Infecció in vitro de cèl·lules de ronyó boví madin-darby (MDBK) amb sporozoïts d'Eimeria Acervulina: anàlisi quantitativa de la invasió cel·lular del paràsit i la replicació mitjançant reacció en cadena de polimerasa en temps real (PCR)
Mar 17, 2022
Abstracte
La coccidiosi avícola provoca pèrdues econòmiques considerables a la indústria ramadera. Els paràsits d'Eimeria són els responsables d'aquesta malaltia. A escala global, E. acervulina i E. tenella es troben entre els broilers que infecten Eimeria spp. E. tenella s'utilitza comunament com a model d'infecció in vivo i estudis in vitro. D'altra banda, E. acervulina amb prou feines s'ha estudiat en condicions in vitro. Un model in vitro ben establert i àmpliament utilitzat per a la infecció per E. tenella és el boví de Madin Darby.ronyólínia de cel·la (MDBK); no obstant això, poc se sap pel que fa a la idoneïtat de les cèl·lules MDBK com a cèl·lules hoste per E. acervulina. Vam infectar monocapes MDBK amb dues dosis diferents, 5×104 i 2× 105, d'E. acervulina esporozoïts i cultius avaluats a 24 i 96 h després de la infecció (hpi). Per comparació, vam executar un assay d'infecció idèntic utilitzant E. tenella sporozoites. Per avaluar la reproducció del paràsit, es va quantificar el nombre de còpies d'ADN del marcador SCAR E. acervulina i el gen E. tenella ITS-1 mitjançant PCR quantitativa en temps real. Trobem que el nombre de còpies D. acervulina va augmentar significativament a 24 hpi en comparació amb E. tenella (p<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">
Paraules clau:Coccidiosi; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Aviram; Cèl·lules MDBK; Ronyó
LA CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL / RENAL
Introducció
La coccidosi és una malaltia econòmicament important en la indústria avícola (Blake et al. La malaltia és causada per paràsits apicomplexos del gènere Eimeria. La infecció es produeix a través de la ingestió oral d'oocists esporulats. Un cop a l'hoste, els ooquistes alliberen esporozoïts que envaeixen les cèl·lules epitelials intestinals. Dins de les cèl·lules hoste, els espoorozoïts experimenten cicles de multiplicació sexual i asexual. Per tant, els oocists es produeixen i, en conseqüència, es desprenen en la femta. Els animals infectats poden presentar pèrdua de pes, diarrea, baixa producció d'ous i la malaltia pot ser fatal en alguns casos (López-Osorio et al 2020). Set espècies d'Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox i E. tenella) són responsables de la coccidiosi a nivell mundial. La morfologia, la patologia i la gravetat de la malaltia són factors diferenciadors comuns entre aquestes espècies. De les set Eimeria, E. acervulina, E. tenella i E. maxima són les més prevalents en granges d'enreixat (Jordan et al 2018; Moraes et al 2015; Györke et al 2013). D'aquestes tres espècies, E. tenella es considera altament patògena, mentre que E. acervulina i E. maxima mostren una patogenicitat moderada (López-Osorio et al. Malgrat les variacions en la patogenicitat, Eimeria spp. patògena moderada com E. acervulina podria augmentar la gravetat de la malaltia durant la coinfecció (Hiob et al. Els models animals són un element valuós en la investigació de la infecció. No obstant això, els estudis in vitro de paràsits coccidians poden contribuir a la comprensió de base de la malaltia a nivell cel·lular (Marugán-Hernández et al. 2020, Bussite et al. 2018, Thabet et al. A més, poden ser una eina útil que proporciona dades de base per a futures teràpies (Thabet et al. Khalafalla et al. 2011). Per la seva capacitat de créixer en línies cel·lulars no aviàries (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2017), E. tenella ha estat àmpliament utilitzat com a organisme model d'investigació in vitro (Marugán-Hernández et al. Thabet et al. 2019, 2017; Khalafalla et al. 2011) i esforços considerables s'han dirigit a la investigació in vitro i in vivo de E. tenella, incloent l'ús d'enfocaments moleculars com la PCR quantitativa en temps real (RT-qPCR) (Marugán-Hernández et al. Thabet et al. 2019, 2017; Hiob et al. 2017; Raj et al. 2013). S'han reportat menys esforços per a altres espècies d'Eimeria, incloent E. acervulina (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki et al. 1974; Strout et al. 1965; Hiob et al 2017). L'objectiu d'aquest estudi va ser avaluar la invasió in vitro i la replicació d'esporozoïts D. acervulina en monocapes de cèl·lules MDBK utilitzant PCR quantitativa en temps real.
LA CISTANCHE MILLORARÀ LA DIÀLISI RENAL/RENAL
Materials i mètodes
Passatge d'E. acervulina i E. tenella oocysts OocystsD'E. acervulina i E. tenella van ser passatges per separat en pollets sans d'11 dies d'edat segons un mètode modificat d'Eckert et al. Els ooquistes esporulats es van recollir i emmagatzemar en una solució de dicromat de potassi 4% a 4 °C fins a un ús posterior.Purificació i exestament d'ooquistsEls oocists d'ambdues espècies d'Eimeria es van netejar de la solució de dicocromat de potassi 4%. A partir de llavors, els esporozoïts es van excitar i purificar segons el mètode modificat descrit per Rentería-Solís et al. (2020).Cultiu cel·lularBoví de Madin-Darbyronyó(MDBK) monocapes (DSMZ, Braunschweig, Alemanya) es van utilitzar com a model d'infecció. Les cèl·lules MDBK es van sembrar (2 × 105 cèl·lules / bé) en plaques de 24 pous amb el medi de l'àguila modificada de Dulbecco (DMEM) complementat amb un 10% de sèrum boví fetal (FBS), penicil·lina 100 UC, 100 μg / ml d'estreptomicina i 2,5 μg / ml d'amphotericina i incubada a 37 °C en una atmosfera del 5% de CO2 a l'aire, fins que van arribar al 80% de confluència.Infecció de cèl·lules MDBK amb espoorozoïts d'EimeriaEls monocapes MDBK confluents van ser inoculats amb esporozoïts E. acervulina. Es van realitzar estudis preliminars per seleccionar una dosi d'infecció basada en diferents tipus de multiplicitat d'infeccions (MOI) (paràsit: cèl·lula): 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 i 5,0 (Taha et al. dades inèdites). Es van seleccionar dues dosis separades per a la infecció: 5× 104 (MOI: 0,25) o 2× 105 esporozoïts / pou (MOI: 0,5). Els cultius exposats a la infecció es van incubar a 41 °C en un medi DMEM amb un 2% de FBS, 100 penicil·lina 100 Μ, estreptomicina de 100 μg/ml i 2,5 μg/ml d'amhotericina. Es van implementar dos temps d'incubació diferents: 24 h després de la infecció (hpi) i 96 hpi. Es va dur a terme un conjunt idèntic de dosis d'infecció i temps d'incubació per E. tenella sporozoites. Tots els experiments van incloure un control negatiu que consistia en monocapes MDBK no infectades (cèl·lules no infectades NC). Tots els assays es realitzaven en triplicats. Després de 24 hpi, les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS estèril (pH 7,2) i es va afegir un nou medi al grup de 96 hpi, mentre que els cultius de 24 hpi es van acabar. Les monocapes es van trippsinar al final de cada període d'incubació (24 hpi o 96 hpi, respectivament).
Extracció d'ADN i reacció en cadena quantitativa de polimerasa en temps real (RT-qPCR)L'ADN es va extreure de les cèl·lules trippsinitzades utilitzant el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanya) segons el protocol del fabricant. RT-qPCR es va realitzar per quantificar còpies de la seqüència E. acervulina caracteritzada el marcador de regió amplificada (SCAR) Ac-R01-1731 i per E. tenella interna transcrit espaiador 1 del gen DE l'ADN ribosòmic (ITS-1) com un correlat de replicació del paràsit. Els assays RT-qPCR es van dur a terme d'acord amb els mètodes descrits per Blake et al. (2008) i Kawahara et al. (2008), respectivament, amb algunes modificacions. Breument, una reacció de volum de 20 μl contenia 10 μl SYBR Green® master mix (Thermo Scientific, Dreieich, Alemanya), 500 nM d'imprimacions davanteres i inverses (Taula 1), 2 μl de plantilla d'ADN i 7 μl d'aigua lliure de nucleases. Es va afegir un control sense plantilla (NTC) que consistia en aigua lliure de nucleasa a cada assay. Les reaccions RTqPCR es van amplificar en triplicats i es van dur a terme en un sistema de detecció de PCR Bio-Rad CFX Connect Real-Time (Bio-Rad, Feldkirchen, Alemanya). Les condicions rt-qPCR van ser de 95 °C durant 5 min seguits de 40 cicles de 95 °C durant 30 s. El recuit es va realitzar a 59,8 °C i 58 °C durant 20 s, per E. acervulina i E. tenella, respectivament, seguit d'un cicle d'extensió de 20 s a 72 °C. Es va aplicar un programa de corba de fusió que implicava un rang de temperatura de 60 a 95 °C per crear una corba de dissociació. Finalment, E. acervulina i E. Les corbes estàndard de tenella van ser generades per una dilució en sèrie de l'ADN genòmic i una dilució en sèrie de fragments clonats del gen ITS-1 (segons Thabet et al.
Anàlisi estadística
Es van utilitzar proves de normalitat de D'Agostino-Pearson i Shapiro-Wilk per determinar la distribució normal de les dades. Es va utilitzar una prova ANOVA bidireccional per comparar la reproducció tenint en compte els punts de temps, les dosis d'infecció i les espècies d'Eimeria. Les diferències es van considerar estadísticament significatives quan p>0,05. Totes les anàlisis estadístiques es van fer en el programari GraphPad Prism 9 (San Diego, CA, EUA).
Resultats i discussió
Les còpies gèniques del marcador SCAR D.acervulina i el gen E. tenella ITS-1 es van amplificar i detectar amb èxit a través de RT-qPCR en cada reacció. Després d'un període d'incubació de 24 hpi, el nombre de còpies detectades després de l'aplicació d'una dosi de 5× 104 esporozoïts va ser significativament més gran (p = 0,0002) per E. acervulina (1,88× 105±5,56× 104 ) que per E. tenella (3,60× 104±5.37× 103 ) (Fig. 1). De la mateixa manera, es va obtenir un nombre significativament més alt (p = 0,0002) de còpies per E. acervulina (4,82× 105±8,50× 104 ) que per E. tenella (1,27×105±9,32×103 ) 24 hpi després de l'aplicació de 2×105 esorozoïts (fig. 1). En canvi, 96 hpi després de la infecció amb 5 × 104 esporozoïts, el nombre de còpies en els cultius infectats per E. acervulina va ser significativament menor (p = 0,0044) inferior (6,96 × 103 ± 3,87 × 103) en comparació amb E. tenella (1,24 × 105 ± 1,01 × 105 ). De la mateixa manera, la dosi més alta de 2× 105 esporozoïts incubats amb monocapes durant el període més llarg de 96 hpi va donar lloc a quantitats significativament (p = 0,0044) quantitats més baixes de còpies D. acervulina (3.35× 104±1.53× 104 ) en comparació amb E. tenella (4.98× 105±1.28× 105 ) (fig. 1).
Vam provar la capacitat d'E. acervulina per envair monocapes MDBK i multiplicar-se posteriorment més de 24 i 96 hpi. Els intents anteriors d'avaluar la cultura E. acervulina s'han dut a terme amb resultats variables. Strout et al. (1965) va infectar diferents primàries (embrió de pollastreronyói fibroblasts) i línies cel·lulars permanents (fibroblasts de ratolí, cèl·lules HeLa). Strout et al. (1965) va informar d'una infecció cel·lular recognoscible a 24 hpi en totes les línies cel·lulars. Curiosament, no van observar el creixement paràsit durant períodes de més de 24 hpi en cap dels models cel·lulars provats (Strout et al.
còpies 96 hpi. Naciri-Bontemps (1976) va informar del creixement d'E. acervulina en pollastreronyócèl·lules fins a 93 hpi i la formació d'oocist després de la inoculació dels merozoïts. No obstant això, pel que sabem, aquestes troballes no van ser confirmades per publicacions posteriors Només s'ha publicat un article sobre monocapes MDBK infectades amb esporozoïts E. acervulina (Talebi 2001). En resum, l'autor va exposar cèl·lules MDBK prèviament tractades amb antisera de pollastre hiperimmune o conill a E. acervulina esporozoïts durant 24 hpi. Els cultius estaven tacats i els espoorozoïts intracel·lulars es comptaven microscòpicament. Malauradament, l'estudi només presenta percentatges d'inhibició del paràsit per antiserum (Talebi 2001), i per tant, les conclusions sobre l'eficàcia de la infecció en aquest model no es poden extreure fàcilment. Pel que sabem, no s'han reportat més intents d'utilitzar cèl·lules MDBK com a models d'infecció per E. acervulina. D'acord amb les troballes de Strout et al. (1965), vam observar la reproducció màxima del paràsit a 24 hpi i una disminució diferent més tard representada per nombres baixos de còpia a 96 hpi. Strout et al. (1965) i Naciri-Bontemps (1976) van informar de dades qualitatives que es van originar només a partir de l'anàlisi de microscòpia. No obstant això, RT-qPCR és un mitjà més precís i sensible per avaluar la reproducció del paràsit. De fet, RT-qPCR s'utilitza avui en dia comunament per a l'avaluació quantitativa i s'ha establert amb èxit per avaluar la reproducció de coccidia (per exemple, Marugán-Hernández et al. 2020, RenteríaSolís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Hiob et al. 2017, Thabet et al. 2017, Raj et al. 2013, Khalafalla et al. 2011)
No obstant això, la microscòpia electrònica podria proporcionar dades valuoses per a l'anàlisi del desenvolupament intracel·lular d'E. acervulina en cèl·lules MDBK. Per tant, s'ha de considerar per a futures investigacions in vitro de E. acervulina. Teòricament, les línies cel·lulars aviàries serien preferibles com a model d'infecció in vitro per al pollastre Eimeria, ja que s'originen a partir de l'hoste natural i podrien permetre una visió més representativa de les interaccions entre paràsit i hoste que els cultius cel·lulars derivats de mamífers. No obstant això, la majoria dels cultius de cèl·lules de pollastre adequats per a la investigació de la coccidiosi avícola són línies primàries (Bussiere et al. 2018, Strout et al. Naciri-Bontemps 1976). Les cèl·lules primàries tenen diverses limitacions en comparació amb els cultius permanents. Una és la necessitat general de teixit animal fresc per iniciar experiments de laboratori, que poden estar relacionats amb un risc de contaminació (Verma et al. A més, per obtenir cèl·lules primàries, cal sacrificar animals que entren en conflicte amb consideracions ètiques. Finalment, l'estandardització de les línies cel·lulars primàries pot estar relacionada amb dificultats.
LA CISTANCHE MILLORARÀ LA INFECCIÓ RENAL / RENAL
Per tant, l'ús de línies cel·lulars immortalitzades és una pràctica general en la majoria de grups de recerca que treballen en cultiu in vitro de coccidia aviar. En general, es trien cultius permanents derivats de mamífers, ja que estan fàcilment disponibles a partir de fonts comercials i s'estableixen eines com anticossos, marcadors, protocols publicats, seqüències genòmiques, etc., mentre que no sempre és el cas de les línies de cèl·lules de pollastre menys utilitzades. Les cèl·lules MDBK són una línia permanent derivada de la bovina utilitzada com a model in vitro per a una àmplia varietat d'aplicacions. Les cèl·lules MDBK estan ben establertes per a estudis in vitro sobre E. tenella (Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería-Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Thabet et al. 2017, Khalafalla et al. Marugán-Hernández et al. (2020), per exemple, van dur a terme una descripció exhaustiva del desenvolupament intracel·lular d'E. tenella en cèl·lules MDBK. En aquest estudi, els autors van fer un seguiment a través de RT-qPCR i transcriptasa inversa divisió cel·lular en temps real i desenvolupament d'etapes de soques transgèniques de E. tenella.
El nostre objectiu era quantificar la multiplicació per E. acervulina en cèl·lules MDBK mitjançant tecnologia PCR. Pel que fa al nostre coneixement actual, aquestes dades no s'han publicat abans. L'anàlisi morfològica no es va considerar en el nostre experiment. No obstant això, ha estat repetidament (Marugán-Hernández et al. 2020, Thabet et al. 2017 i Raj et al. 2013) van demostrar que l'augment del nombre de còpies gèniques està de fet relacionat amb la multiplicació durant la merogonya. El desenvolupament més enllà d'aquesta fase de multiplicació asexual és bastant improbable en les condicions donades en el nostre experiment. En comparació amb E. tenella, E. acervulina sporozoites envaeixen la cèl·lula i es multipliquen a un ritme més alt durant els primers 24 hpi. No obstant això, el nombre de còpies gèniques disminueix considerablement en 96 hpi, mostrant dinàmiques de multiplicació de paràsits per E. acervulina que difereixen clarament de les de E. tenella. Així, sembla probable que les diverses espècies d'Eimeria es comportin de manera diferent en cultiu in vitro i que les conclusions generals obtingudes de E. tenella com a únic organisme model establert s'han de treure amb cautela. L'addició de més punts de temps podria ser útil per avaluar la dinàmica de la multiplicació in vitro amb més detall. Es poden aplicar tècniques addicionals per dilucidar què passa durant aquest període i si les aplicacions pràctiques per a futures teràpies poden derivar d'aquests resultats.
No obstant això, hem demostrat l'èxit de la invasió de paràsits en aquesta línia cel·lular. Per tant, les cèl·lules MDBK podrien utilitzar-se encara més com a models d'infecció per a la invasió cel·lular d'esporozoïts E. acervulina. A més, es recomana l'ús de RT-qPCR i altres eines sensibles. Més important encara, aquesta línia cel·lular també admet la infecció per E. tenella. Això es podria traduir en estudis comparatius entre ambdues espècies d'Eimeria. S'han de realitzar anàlisis quantitatives i qualitatives més detallades per avaluar la idoneïtat del cultiu MDBK com a matriu in vitro per a E. acervulina i etapes de desenvolupament d'altres espècies d'Eimeria de pollastre. assistència; També estem agraïts a M. Fritsche, B. Schneidewind i R. Schumacher (Institut de Parasitologia, Universitat de Leipzig) per la seva excel·lent assistència com a cuidadors d'animals. Moltes gràcies també a R. Zhang (College of Animal and Veterinary Sciences, Southwest Minzu University) per la seva valuosa ajuda durant el treball de laboratori. Els autors també volen agrair a R. Schmäschke (Institut de Parasitologia, Universitat de Leipzig) el seu valuós treball amb la preparació de permisos d'animals.
