Activitats antienvelliment in vitro d'extractes etanòlics de rambutà rosa (Nephelium Lappaceum Linn.) per a aplicacions cutànies Part 1

abstracte

L'envelliment de la pell es caracteritza per característiques com ara arrugues, pèrdua d'elasticitat, laxitud, aspecte de textura rugosa, melasma i pigues. Diversos tipus d'investigació s'han centrat a prevenir i tractar l'envelliment de la pell amb molts ingredients naturals. Aquest estudi pretenia avaluar les activitats antienvelliment per a l'envelliment de la pell dels extractes etanòlics de rambutà rosa (PR) (Nephelium lappaceum Linn.) de fulles (L), branques (B), llavors (S) i peles de fruits madurs (R) i joves (Y). Els rendiments d'extracció de tot el rambutà rosa (PR) extret mitjançant la maceració (M) i l'extracció Soxhlet (Sox) utilitzant un 95 per cent d'etanol com a dissolvent, van oscil·lar entre l'10,62 per cent i el 30 ,63 per cent. Els flavonoides es van trobar com els principals fitoquímics en gairebé tots els extractes de PR. Els extractes de PR-YM i PR-Y-Sox van donar els continguts fenòlics totals més alts per l'assaig Folin-Ciocalteu de 67,60 ± 4,38 mgGAE/g, i el contingut total de flavonoides per l'assaig colorimètric de clorur d'alumini modificat de 678,72 ± 23,59 mgQE/g, respectivament. Els extractes de PR-LM van mostrar les tres activitats antioxidants més altes; eliminació de radicals lliures (SC50 de 0,320 ± 0.{{4{0}}70 mg/mL) , inhibició de la peroxidació lipídica (LC50 de 0,274 ± 0,029 mg/mL) i activitat de quelació de metalls (MC50 de 0,203 ± 0,021 mg/mL). Tots els extractes de PR a 0, 01 i 0, 1 mg/ml no van mostrar citotoxicitat a les cèl·lules B16F10 i als fibroblasts de la pell humana, respectivament. De la mateixa manera, l'extracte de PR-R-Sox va mostrar la anti-melanogènesi més alta a les cèl·lules B16F10 (52, 7 ± 0, 9 per cent) i l'activitat d'inhibició de la tirosinasa de bolets (IC50 de 0, 04 ± 0, 02 mg/mL), que va ser significativament comparable a àcid cògic (p < 0,05). L'extracte de PR-Y-Sox va mostrar la biosíntesi de col·lagen pel mètode Sirius Red i l'estimulació de gens anti-envelliment (Sirt1 i Foxo1) en fibroblasts de pell humana mitjançant el mètode RT-PCR, que era similar als estàndards ʟ-àcid ascòrbic i resveratrol, respectivament. Aquest estudi suggereix que els extractes de PR-R-Sox i PR-Y-Sox es poden desenvolupar encara més com a agents naturals anti-envelliment per blanquejar i anti-arrugues a les indústries cosmètica, cosmecèutica i farmacèutica. 2023 L'autor(s). Publicat per Elsevier BV en nom de la King Saud University.

El glicòsid de cistanche també pot augmentar l'activitat de la SOD en els teixits del cor i del fetge, i reduir significativament el contingut de lipofuscina i MDA a cada teixit, eliminant eficaçment diversos radicals reactius d'oxigen (OH-, H₂O₂, etc.) i protegint contra els danys de l'ADN causats. per radicals OH. Els glucòsids feniletanoides de Cistanche tenen una forta capacitat d'eliminació dels radicals lliures, una capacitat reductora superior a la de la vitamina C, milloren l'activitat de SOD en la suspensió d'esperma, redueixen el contingut de MDA i tenen un cert efecte protector sobre la funció de la membrana espermàtica. Els polisacàrids de Cistanche poden millorar l'activitat de SOD i GSH-Px en eritròcits i teixits pulmonars de ratolins senescents experimentalment causats per D-galactosa, així com reduir el contingut de MDA i col·lagen al pulmó i el plasma, i augmentar el contingut d'elastina. un bon efecte d'eliminació de DPPH, allarga el temps d'hipòxia en ratolins senescents, millora l'activitat de SOD al sèrum i retarda la degeneració fisiològica del pulmó en ratolins senescents experimentalment Amb la degeneració morfològica cel·lular, els experiments han demostrat que Cistanche té la bona capacitat antioxidant. i té el potencial de ser un fàrmac per prevenir i tractar malalties de l'envelliment de la pell. Al mateix temps, l'echinacòsid a Cistanche té una capacitat significativa per eliminar els radicals lliures de DPPH i té la capacitat d'eliminar espècies reactives d'oxigen i prevenir la degradació del col·lagen induïda pels radicals lliures, i també té un bon efecte reparador sobre el dany anònic dels radicals lliures de timina.

Feu clic a On puc comprar Cistanche

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】

1. Introducció

A nivell mundial, l'envelliment de la població mundial està creixent més ràpidament que tots els altres grups d'edat. L'Organització Mundial de la Salut va estimar que la població mundial de més de 60 anys seria de 2.100 milions l'any 2050 i s'enfrontarà a malalties comunes com l'artrosi, la diabetis, la pèrdua auditiva, la malaltia d'Alzheimer, les malalties pulmonars obstructives cròniques (MPOC), la depressió i la demència. , càncers i malalties neurològiques i cardiovasculars (Darawsha et al., 2021, OMS, 2021). La pell és un dels òrgans més visibles durant el procés d'envelliment. L'envelliment de la pell està relacionat amb la comunicació social perquè les bones aparences fan una impressió favorable i milloren l'autoconfiança. L'envelliment de la pell es veu afectat per factors ambientals o externs com els contaminants de l'aire, els xenobiòtics, la radiació UV i el tabaquisme, i per factors interns com la genètica, el metabolisme cel·lular, les hormones i els processos metabòlics (Darawsha et al., 2021). Molts tipus d'investigacions recents s'han centrat a mantenir una pell sana ajornant, prevenint i tractant l'envelliment per millorar l'aspecte de la pell regenerant i estimulant processos fisiològics naturals per protegir la pell de l'envelliment.

Les espècies reactives d'oxigen (ROS) de l'estrès oxidatiu cel·lular poden provocar la inducció de la mort cel·lular apoptòtica mitjançant l'activació de processos inflamatoris i les seves vies de senyalització, augmentant els nivells de metaloproteinases (MMP), la degradació de lípids insaturats i canviant les estructures fibril·lars. proteïnes que inclouen col·lagens i elastina que es deuen a l'envelliment de la pell (Miastkowska i Sikora, 2018, Darawsha et al., 2021). Després de la melanogènesi, la melanina és un pigment polifenòlic produït en melanosomes de melanòcits que es troben als ulls, pèls i pells dels animals, i que pot protegir la pell danyada per la radiació ultraviolada (Ali i Naaz, 2018). La tirosinasa és l'enzim que conté coure, que pot transformar la L-tirosina en L-dopa i la L-dopa en odopaquinona-H més mitjançant reaccions d'hidroxilació i oxidació, i després passa per intermedis, finalment, a melanina (Solano, 2018). El ROS també té un paper important en la regulació de l'estrès oxidatiu cel·lular en els melanòcits, que són cèl·lules dendrítiques que es localitzen a la capa basal de l'epidermis de la pell. Els mediadors inflamatoris de la pell com la interleucina (IL), la prostaglandina E2, el factor de necrosi tumoral i l'interferó gamma que són secretats principalment per les cèl·lules Th, els limfòcits, les cèl·lules dendrítiques i els monòcits, regulen l'activitat estimulant de la tirosinasa i la regulació positiva del TYRP{{11} }} i TYRP-2 expressió i promoció de la proliferació de melanòcits relacionada amb la producció de melanina (Fu et al., 2020). Tanmateix, la sobreproducció i l'elevada acumulació de melanina provoquen l'envelliment de la pell com el melasma, les pigues, les taques fosques, el lentigo i els trastorns d'hiperpigmentació, que poden ser estèticament indesitjables (Ali i Naaz, 2018).

Les sirtuïnes són histona desacetilasa de classe III dependent de la nicotinamida adenina dinucleòtid (NAD plus) que regula la senescència cel·lular i l'apoptosi i el creixement cel·lular controlant p53, els factors de transcripció forkhead (FOXO) i el receptor gamma activat per proliferador de peroxisomes (PPAR-c) que inclou regulacions del metabolisme, diferenciació cel·lular, supervivència i envelliment. (Son et al., 2021). Els SIRT1, SIRT6 i rarament SIRT7 de la família de les sirtuïnes s'han regulat per problemes dermatològics, com ara inflamació de la pell, infecció cutània, càncer, malalties autoimmunes, malalties dermatològiques hereditàries, especialment l'envelliment de la pell (Son et al., 2021). A més, FOXO1 és un factor de transcripció que es troba al citoplasma. SIRT1 desacetila FOXO1 i activa la transcripció de FoxO1 en múltiples vies com la MAPK (proteïna quinasa activada per mitògens), la proteïna cinasa (AKT) i les vies homeobox-1 pancreàtica i duodenal (Pdx1) (Sin et al., 2015) . L'augment de l'expressió d'ARNm de Sirt1 i Foxo1 regula el metabolisme de la glucosa, la reparació de l'ADN, la neuroprotecció, la diferenciació, la protecció vascular i la secreció d'insulina; i disminueix l'envelliment i les malalties relacionades amb l'edat com l'estrès oxidatiu, la senescència cel·lular, la neurodegeneració, la inflamació, la resistència a la insulina, les malalties cardiovasculars, l'adipositat i l'esteatosi hepàtica, així com l'envelliment de la pell (Son et al., 2021).

La Llei de productes farmacèutics (drogues) i cosmètics de 1940 defineix un medicament com "tots els medicaments per a usos interns o externs per éssers humans o animals, i totes les substàncies destinades a ser utilitzades per al diagnòstic, tractament, mitigació o prevenció de qualsevol malaltia o trastorn en humans o animals." Cosmètica és qualsevol article destinat a ser fregat, abocat, ruixat o ruixat, introduït o aplicat a qualsevol part del cos humà per netejar, embellir, promoure l'atractiu o alterar el Els cosmecèutics són híbrids cosmètics i farmacèutics destinats a millorar la salut i la bellesa mitjançant ingredients que influeixen en les textures i funcions biològiques de la pell (Joshi i Pawar, 2015). Els cosmètics, els cosmecèutics i els productes farmacèutics contenen compostos actius que neutralitzen els radicals lliures com la vitamina E, la vitamina C, el glutatió i el coenzim Q10; i retarden l'envelliment de la pell a causa d'arrugues i melasma com àcids nucleics, hidrolitzats de proteïnes, extractes d'algues, olis vegetals, fitohormones. , citocines i neuropèptids (Kim et al., 2015, Miastkowska i Sikora, 2018), així com polifenols i flavonoides de diversos extractes de plantes naturals com els extractes de Vigna subterranean, Stichopus japonicus, Citrus aurantifolia, Ananus comosus i esculenta (Chutoprapat et al., 2020; Ding et al., 2020 Boonpisuttinant et al., 2022, Jampa et al., 2022).

El rambutà rosa o Ngo See Chom Pu (Nephelium lappaceum L.) és una planta de la família de les Sapindaceae, que és la planta autòctona del districte de Klung, província de Chanthaburi, a la part oriental de Tailàndia. Les fruites de rambutà rosa (PR) són dolces i tenen un bon gust. Tenen una pela fina amb l'escorça de color rosa groguenc i l'espina rosa clar amb una punta verd clar, diferent de la resta d'espècies com Ngo Rongrien i Ngo Nasarn, que tenen les escorces i espines de color vermell clar. Els principals fitoquímics que es troben a les plantes de rambutà són l'àcid elàgic, la corilagina, la geraniïna, la quercetina i la rutina (Phuong et al., 2019, Phuong et al., 2020). S'ha informat anteriorment que s'ha trobat que les closques de rambutà de les altres espècies tenen un alt nivell de compostos fenòlics i tenen moltes activitats biològiques com ara l'eliminació de radicals DPPH, antiinflamatòries, antivirals, anticancerígenes i antibacterianes (Chingsuwanrote et al. ., 2016; Hernández-Hernández et al., 2019; Rohman, 2017; Sukmandari et al., 2017; Thitilertdecha i Rakariyatham, 2011). Tanmateix, els extractes de rambutà rosa no tenen cap informe científic per a activitats biològiques, especialment activitat anti-envelliment per a la salut de la pell i fins estètics. Per tant, l'estudi actual tenia com a objectiu avaluar i avaluar el potencial dels extractes de PR en aplicacions cutànies en cosmètics, cosmecèutics i farmacèutics. Les investigacions d'activitats biològiques anti-envelliment in vitro, incloent la inhibició de la tirosinasa i l'antimelanogènesi, la biosíntesi de col·lagen i l'estimulació de les expressions d'ARNm Sirt1 i Foxo1, i les tres activitats antioxidants, així com la citotoxicitat en fibroblasts dèrmics humans, indiquen l'eficiència. i la seguretat dels extractes de PR que es poden desenvolupar encara més a productes naturals per a la cura de la pell.

2. Materials i mètodes

2.1. Preparació i extracció

Les cinc parts del rambutà rosa (PR), incloses les fulles (L), les branques (B), les llavors (S) i les peles de fruites madures (R) i joves (Y) es van recollir del districte de Klung, Chantaburi, Tailàndia de juny a Agost de 2017. Els exemplars de val van ser identificats per un botànic a l'Herbari Forestal de Tailàndia i registrats a l'herbari (Codi: RSPG-RMUTT-0102) de Productes Naturals Innovadors de la Unitat de Recerca de la Saviesa Tailandesa, Facultat de Medicina Integrativa, RMUTT , Pathum Thani, Tailàndia. Totes les parts del rambutan rosa es van tallar, es van rentar amb aigua de l'aixeta, es van assecar a 60 graus en un forn d'aire calent i es van triturar en pols amb un molinet. Totes les parts dels rambutans rosa es van extreure per maceració i extracció Soxhlet utilitzant etanol al 95 per cent com a dissolvent, que és el més utilitzat per a l'extracció de plantes medicinals perquè és segur i econòmic. Breument, es van extreure 10 g de cadascuna de les pols de PR mitjançant (1): la maceració (M) en 100 ml d'etanol al 95 per cent (v/v) (Bangkok Alcohol Industrial, Tailàndia) amb agitació a 200 rpm a temperatura ambient. (25 ± 2 graus) durant 48 h; i (2): l'extracció Soxhlet (Sox) amb 100 ml d'etanol al 95 per cent (v/v) a 80 ± 5 graus C durant 24 h. Després d'això, els extractes es van filtrar primer a través de cotó i després es van passar per un paper de filtre connectat a una bomba de buit. Els filtrats es van recollir, agrupar i assecar mitjançant un evaporador rotatiu. Els extractes bruts de PR es van guardar en ampolles de vidre i es van emmagatzemar a 4 graus a la nevera fins que es van utilitzar. Els rendiments d'extracció es van realitzar en funció del pes sec. L'etanol al 95 per cent es va utilitzar com a dissolvent per dissoldre els extractes de PR abans dels experiments.

2.2. Productes fitoquímics, fenòlics totals i flflavonoides i continguts de quercetina

Els fitoquímics com antraquinones, alcaloides, carotenoides, glicòsids, flavonoides, tanins i xantones dels extractes de PR es van investigar tal com es va descriure anteriorment (Boonpisuttinant et al., 2022). Els resultats qualitatius s'expressen com (+) per a la presència i (-) per a l'absència de fitoquímics. Els continguts fenòlics totals (TPC) es van analitzar mitjançant l'assaig Folin-Ciocalteu tal com es va descriure anteriorment (Boonpisuttinant et al., 2022). Breument, es van afegir 50 ll dels extractes de PR, 75 ll de reactiu Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, EUA) i 75 ll de Na2CO3 al 7,5 per cent (p/v) (Loba Chemie, Índia) en un {{13} }ben microplaca, barrejada suaument i després incubada a temperatura ambient en un lloc fosc durant 90 min. A continuació, es van mesurar les absorbances a la longitud d'ona de 725 nm mitjançant un lector de microplaques. Els continguts fenòlics es van calcular a partir de la corba estàndard de l'àcid gàlic (Sigma-Aldrich, EUA). Els resultats es van realitzar en mg d'equivalents d'àcid gàlic (GAE)/g d'extracte.

El contingut total de flavonoides (TFC) pel mètode de clorur d'alumini modificat es va analitzar seguint Shraim et al. (2021). Breument, es van afegir 50 lL dels extractes de PR, 25 lL de 10 per cent d'AlCl3 (BDH Prolabo Chemicals, Bèlgica) i 100 lL de 5 per cent de NaNO2 (Loba Chemie, Índia) a una microplaca de 96-pou. Després de 5 minuts d'incubació, es van afegir a les plaques 25 lL de NaOH 1 M (BDH Prolabo Chemicals, Bèlgica). La reacció es va permetre incubant a temperatura ambient durant 10 min. A continuació, es van mesurar les absorbances a la longitud d'ona de 450 nm mitjançant un lector de microplaques. El contingut de flavonoides es va calcular a partir de la corba estàndard de quercetina (Sigma-Aldrich, EUA). Els resultats es van realitzar en mg d'equivalents de quercetina (QE)/g d'extracte.

El contingut de quercetina dels extractes de PR es va investigar mitjançant el mètode HPLC (Shaikh i Jain, 2018). Breument, es va dissoldre una quantitat de quercetina estàndard pesada amb precisió en metanol en un matràs aforat d'100 mL, per obtenir una solució d'emmagatzematge d'1,000 lg/mL. Les solucions estàndard es van diluir 2- vegades en sèrie a 3,125 mg/mL. Per a la preparació de la mostra, es van dissoldre 2,5 g dels extractes en 25 mL de metanol en 25 mL del matràs aforat per obtenir 1,000 mg/mL. Totes les anàlisis es van realitzar en un sistema HPLC infinit Agilent 1260 (Waters, Milford, MA, EUA) equipat amb un detector de matriu de fotodíodes. La columna analítica utilitzada va ser una columna estesa Agilent Zorbax C18 (5l × 100 mm × 4,6 mm) amb una fase mòbil de metanol: àcid ortofosfòric al 0,1 per cent (75:25) a un cabal de 0,6 ml/min. La temperatura de la columna es va mantenir a 25 graus i la longitud d'ona de detecció es va establir en 370 nm. Totes les solucions i dissolvents es van filtrar a través d'un filtre de 0,22 lm i es van desgasificar. El volum d'injecció de la mostra va ser de 10 ll i el temps d'execució va ser de 8 min.

2.3. Activitat antioxidant

2.3.1. Activitat eliminadora de radicals lliures

L'activitat d'eliminació de radicals lliures dels extractes de PR es va analitzar mitjançant el mètode 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) de Boonpisuttinant et al. (2019). Es va afegir una quantitat de 100 lL dels extractes de PR o àcid ʟ-ascòrbic (Sigma-Aldrich, EUA) com a control positiu i 100 lL de solució de 0,1 mg/mL de DPPH (Sigma-Aldrich, EUA) en etanol absolut. Microplaca de 96 pous. Després de la incubació a temperatura ambient en un lloc fosc durant 30 min, es van mesurar les absorbances a la longitud d'ona de 515 nm mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges d'activitat d'eliminació de radicals DPPH es van calcular segons la fórmula següent:

percentatge d'activitat d'eliminació de radicals DPPH {{0}}[A0 -A1/A0]×100 (1)

On A0 és l'absorbància del control i A1 és l'absorbància de les mostres. Les concentracions que proporcionaven un 50 per cent d'eliminació (SC50) es van calcular a partir del gràfic representat entre el percentatge d'eliminació de radicals lliures i les concentracions de la mostra.

2.3.2. Inhibició de la peroxidació lipídica

La inhibició de la peroxidació lipídica dels extractes de PR es va analitzar mitjançant el mètode de tiocianat fèrric Boonpisuttinant et al. (2019). Es va afegir una quantitat de 50 ll d'extractes de PR o a-tocoferol (Sigma-Aldrich, EUA) com a control positiu i 50 ll d'àcid linoleic al 50 per cent (v/v) de DMSO (Sigma-Aldrich, EUA) a un Microplaca de 96 pous. La reacció es va iniciar mitjançant l'addició de 50 lL de NH4- SCN 5 mM i 50 lL de FeCl2 2 mM. Després de la incubació a 37 graus en un lloc fosc durant 60 min, es van mesurar les absorbances a una longitud d'ona de 490 nm mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges d'inhibició de la peroxidació lipídica es van calcular segons la fórmula següent:

On A0 és l'absorbància del control i A1 és l'absorbància de les mostres. Les concentracions que proporcionen el 50 per cent d'inhibició de la peroxidació lipídica (LC50) es van calcular a partir del gràfic representat entre el percentatge d'inhibició de la peroxidació lipídica i les concentracions de la mostra.

2.3.3. Quelació metàl·lica

La quelació metàl·lica dels extractes de PR es va analitzar mitjançant el mètode de quelat d'ions ferrosos (FIC) per Boonpisuttinant et al. (2019). Es va afegir una quantitat de 50 lL d'extractes de PR o EDTA (Loba Chemie, Índia) com a control positiu, 1 mg/mL de FeCl2 i 50 lL d'1 mg/ml de ferrozina a l'1 per cent de HCl (TCI, EUA). una microplaca de 96 pous. Després de la incubació a temperatura ambient en un lloc fosc durant 60 min, es van mesurar les absorbances a la longitud d'ona de 570 nm mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges de quelació metàl·lica es van calcular segons la fórmula següent:

On A0 és l'absorbància del control i A1 és l'absorbància de les mostres. Les concentracions que proporcionen el 50 per cent de quelació metàl·lica (MC50) es van calcular a partir del gràfic representat entre el percentatge de quelació metàl·lica i les concentracions de la mostra.

2.4. Inhibició de la tirosinasa dels bolets

L'activitat d'inhibició de la tirosinasa de bolets dels extractes de PR es va analitzar mitjançant el mètode de dopacrom modificat (Boonpisuttinant et al., 2022). Una quantitat de 50 ll d'extractes de PR o àcid cògic (Sisco Research Laboratories (SRL), Índia) com a control positiu, 50 ll de 0,1 mg/mL de L-tirosina (Sigma- Aldrich, EUA), es van afegir 50 lL de tampó fosfat de 0,1 mM i 50 lL de tirosinasa de bolets de 0,1 mg/mL (Sigma-Aldrich, EUA) a una microplaca 96-pou. Abans i després de la incubació a 37 graus C en un lloc fosc durant 60 min, es van mesurar les absorbances a la longitud d'ona de 450 nm mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges d'inhibició de la tirosinasa de bolets es van calcular segons la fórmula següent:

percentatge d'inhibició de la tirosinasa de bolets=[(A - B)-(C - D)]/=(A - B)×100 (4)

On A és l'absorbància del blanc després de la incubació, B és l'absorbància del blanc abans de la incubació, C és l'absorbància de les mostres després de la incubació i D és l'absorbància de les mostres abans de la incubació. Les concentracions que proporcionen un 50 per cent d'inhibició de la tirosinasa (IC50 mg/mL) es van calcular a partir del gràfic representat entre el percentatge d'inhibició de la tirosinasa i les concentracions de la mostra

2.5. Activitats anti-envelliment in vitro en cultius cel·lulars

2.5.1. Cultius cel·lulars

Es van utilitzar melanomes murins (B16F10) i fibroblasts de pell humana per investigar l'anti-melanogènesi, la biosíntesi de col·lagen i l'anti-envelliment de l'expressió d'ARNm de Sirt1 i Foxo1, respectivament. Aquestes dues cèl·lules es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC), Virgínia, EUA. Les cèl·lules es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich Biotechnology, St. Louis, MO, EUA) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, EUA). ), 100 UI/ml de penicil·lina i 100 mg/ml d'estreptomicina (Gibco BRL, Gaithersburg, EUA) en condicions estàndard a 37 °C sota la incubadora del 5% de CO2 abans dels experiments.

2.5.2. Prova de citotoxicitat en fibroblasts de pell humana

Les diverses concentracions dels extractes de PR es van investigar per a la citotoxicitat dels melanomes murins (B16F10) i dels fibroblasts de pell humana pel 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il). )-2,5-assaig de bromur de difenil tetrazoli (MTT) com el descrit anteriorment Boonpisuttinant et al. (2022). Els fibroblasts de pell humana amb una densitat d'1 × 104 cèl·lules per pou es van xapar en plaques 96-pous, es van ajustar el volum a 180 lL amb el DMEM i es van incubar a 37 graus sota una atmosfera de CO2 del 5 per cent durant 24 h. Després es van afegir extractes a diverses concentracions. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus C sota una atmosfera de 5 per cent de CO2 durant 24 h. Després d'això, les cèl·lules es van rentar amb PBS 10 mM a pH 6,8 durant 3 vegades i es van afegir 1 mL de 0,5 mg/mL de solució MTT (Sigma-Aldrich, EUA). Després d'incubar a temperatura ambient durant 3 h, es va eliminar la solució MTT i es van afegir 100 lL de sulfòxid de dimetil (DMSO) a cada pou. Les plaques es van agitar suaument a 200 rpm durant 15 min. Les absorbances a la longitud d'ona de 570 nm de les solucions es van mesurar mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges de viabilitat cel·lular es van calcular segons la fórmula següent:

On Acontrol és l'absorbància del control i A mostra és l'absorbància de les mostres.

2.5.3. Anti-melanogènesi en cèl·lules B16F10

L'anti-melanogènesi a les cèl·lules B16F10 dels extractes de PR es va examinar mitjançant el mètode descrit anteriorment per Boonpisuttinant et al. (2022). Les cèl·lules B16F10 amb una densitat de 2,5 × 105 cèl·lules per pou es van sembrar en plaques de 6-pous i es van incubar a 37 graus sota una atmosfera de 5% de CO2 durant la nit. A continuació, es van afegir els extractes a una concentració de 0,01 mg/ml. L'àcid kòjic es va utilitzar com a control positiu. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus sota una atmosfera de 5 per cent de CO2 durant 72 h. Després d'això, els sobrenedants es van recollir als tubs de microcentrífuga nets, mentre que les cèl·lules es van rentar amb solució salina de tampó fosfat (PBS) 10 mM a pH 6,8 durant 3 vegades, es van dissoldre en 200 lL de NaOH al 10 per cent i es van incubar a 60 graus 1 h. . Les absorbances a la longitud d'ona de 450 nm dels sobrenedants i dels lisats cel·lulars es van mesurar mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges del contingut de melanina es van calcular segons la fórmula següent:

2.5.4. Biosíntesi de col·lagen en fibroblasts de pell humana

La biosíntesi de col·lagen dels extractes de PR es va examinar com el mètode descrit anteriorment per Boonpisuttinant et al. (2022). Els fibroblasts de pell humana amb una densitat de 5 × 105 cèl·lules per pou es van sembrar en plaques de 6-pous i es van incubar a 37 graus sota una atmosfera de 5 per cent de CO2 durant la nit. Després es van afegir els extractes a una concentració de 0,1 mg/mL. L'àcid ʟ-ascòrbic es va utilitzar com a control positiu. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus sota una atmosfera de 5 per cent de CO2 durant 24 h. Després d'això, les cèl·lules es van rentar amb PBS 10 mM a pH 6,8 durant 3 vegades, es van afegir 1 mL de solució vermella Sirius al 0,1 per cent (p/v) (Sigma-Aldrich, EUA) a l'àcid pícric saturat (Sisco Research Laboratories (SRL). ), Índia), i després es va incubar a temperatura ambient durant 1 h. Es va eliminar el colorant i es van rentar les plaques amb 1 ml de HCl 10 mM (Merck Millipore, Alemanya) 5 vegades. A continuació, es van dissoldre les cèl·lules afegint 1 ml de NaOH 0, 1 M. Les absorbances a la longitud d'ona de 450 nm dels sobrenedants i dels lisats cel·lulars es van mesurar mitjançant un lector de microplaques. Els percentatges de la quantitat de col·lagen es van calcular segons la fórmula següent:

On, Csample era el contingut de col·lagen de les mostres i Ccontrol era el contingut de col·lagen del control.

2.5.5. Estimulació de gens anti-envelliment en fibroblasts de pell humana

L'estimulació dels gens anti-envelliment (Foxo1 i Sirt1) dels extractes de PR es va determinar mitjançant la RT-PCR tal com es va descriure anteriorment per Polouliah et al. (2020). Els fibroblasts de la pell humana amb una densitat de 5 × 105 cèl·lules per pou es van sembrar en plaques 6-pous incubades a 37 graus C sota una atmosfera de 5% de CO2 durant la nit. A continuació, es van afegir els extractes a la concentració de 0,01 mg/ml. Després d'incubació durant 24 h, l'ARN total es va extreure amb el NucleoSpin RNA Plus (Macherey Nagel, Dueren, Alemanya) segons les instruccions del fabricant. La quantitat d'ARN total es va quantificar mitjançant el fluoròmetre Qubit 2.0 (Invitrogen, Massachusetts, EUA). Els primers específics per a RT-PCR, inclosos Foxo1, Sirt1 i b-actina, es van comprar a Macrogen Oceania, Austràlia. Es van seguir les seqüències dels primers específics; Foxo1: 5′ -GAC GCC GTG CTA CTC GTT-3′(Endavant) i 5′-CGG TTC ATA CCC GAG GTG-3′(Revers); Sirt1: 5′ -TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′(Endavant), 5′ -ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′ (Revers); i b-actina: 5′ TCA TGC AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3′ (Endavant), 5′ -CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG -3′ (Revers). Les mescles de PCR contenien 1 sistema SuperScriptTM III One-Step RT-PCR amb PlatinumTM Taq DNA Polymerase Supermix (Invitrogen, Massachusetts, EUA), 250 nM d'encebadors específics i 2 lg d'ARN. Totes les reaccions RT-PCR es van realitzar a TProfessional Basic Gradient 070–601 (Biometra GmbH, Göttingen, Alemanya) en les condicions d'amplificació: 60 graus C 30 min per a la transcripció inversa; després 40 cicles a 94 graus durant 15 s de desnaturalització, 55 graus C durant 30 s de recuit i 68 graus durant 30 s d'extensió; i finalment a 68 graus C durant 5 min. Després dels processos de RT-PCR, els productes de PCR es van separar en un gel d'agarosa a l'1,5 per cent barrejat amb el tampó de càrrega d'ADN Novel Juice 6x (GeneDireXTM, Xina), es van veure amb un transil·luminador i es van fotografiar amb Quantity One 4.6.8 (bàsic) (Bio-Rad Laboratories, Inc., Califòrnia). Posteriorment, la densitat de la banda es va quantificar mitjançant la imatge J (versió 1.47, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) i es va normalitzar al gen de la neteja, b-actina.

2.6. Anàlisi estadística

Tots els experiments es van expressar com la mitjana ± desviació estàndard (SD) dels experiments independents (n {{0}}). Les diferències estadístiques es van analitzar mitjançant l'ANOVA amb la prova de Tukey (p <0,05). Les relacions entre les bioactivitats es van provar mitjançant el coeficient de correlació de Pearson.

3. Resultats

3.1. Els rendiments d'extracció, les característiques físiques i els continguts fitoquímics dels extractes de PR

Els rendiments d'extracció, les característiques físiques i els continguts fitoquímics dels extractes de PR es van mostrar a la taula 1. Els rendiments d'extracció dels extractes de PR van ser del 10,62% al 30,63%. Els principals components fitoquímics dels extractes de PR eren els flavonoides. Excepcionalment, els extractes de rambutà rosa de llavors (PR-SM i PR-S-Sox) no contenien flavonoides, però només mostraven glicòsids com a fitoquímics. Només, els extractes de PR de les peles madures i joves de la Maceració (M) van mostrar la presència de xantones, que és un polifenol tèrmic. A més, els rendiments d'extracció dels extractes de PR per l'extracció Soxhlet (Sox) semblaven ser superiors als de la Maceració (M).

3.2. Contingut total de fenòlics (TPC), flavonoides (TFC) i quercetina dels extractes de PR

L'extracte PR de les closques de fruites joves per maceració (PRY-M) va donar els continguts fenòlics totals més alts per l'assaig FolinCiocalteu de 67,60 ± 4,38 mgGAE/g, mentre que l'extracte PR de les closques de fruites joves per la L'extracció de Soxhlet (PR-Y-Sox) va donar el contingut total de flavonoides més alt mitjançant l'assaig colorimètric de clorur d'alumini modificat de 678,72 ± 23,59 mgQE/g (Fig. 1) (p <{24}},05). Tanmateix, els extractes de PR-BM, PR-SM i PR-S-Sox no van mostrar contingut fenòlic. Es va revelar que tots els extractes de PR van demostrar el contingut de quercetina determinat per l'anàlisi HPLC. A més, l'extracte PR de les closques de fruites madures per maceració (PR-RM) va donar els continguts més alts de quercetina de 190,10 ± 0,28 lg/mL. (Fig. 2).

3.3. Activitats antioxidants i inhibidores de la tirosinasa de bolets dels extractes de PR

La taula 2 va demostrar les tres activitats antioxidants, inclosa l'activitat d'eliminació de radicals lliures pel mètode DPPH, la inhibició de la peroxidació lipídica pel mètode del tiocianat fèrric; la quelació de metalls pel mètode FIC; i la inhibició de la tirosinasa de bolets dels extractes de PR. La majoria dels extractes de PR, excepte els extractes de PR-LM, PR-BM i PR-S-Sox, van mostrar una activitat d'eliminació de radicals lliures superior amb el rang SC5{{10}} de 0.{ {18}}23 - {{20}}.045 mg/ml, que era comparable a l'àcid ʟ-ascòrbic estàndard (SC50 de 0. 036 ± 0.{{40}}{03 mg/mL) a p < 0.05. A més, l'extracte de PR-LM va mostrar la inhibició més alta de la peroxidació lipídica amb el LC50 de 0,274 ± 0,029 mg/mL, i l'activitat de quelació de metalls amb el MC50 de 0,203 ± 0,021 mg/mL, que era comparable a l'a-tocoferol estàndard (LC50 de 0,122 ± 0,015 mg/mL) i EDTA (MC50 de 0,518 ± 0,034 mg/mL), respectivament (p <0,05). Tots els extractes de PR van demostrar l'activitat d'inhibició de la tirosinasa de bolets, mentre que l'extracte de PR-R-Sox va mostrar l'activitat més alta amb l'IC50 de 0,04 ± 0,02 mg/ml, que era comparable a l'àcid cògic estàndard (IC50 de 0,02 ± 0,01 mg). /ml) (p <0,05).

3.4. Citotoxicitat dels extractes de PR

Fig. 3 showed the cytotoxicity on the B16F10 cells (A) human skin fibroblasts by the MTT assay of the PR extracts. All of the PR  extracts at the concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL had no cytotoxicity on the B16F10 cells and human skin fibroblasts, respectively since they gave>80 per cent de viabilitat relativa en comparació amb el grup no tractat. Malgrat això, les concentracions més altes de tots els extractes de PR es van considerar citotòxiques en aquestes cèl·lules. No es va provar la concentració més alta que la d'1 mg/ml, ja que no es va poder dissoldre completament en el dissolvent.

3.5. Anti-melanogènesi dels extractes de PR

In this study, there is a screening method from many samples,  therefore we highlight only the highest concentration that had no cytotoxicity on both cells and might have the highest anti-melanogenesis activity. This concentration is the highest concentration that showed no cytotoxicity on the B16F10 cells after being treated with the PR extracts and kojic acid (>80 per cent de viabilitat cel·lular) (dades no mostrades). La figura 4 mostra l'anti-melanogènesi a les cèl·lules de melanomes murins (B16F10) dels extractes de PR a una concentració de 0, 01 mg/ml. Tots els extractes de PR van mostrar antimelanogènesi a les cèl·lules B16F10. El PR s'extreu de fulles, branques, llavors i fruits madurs i joves mitjançant l'extracció Soxhlet (PR-L-Sox, PR-B-Sox, PR-S-Sox, PR-R-Sox i PR-Y-Sox). ) va mostrar la més alta anti-melanogènesi del 50,6-54,1 per cent, que va ser espectacularment superior a l'àcid kògic estàndard (37,9 ± 3,9 per cent) en uns 1,5 vegades, mentre que l'activitat dels extractes RB-M i PR-YM era comparable a la àcid cògic estàndard (p < 0,05).

3.6. Estimulació de la biosíntesi de col·lagen dels extractes de PR

Tots els extractes de PR a la concentració de {{0}},1 mg/ml van mostrar l'estimulació de la biosíntesi de col·lagen en els fibroblasts de la pell humana determinada pel mètode Sirius Red. La concentració de 0,1 mg/ml dels extractes de PR i l'àcid ʟ-ascòrbic és la concentració més alta que no va mostrar cap citotoxicitat en els fibroblasts de la pell humana. Els extractes de PR de fulles i branques mitjançant l'extracció de Soxhlet (els extractes de PR-LM i PR-BM) van demostrar la biosíntesi de col·lagen més alta (16,46 ± 0.{{20}}7 per cent i 14,66 ± 0,09 per cent, respectivament), que va ser inferior a l'àcid ʟ-ascòrbic estàndard (34,07 ± 0,03 per cent) aproximadament 2 vegades (p <0,05) (Fig. 5).

3.7. Estimulació dels gens anti-envelliment

La figura 6 mostra l'estimulació de gens anti-envelliment, inclosos els gens Sirt1 i Foxo1, als fibroblasts de pell humana dels extractes de PR a 0.0Es va determinar 1 mg/ml mitjançant la tècnica RT-PCR. La concentració de {{20}}.{01 mg/ml dels extractes de PR i el resveratrol és la concentració més alta que no va mostrar cap citotoxicitat als fibroblasts de la pell humana. Curiosament, els extractes de PR-L-Sox, PR-S-Sox, PRR-M, PR-R-Sox, PR-YM i PR-Y-Sox a 0,01 mg/ml van mostrar l'estimulació més alta de Foxo1 anti-envelliment. Expressió d'ARNm (495 pb), que va ser dramàticament superior al resveratrol estàndard en uns 2 vegades (p <0, 05). D'altra banda, els extractes de PR-S-Sox i PR-Y-Sox van mostrar l'estimulació més alta de l'expressió d'ARNm anti-envelliment Sirt1 (160 pb), que va ser inferior a la del resveratrol (p <0, 05). Tot i que gairebé tots els extractes de PR van demostrar l'estimulació de l'expressió gènica anti-envelliment, els extractes de PR-R-Sox i PR-BM no van estimular l'expressió de Sirt1 i Foxo1, respectivament.

4. Discussió

En general, s'han examinat diverses plantes naturals pels seus fitoquímics, compostos bioactius i propietats biològiques per trobar nous ingredients naturals prometedors per a la medicina, els suplements alimentaris i les aplicacions cosmètiques. El rambutan rosa és una de les fruites locals del districte de Klung, província de Chanthaburi, Tailàndia. Hi ha alguns informes científics sobre les seves activitats biològiques i farmacèutiques, especialment la seva activitat antienvelliment. En aquest estudi, les cinc parts del rambutà rosa, incloses fulles, branques, llavors i closques de fruits madurs i joves, es van extreure mitjançant la maceració i l'extracció Soxhlet utilitzant un 95 per cent d'etanol com a dissolvent. S'han estudiat diversos fitoquímics recentment descoberts, inclosa la quercetina, que són metabòlits secundaris de les plantes, per tenir efectes anti-envelliment en cèl·lules, animals i humans (Phuong et al., 2020). A partir de les conclusions d'aquest estudi, els flavonoides eren els principals fitoquímics dels extractes de PR. S'ha informat anteriorment que els extractes de les altres espècies de rambutà es presentaven amb fitoquímics, com ara flavonoides, tanins i carotenoides, que es correlacionaven amb les seves propietats antioxidants (Rohman, 2017). L'absència de xantones per l'extracció de Soxhlet podria ser de les altes temperatures (Yuvanatemiya et al. 2022, Sankeshwari et al., 2018). La quercetina és un dels compostos fenòlics i flavonoides més abundants que es troben en moltes fruites i verdures, així com en el rambutà (Phuong et al., 2020). En aquest estudi, la temperatura més alta (80 graus C) del procés Soxhlet pot extreure una substància no tèrmica tèrmica inclosa la quercetina més que el procés en fred. La quantitat de quercetina determinada per l'anàlisi HPLC es pot utilitzar com a marcador per al control de qualitat dels extractes de PR a escala de producció. El coeficient de correlació de Pearson (R2) entre el TFC i el TPC dels extractes de PR va ser de 0,825 classificant una relació molt forta (R2=± 0,80 a ± 1.00) (p < 0,01), el que significa si s'augmenta el TFC, el TPC també augmentaria dràsticament. A més, el coeficient R2 entre el TPC i el contingut de quercetina dels extractes de PR va ser de 0,650 classificant una relació forta (R2=± 0,60 a ± 0,79) (p <0,05). La diferència de rendiments d'extracció, fitoquímics, així com TPC, TFC i quercetina dels extractes de PR es poden veure afectats pels dissolvents, els processos d'extracció i les temperatures (Chutoprapat et al., 2020). Diversos estudis han trobat que els compostos flavonoides i fenòlics, així com la quercetina, tenen una àmplia gamma d'activitats biològiques i farmacèutiques, incloent-hi activitat antimicrobiana, antioxidant, antiinflamatòria i antienvelliment (Panche et al., 2016, Shahidi). i Yeo, 2018, Musika et al., 2021, Wang et al., 2022).

Com s'ha dit anteriorment, les espècies radicals d'oxigen, o ROS, poden causar danys relacionats amb l'edat a nivell cel·lular i tissular, accelerant l'envelliment cronològic i ambiental caracteritzat per arrugues i pigmentació atípica (Papaccio et al., 2022). Els antioxidants naturals poden eliminar els radicals lliures, la qual cosa redueix els efectes antiinflamatoris, la prevenció del càncer, la diabetis i els trastorns cerebrals, la reducció de la pressió arterial i l'aterosclerosi i la desacceleració de l'envelliment de la pell (Miracle Uwa, 2{20} }17). L'eliminació de radicals lliures, la inhibició de la peroxidació lipídica i la quelació de metalls s'han investigat àmpliament com a sistemes per investigar l'activitat antioxidant dels productes naturals. Per a l'eliminació de radicals lliures de DPPH, els electrons estranys de les molècules de DPPH es redueixen en rebre un àtom d'hidrogen dels antioxidants per convertir-se en molècules d'hidrazina (Ionita, 2021). El mètode de peroxidació lipídica es basa en l'oxidació de coure (II) a ions de coure (III) passats per una emulsió d'àcid linoleic (Bakir et al., 2017), mentre que el mètode de quelació de metalls es basa en l'oxidació del coure (II). per formar un complex fèrric-ferrozina (Wong et al., 2014). La presència de contingut de flavonoides i fenòlics en els extractes de PR d'aquest estudi pot haver contribuït a les tres activitats antioxidants. Es va trobar que els compostos fenòlics (per exemple, corilagina, àcid elàgic, geraniina i quercetina) dels extractes de rambutà presenten activitat antioxidant mitjançant l'eliminació de radicals DPPH i la inhibició de la peroxidació lipídica (Hernández-Hernández et al., 2019, Phuong et al., 2019, Monrroy et al., 2020, Araujo et al., 2021). Això és similar als informes anteriors que els extractes de pell de les altres espècies de rambutà presenten un alt TPC i TFC, així com mostren activitats antioxidants més fortes com ABTS, DPPH, eliminació d'O{13}}, poder d'assaig reductor de fèrric (FRAP). ), agents quelants i peroxidació lipídica (Lourith et al., 2017, Rohman, 2017, Monrroy et al., 2020). Curiosament, el coeficient R2 entre la quelació del metall i la inhibició de la peroxidació lipídica dels extractes de PR va mostrar una correlació positiva molt forta de 0, 953, classificant una relació forta a un nivell significatiu de p < 0, 01.

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】