Disseny in silico d'una vacuna multiepítop quimèrica promiscua contra Mycobacterium Tuberculosis Part 1

Resum

La tuberculosi (TB) és una amenaça per a la salut mundial, mata aproximadament 1,5 milions de persones cada any. L'eradicació de Mycobacterium tuberculosis, el principal agent causant de la tuberculosi, és cada cop més difícil a causa de l'aparició d'extenses soques resistents als fàrmacs. La vacunació es considera una forma eficaç de protegir l'hoste dels patògens, però l'única vacuna antituberculosa aprovada clínicament, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), té una protecció limitada en adults. S'ha trobat que les vacunes multiepítopes milloren la immunitat a les malalties combinant selectivament epítops de diverses proteïnes candidates.

La tuberculosi és una malaltia infecciosa causada pel bacteri Mycobacterium tuberculosis que afecta principalment els pulmons però també pot afectar altres òrgans. La immunitat té un paper important en el desenvolupament i el tractament de la tuberculosi.

En cas d'immunitat insuficient, Mycobacterium tuberculosis pot envair fàcilment el cos humà i convertir-se en tuberculosi. Per exemple, un sistema immunitari compromès per certes malalties o tractaments mèdics augmenta el risc d'infecció per tuberculosi. A més, factors com la desnutrició, la mala qualitat de vida i l'excés d'estrès també poden debilitar la immunitat, donant lloc al desenvolupament de la tuberculosi.

Per tant, mantenir una bona salut i enfortir la immunitat és molt important per prevenir la tuberculosi. La immunitat es pot augmentar mitjançant una dieta saludable, un estil de vida regular, un exercici adequat i un son suficient, cosa que pot reduir eficaçment el risc de contraure diverses malalties, inclosa la tuberculosi.

La immunitat també és important per al tractament i la recuperació quan ja s'ha produït la tuberculosi. Com més fort sigui el sistema immunitari, més eficaçment el cos pot defensar-se d'un atac del bacil de la tuberculosi i produir prou anticossos per combatre la malaltia. Per tant, mantenir una nutrició adequada, un exercici adequat i una actitud positiva pot millorar la immunitat i afavorir la recuperació.

En conclusió, hi ha una forta relació entre la immunitat i la tuberculosi. Mantenir una bona salut i millorar la immunitat és una de les maneres importants de prevenir i tractar la tuberculosi. Afrontem la vida de manera positiva, mantenim un estil de vida saludable i estiguem allunyats de les malalties. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la nostra immunitat. Cistanche pot millorar significativament la immunitat, perquè la cendra de carn conté una varietat de components biològicament actius, com ara polisacàrids, dos bolets, Huang Li, etc. Aquests components poden estimular el sistema immunitari. Diversos tipus de cèl·lules del sistema augmenten la seva activitat immune.

Feu clic a Beneficis per a la salut del cistanche

Aquest estudi tenia com a objectiu dissenyar una vacuna multiepítop contra la tuberculosi mitjançant un enfocament immunoinformàtic. Mitjançant l'enriquiment funcional, vam identificar vuit proteïnes secretades per M. tuberculosis que són necessàries per a la patogènesi, secretades a l'espai extracel·lular o totes dues. A continuació, es van analitzar els epítops d'aquestes proteïnes i es van seleccionar 16 epítops de limfòcits T auxiliars amb activitat inductora d'interferó, 15 epítops de limfòcits T citotòxics i 10 epítops lineals de cèl·lules B, i els vam conjugar amb adjuvant i epítop d'unió a Pan HLA DR (PADRE) mitjançant l'ús adequat. enllaçadors.

A més, vam predir l'estructura terciària d'aquesta vacuna, la seva interacció potencial amb el receptor Toll-Like-4 (TLR4) i la resposta immune que podria provocar. Els resultats van demostrar que aquesta vacuna tenia una forta afinitat per TLR4, que podria estimular significativament les cèl·lules CD4 plus i CD8 plus per segregar factors immunològics i els limfòcits B per segregar immunoglobulines, per obtenir una bona immunitat humoral i cel·lular. En general, es va predir que aquesta proteïna multiepítop era estable, segura, altament antigènica i altament immunogènica, que té el potencial de servir com a vacuna global contra la tuberculosi.

1. Introducció

La tuberculosi (TB), una malaltia altament contagiosa causada per Mycobacterium tuberculosis, està classificada per l'Organització Mundial de la Salut (OMS) com la principal causa de mort per un sol agent infecciós [1–3]. El 2021, el nombre estimat de morts per tuberculosi i de nous casos va arribar a 1,6 milions i 10,6 milions, respectivament [4]. Actualment, el tractament clínic de la TB és relativament escàs i s'utilitza principalment la combinació de múltiples fàrmacs antimicrobians.
Aquest cicle de quimioteràpia és molt llarg, normalment triga de nou a dotze mesos, o fins i tot més [5], la qual cosa augmenta el risc de mutacions resistents als fàrmacs en M. tuberculosis [6,7]. En els últims anys, la quimioteràpia s'ha tornat menys eficaç a causa de l'aparició i la proporció creixent de M. tuberculosis multifàrmac i molt resistent als fàrmacs [6]. Prevenir el desenvolupament de la tuberculosi pot ser més eficaç que tractar-la. Se sap que la vacunació és una manera eficaç de protegir l'hoste dels bacteris patògens [8].

Actualment, el Bacillus Calmette-Guérin (BCG), desenvolupat fa més de 100 anys, és l'única vacuna antituberculosa aprovada clínicament [9]. Malauradament, el BCG només protegeix els nadons i els nadons i és en gran mesura ineficaç contra adolescents i adults [2,10], tot i que l'OMS informa que el 89 per cent dels casos de tuberculosi el 2021 eren adults [4]. Per tant, hi ha una necessitat urgent de desenvolupar una vacuna antituberculosa nova i eficaç, especialment per a adolescents i adults.

El desenvolupament de la vacuna contra la tuberculosi es veu complicat per múltiples característiques dels micobacteris, com ara la infecció latent, la persistència i l'evasió immune [11-13]. S'hauria de dissenyar una vacuna ideal contra la tuberculosi per orientar les proteïnes / vies responsables d'aquestes propietats a M. tuberculosis i poder induir de manera eficient respostes immunes mediades per cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus [14].

A més, una vacuna eficaç també hauria de dirigir-se als principals complexos d'histocompatibilitat (MHC) de l'hoste, que són altament polimòrfics [15]. Aquestes característiques plantegen uns requisits molt elevats per a la versatilitat de la vacuna, que òbviament no es pot aconseguir amb una sola proteïna natural. La vacuna multiepítop, una proteïna recombinant que consisteix en una sèrie d'epítops (pèptids) superposats [16], és un nou tipus de candidat a vacuna que pot abordar els problemes anteriors.

En els darrers anys, les vacunes multiepítopes han cridat molta atenció a causa dels seus avantatges d'una major immunitat i una menor al·lergenicitat que les vacunes convencionals [17,18]. Actualment, s'han dissenyat vacunes multiepítopes contra molts microorganismes patògens, incloent Shigella spp. [19], virus de la febre aftosa [20], Helicobacter pylori [21,22], virus de l'hepatitis B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], virus Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] i virus de la leucosi [29].

En particular, l'aparició de la pandèmia COVID-19 ha reforçat l'aplicació d'aquesta tecnologia [16,30–32]. Pel que fa a la tuberculosi, s'han dissenyat diverses vacunes multiepítopes per orientar la tuberculosi inherentment activa [33–39] i la tuberculosi latent [40,41]. Entre ells, es van dissenyar tres candidats a vacunes en forma d'ADN [34,36,40], i dos d'ells van incorporar epítops a la columna vertebral de proteïnes per generar vacunes recombinants [34,36].

Cal tenir en compte que les proteïnes candidates per a algunes de les vacunes multiepítopes anteriors es seleccionen aleatòriament i la cobertura de la població d'aquestes vacunes requereix més estudis.

A més, es van dissenyar dos candidats a la vacuna antituberculosa multiepítop amb una àmplia cobertura poblacional, un epítop es va seleccionar a partir de proteïnes vesícules d'exosomes immunogènics amb propietats patògenes [39] i l'altre no se centra en proteïnes candidates, sinó que selecciona directament les proteïnes altament conservades i validades experimentalment. epítops de la base de dades d'epítops immunitaris (IEDB) [38]. Tanmateix, aquestes proteïnes candidates no tenen enriquiment funcional i la capacitat dels candidats a la vacuna per induir la secreció d'interferó (IFN-) encara està per millorar.

Un estudi anterior ha deduït que l'optimització racional dels epítops es pot aconseguir mitjançant una combinació de la capacitat d'unió a MHC i la capacitat de l'epítop de reaccionar amb receptors de cèl·lules T [42]. A més, van predir que les vacunes amb epítops d'unió de limfòcits T citotòxics (CTL) A1, A2, A3, A24 i B7 tindrien una cobertura de gairebé el 100 per cent en els principals grups ètnics (negres, asiàtics, hispans i caucàsics).

Tanmateix, fins ara no hi ha hagut cap enfocament similar per dissenyar una vacuna contra la tuberculosi. En aquest estudi, vam dissenyar una vacuna contra la tuberculosi multiepítop molt promiscua utilitzant diverses característiques antigèniques de vuit proteïnes enriquides amb funcions. La vacuna candidata quimèrica posseeix 15 epítops CTL, 16 epítops de limfòcits T auxiliars (HTL) amb propietats induïdores d'IFN- - i 10 epítops de cèl·lules B lineals. L'anàlisi immunoinformàtica va demostrar que aquesta vacuna candidata era "total", la qual cosa la converteix en una pedra angular potencial per assolir l'estratègia "Finalitzar la tuberculosi".

2. Materials i mètode

2.1. Selecció de proteïnes i recuperació de seqüències

Per construir una vacuna multiepítop contra la tuberculosi, primer vam seleccionar proteïnes del complex M. tuberculosis, que es dipositen a la base de dades IEDB [43] i s'han validat com a epítops d'unió a MHC de classe I i II. Les seqüències d'aminoàcids (estructura primària) de proteïnes de la soca H37Rv de M. tuberculosis es van obtenir de la base de dades UniProt [44]. Es van obtenir prediccions independents de l'alineació d'antígens potencials basades en propietats fisicoquímiques del servidor VaxiJen 2.0 [45], que va patir una transformació automàtica i de covariància creuada (ACC) de seqüències de proteïnes en un vector uniforme d'aminoàcids principals. propietats, amb el llindar d'antigenicitat establert en 0.4 per a cada proteïna bacteriana [45,46].

L'anotació funcional de les proteïnes es va avaluar mitjançant la base de dades per a l'anotació, la visualització i el descobriment integrat (DAVID) 6.8 [47]. Les proteïnes secretades es van enriquir encara més mitjançant dues categories: espai extracel·lular i patogènesi a través de les bases de dades DAVID i BioCyc [48], respectivament. El proteoma de l'Homo sapiens GRCh38.p13 es va descarregar en format FASTA de la base de dades del National Center for Biotechnology Information (NCBI) [49]. BLASTp es va utilitzar per predir l'homologia (valor E =1e{-5) entre proteïnes secretades i proteïnes de H. sapiens.

2.2. Predicció d'epítops de cèl·lules T

La predicció i selecció d'epítops són passos crucials en la construcció de vacunes multiepítopes. Les molècules MHC I s'uneixen a pèptids curts (9-11 aminoàcids) perquè l'escletxa d'unió a pèptids de les molècules MHC I que consisteix en una única cadena està tancada [50]. El NetMHCpan-4.1 [51] de lliure accés es va utilitzar per a la predicció d'epítops CTL, que utilitza NNAlign_MA per generar rangs percentuals (ranking percentual) basats en una combinació d'afinitats d'unió a MHC I i lligands eluïts. .

El "percentatge de classificació" d'una seqüència de consulta es va determinar comparant la seva puntuació de predicció amb la distribució de puntuacions de predicció per al MHC rellevant calculada mitjançant un conjunt de pèptids natius escollits aleatòriament. Els epítops amb un percentatge de classificació < 0,5 per cent es van considerar aglutinants forts, mentre que els epítops amb un percentatge de classificació < 2 per cent es van considerar aglutinants febles [51].

Tot i que al servidor es poden predir fins a 12 epítops MHC de classe I de supertipus, només hem utilitzat A1, A2, A3, A24 i B7 perquè aquests cinc supertipus cobreixen l'100 per cent de les principals races humanes [42] . Vam seleccionar aglutinants forts i vam predir la seva antigenicitat mitjançant VaxiJen2.0 [45] i, a continuació, vam predir la immunogenicitat de classe I mitjançant la base de dades internacional d'epítops (IEDB) [52], que utilitza la validació creuada 3-.

Finalment, vam organitzar epítops que eren tant antigènics com immunogènics segons el percentatge de classificació i vam seleccionar 15 epítops de baixa puntuació, tres per a cada supertipus i almenys un per a cada proteïna candidata, tret d'una proteïna candidata que no podia tenir un epítop fort d'unió a CTL. que és antigènic i immunogènic. Finalment, els valors IC50 per a cada epítop CTL es van predir a partir de NetMHC-4.0 [53].
Les molècules MHC de classe II s'uneixen a pèptids antigènics i el complex resultant pot ser reconegut per HTL. Normalment, els pèptids antigènics oscil·len entre 12 i 20 residus d'aminoàcids, però sovint s'observen pèptids entre 13 i 16 residus de longitud [54].

Els {{0}}mers eren els epítops MHC II més abundants de M. tuberculosis i s'han dipositat a IEDB. Com a resultat, vam utilitzar el NetMHCIIpan-4.0 [51,55] per predir la unió de pèptids 15-mer a l'antigen de leucòcits humans-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, i al·lel H-2–1. La predicció també es va basar en NNALign_MA amb una classificació percentual de < 2 per cent i < 10 per cent considerats com a aglutinants forts i febles, respectivament [51].

A més, vam predir 15-mer epítops induïdors d'IFN per a proteïnes candidates mitjançant el servidor IFNepitope [56], que utilitza un enfocament híbrid de màquina de vectors de suport que permet la detecció virtual de pèptids/epítops que indueixen IFN- - en un pèptid. biblioteca formada per IFN- -aglutinants MHC II inducibles i no induïbles que activen les cèl·lules T-helper. A continuació, vam predir l'antigenicitat dels epítops que indueixen IFN [45] i, finalment, vam seleccionar els 16 epítops més promiscus que eren forts unió a MHC-II, inductors d'IFN i antigènics.

És important tenir en compte que els pèptids senyal es van eliminar de les proteïnes candidates abans de la predicció de l'epítop. En aquest estudi, els pèptids senyal es van seleccionar mitjançant SignalP 5.0 [57] i TargetP2.0 [58].

2.3. Predicció lineal de l'epítop de cèl·lules B

Els epítops de cèl·lules B lineals (16-mers) es van predir mitjançant ABCpred [59,60] amb un llindar predeterminat de 0,51. A més, per augmentar la fiabilitat dels resultats de predicció, també hem utilitzat BepiPred 2.0 [61] per predir epítops de cèl·lules B lineals. Els epítops obtinguts d'aquests dos programaris es van sotmetre a més a predicció d'antigenicitat mitjançant VaxiJen2.0 [45]. Finalment, vam seleccionar deu epítops lineals de cèl·lules B basats en puntuacions ABCpred altes i antigenicitat, amb almenys un epítop seleccionat per a cada proteïna candidata.

2.4. Construcció del candidat a la vacuna multiepítop amb propietats quimèriques

La vacuna multiepítop dissenyada conté un adjuvant HBHA (hemaglutinina que s'uneix a l'heparina), un epítop d'unió a Pan HLA DR (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 epítops de cèl·lules B lineals i una etiqueta His × 6 (Fig. 3). Els enllaços es van utilitzar per unir epítops, prevenir la producció d'epítops d'unió i millorar la processó i la regeneració d'epítops individuals en vacunes quimèriques [62].

Per a la construcció d'aquest candidat a la vacuna, l'adjuvant HBHA (UniProt ID: P9WIP9) es va localitzar a l'extrem N-terminal i es va enllaçar amb el PADRE aigües avall mitjançant un enllaç EAAAK. Aleshores, els epítops HTL units pels enllaços GPGPG es van vincular a PADRE. A més, els epítops CTL units per l'enllaç AAY es van connectar als epítops HTL mitjançant l'enllaç HEYGAEALERAG, que també es va unir a la unitat d'epítop CTL als epítops lineals de cèl·lules B enllaçats mitjançant enllaços KK. Finalment, es va unir una etiqueta His× 6 a l'extrem C-terminal de la proteïna quimèrica.

2.5. Antigenicitat, al·lergenicitat i propietats fisicoquímiques

El servidor VaxiJen 2.0 [45] va predir l'antigenicitat de la vacuna de múltiples epítops i les vuit proteïnes components, mentre que l'al·lergenicitat d'aquestes proteïnes la va predir el servidor AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 utilitza descriptors E d'aminoàcids, transformació ACC de seqüències de proteïnes i k-nearest neighbors (kNN) per a la classificació d'al·lèrgens.

El mètode va aconseguir un 85,3 per cent de precisió amb una validació creuada de 5- vegades. Per a la predicció de propietats fisicoquímiques com la vida mitjana, el punt isoelèctric, l'índex d'inestabilitat, l'índex alifàtic i la gran mitjana d'hidropatia (GRAVY) d'aquesta vacuna de múltiples epítops, es va utilitzar el servidor ExPASy ProtParam [64].
A més, es va avaluar la solubilitat del pèptid de la vacuna multiepítop mitjançant el servidor proteinSol (PROSO II) [65] basat en un classificador que aprofitava les diferències subtils entre les conegudes proteïnes insolubles de TargetDB i les proteïnes solubles tant de TargetDB com de PDB [65]. 66]. Quan es va avaluar mitjançant la validació creuada de 10-plegament, va aconseguir un 71.0 per cent de precisió (àrea sota la corba ROC=0.785).

2.6. Simulació immunitària

Per caracteritzar el perfil de resposta immune i la immunogenicitat de la vacuna, es van realitzar simulacions immunes in silico mitjançant el servidor C-ImmSim [67]. C-ImmSim prediu les interaccions immunes mitjançant matrius de puntuació específiques de posició derivades de tècniques d'aprenentatge automàtic per a la predicció de pèptids.
Simultàniament, simula tres compartiments que representen tres regions anatòmiques separades que es troben en mamífers: (i) la medul·la òssia, on es van simular cèl·lules mare hematopoètiques per produir nous limfòcits i cèl·lules mieloides; (ii) el tim, on es van seleccionar cèl·lules T ingènues per evitar l'autoimmunitat; i (iii) l'òrgan limfàtic com els ganglis limfàtics.

Per preparar i augmentar la vacuna de manera efectiva, vam seguir l'enfocament de [68] on es van administrar dues injeccions amb quatre setmanes de diferència. Tots els paràmetres de simulació es van establir als valors predeterminats, amb els passos de temps establerts a 10 i 94 (cada pas de temps és de vuit hores).

2.7. Predicció de la regió desordenada

Les regions intrínsecament desordenades (IDR) estan presents en moltes proteïnes. La regió desordenada es va predir mitjançant DISOPRED3 [69], que utilitza DISOPRED2 i altres dos mòduls basats en aprenentatge automàtic entrenats en grans IDR per identificar residus desordenats. Aleshores eren anno

2.8. Predicció d'estructura secundària i terciària

L'estructura secundària de la vacuna dissenyada la va predir el servidor PSIPRED 4.0 [70], que primer utilitza PSI-BLAST per identificar seqüències estretament relacionades amb la proteïna de consulta. L'estructura terciària d'aquesta vacuna es va predir mitjançant el servidor Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

Hi ha quatre passos clau en el modelatge ITASSER; a) identificació de la plantilla de fil; b) simulació iterativa de muntatge d'estructura; c) selecció i perfeccionament del model; i d) anotació funcional basada en l'estructura [72, 73].

I-TASSER va generar cinc models, que es van examinar mitjançant ProSA-web [74], i es va seleccionar el model amb la puntuació Z més baixa per a un millor perfeccionament. ProSA-web compara les puntuacions del model obtingudes a partir d'estructures verificades experimentalment dipositades a PDB. Un diagrama de puntuació de qualitat local ajuda a identificar àrees problemàtiques en el model, i les mateixes puntuacions es van representar mitjançant un codi de color a la presentació de l'estructura 3D. Això és útil per a la determinació i perfeccionament estructurals primerencs.

2.9. Refinament de l'estructura terciària

El model 3D "gruixut" del candidat a la vacuna obtingut per ITASSER es va perfeccionar en dos passos mitjançant dos servidors; primer amb ModRefiner [75] seguit de GalaxyRefine [76]. ModRefiner utilitza traces C per afectar la construcció i el refinament de proteïnes obtingudes mitjançant la minimització d'energia a nivell atòmic en dos passos.

Primer, es van utilitzar les traces C per construir la cadena principal, seguida del perfeccionament dels rotàmers de la cadena lateral i els àtoms de la columna vertebral mitjançant camps de força compostos basats en la física i el coneixement. GalaxyRefine utilitza diverses plantilles per generar estructures centrals fiables, mentre que els bucles o terminals poc fiables es van generar mitjançant el modelatge basat en l'optimització.

2.10. Validació d'estructura terciària

L'estructura refinada del candidat a la vacuna es va validar mitjançant diagrames de Ramachandran generats a partir de les bases de dades PROCHECK [77] i MolProbity [78]. Els diagrames de Ramachandran avaluen la conformació de la columna vertebral de les proteïnes dividint els residus d'aminoàcids en dues regions: permesa i no permesa. PROCHECK utilitza l'estereoquímica per avaluar la qualitat neta de les estructures de proteïnes comparant-les amb les estructures refinades a la mateixa resolució i, a continuació, presentant regions que requereixen una anàlisi addicional.

Molprobity valida models de macromolècules locals i globals (proteïnes i àcids nucleics) mitjançant una barreja de criteris de raigs X, RMN, computacionals i crioEM [79]. La potència i la sensibilitat per optimitzar la col·locació d'hidrogen i l'anàlisi de contacte de tots els àtoms s'utilitzen àmpliament en una versió actualitzada dels criteris de geometria covalent i angle de torsió [80].

2.11. Epítops discontinus de cèl·lules B

Els epítops de cèl·lules B discontinus a l'estructura de la proteïna nativa es van predir mitjançant ElliPro [81]. ElliPro implementa tres algorismes per aproximar la forma de la proteïna com un el·lipsoide, calcula l'índex de protrusió de residus (PI) i agrupa els residus veïns en funció dels seus valors de PI. ElliPro proporciona a cada epítop de sortida una puntuació descrita com el valor PI mitjà per al residu d'epítop. Un el·lipsoide amb un valor PI de 0,9 consta del 90 per cent dels residus proteics continguts, mentre que el 10 per cent restant dels residus es troben fora de l'el·lipsoide. Per a cada residu d'epítop, el valor PI es calcula a partir del centre de massa del residu que es troba fora de l'el·lipsoide més gran possible.

2.12. Acoblament molecular de proteïnes quimèriques

L'acoblament molecular de la vacuna dissenyada (lligant) amb el receptor immune Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) es va realitzar mitjançant Patchdock [82]. Els 10 millors models es van perfeccionar amb FireDock [83]. PatchDock substitueix la representació de la superfície del punt de Connolly de les molècules per taques còncaves, convexes i planes.

A continuació, es van puntuar els models basant-se en l'ajust geomètric i la desolvació atòmica. [82]. FireDock optimitza les conformacions de la cadena lateral i l'orientació del cos rígid i genera una sortida d'un complex refinat en 3D basat en l'energia d'unió [83]. Hem seleccionat el primer model de Firedock basat en l'energia global com a complex d'acoblament. Finalment, es va predir l'energia d'unió i el contingut de dissociació dins del complex d'acoblament mitjançant el servidor PRODIGY [84].

2.13. Simulació de la dinàmica molecular

Es van realitzar simulacions dinàmiques moleculars sobre proteïnes mitjançant el servidor web ràpid i d'accés lliure, el servidor d'anàlisi en mode normal de coordenades internes (iMODS) [85] i es van obtenir resultats d'acoblament coherents i òptims del servidor PatchDock-FireDock. En coordenades internes, l'anàlisi en mode normal (NMA) genera moviments col·lectius crítics per a la funció macromolecular. iMODS presenta mecanismes per explorar aquests modes com l'anàlisi de vibracions, animacions de moviment i trajectòries de transformació que es van dur a terme de manera gairebé interactiva a diferents resolucions [85].

2.14. Traducció inversa, optimització de codons i clonació in silico de la vacuna

Per expressar eficaçment el candidat a la vacuna a les cèl·lules d'Escherichia coli, l'ADNc es va generar in silico mitjançant l'optimització de codons i la traducció inversa mitjançant l'eina d'adaptació de codis de Java (JCAT) [86].

L'optimització va implicar (i) evitar els terminadors transcripcionals independents de rho, ii) evitar els llocs d'unió dels ribosomes procariotes, (iii) evitar el lloc de ruptura dels enzims de restricció NcoI i XhoI, que serveix com a llocs de restricció N-terminal i C-terminal per a la inserció d'ADNc plantilla de vacuna i (iv) només optimització parcial per aplicar la mutagènesi dirigida al lloc. L'índex d'adaptació de codons (CAI) i el contingut de GC van predir la qualitat de l'ADNc amb un codó d'aturada opal (TGA) inserit després de l'etiqueta His × 6. A continuació, el fragment d'ADN optimitzat del candidat a la vacuna quimèrica es va integrar a la cadena inversa de pET-28a(plus) mitjançant l'eina SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com