibició de la via MAPK-Jnk depenent de Ca (2 més ). Microbi cel·lular hoste. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: un sensor immune multifacètic in-Nate. Tendències Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Efectes antiinflamatoris i hepatoprotectors de Ganoderma lucidumpolisacàridscontra la lesió hepàtica induïda pel tetraclorur de carboni en ratolins Kunming. Farmacologia. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B, et al. Astragaluspolisacàridatenua la colitis murina mitjançant la inhibició de l'inflamsoma NLRP3. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J, et al. Ganoderma lucidumpolisacàridredueix la melanogènesi mitjançant la inhibició dels efectes paracrins dels queratinòcits i fibroblasts mitjançant la via IL-6/STAT3/FGF2. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, et al. Efecte depolisacàridFMP-1 de Morchella esculenta sobre la melanogènesi en cèl·lules B16F10 i peix zebra. Funció Alimentació. 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, et al. Característiques moleculars i bioactivitats depolisacàridsde l'alfals (Medicago sativa L.). Nutrients. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, et al. La presència de components traça amplia significativament la resposta molecular d'Aspergillus niger a la goma guar. Nova Biotecnologia. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, et al. Caracterització de la plantapolisacàridsde Dendrobium officinale mitjançant múltiples tècniques cromatogràfiques i espectromètriques de masses. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Caracterització estructural i activitat immunològica de dos extractibles en aigua fredapolisacàridsdes deCistanche deserticolaYC Ma. Res de carbohidrats. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Com la llum UV toca el cervell i el sistema endocrí a través de la pell i per què. Endocrinologia. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Noves dades sobre trastorns de la hiperpigmentació. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Suppl 5):18-21.

45. Glassman SJ. Vitiligo, espècies reactives d'oxigen i cèl·lules T. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Desvelant la veritat sobre els antioxidants: la mitohormesi explica els beneficis per a la salut induïts per ROS. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P, et al. La curcumina activa el gen hemoxigenasa-1 mitjançant la regulació de Nrf2 i l'element que respon als antioxidants. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signaling to

hemo oxigenasa-1 i el seu potencial terapèutic antiinflamatori.

Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanòcits com a cèl·lules "sensorials" i reguladores de l'epidermis. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. El paper del pigment de melanina en el melanoma. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, et al. El paper de la melanogènesi en la regulació del comportament del melanoma: la melanogènesi condueix a l'estimulació de l'expressió HIF-1alfa i les vies acompanyants depenents d'HIF. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.