L'associació del polimorfisme genètic rar Rs35667974 IFIH1 amb malalties autoimmunes és un cas d'epigenètica de l'ARN?

visualització: AA, AP i EEE, supervisió: EEE i adquisició de finançament: EEE. Tots els autors han llegit i acceptat la versió publicada del manuscrit. Resum

L'interferó induït amb el gen de la proteïna 1 que conté el domini C de l'helicasa (IFIH1) codifica una helicasa d'ARN citoplasmàtica també coneguda com a 5 associada a la diferenciació del melanoma (MDA5), una ARN helicasa semblant a RIG-1-que reconeix l'ARN viral i està implicada en l'ARN innat. immunitat mitjançant el reconeixement de l'ARN viral. En unir-se a l'ARN de doble cadena (ds), MDA5 forma un conjunt filamentós al llarg de la longitud de l'ARNdc i utilitza signatures moleculars per discriminar-se a si mateix, en comparació amb el no propi en funció de la longitud i la metilació de l'ARNdc. La seva variant rs35667974 és protectora contra la diabetis tipus 1, la psoriasi i l'artritis psoriàsica, però també es troba associada amb un major risc d'espondilitis anquilosant, malaltia de Crohn i colitis ulcerosa. Per conèixer el complex paper d'aquesta variant, vam realitzar una anàlisi estructural de MDA5 en complex amb dsRNA mitjançant simulacions de dinàmica molecular.

Les nostres dades suggereixen que, si bé la mutació Ile923Val de la variant rs35667974 no afecta significativament la unió al dsRNA natiu, mostra un efecte desestabilitzador en presència de metilació de 2′-O uridina. Així, la presència de 2′-O-metilació al dsRNA introdueix una signatura de detecció que condueix a una reducció selectiva de l'activitat catalítica global de l'MDA. Aquest estudi representa una avaluació del paper de la variant compartida rs35667974 del locus autoimmune IFIH1, que s'ha informat que condueix a una activitat catalítica reduïda selectivament del fenotip MDA5 modificat i, com a conseqüència, una reducció de la retroalimentació negativa sobre la senyalització de citocines i quimiocines i protecció selectiva contra l'autoimmunitat. .

El domini de l'helicasa C és una proteïna enzimàtica important que pot desenrotllar l'estructura de la doble hèlix de l'ADN. Pot ajudar l'ADN a completar la replicació, l'edició i el lliurament correctes en el procés de replicació, reparació i transcripció cel·lular, i és una de les claus del funcionament normal de les cèl·lules. Al mateix temps, la immunitat és un mecanisme de defensa molt important en el cos humà, que ens pot protegir eficaçment de patògens com bacteris i virus.

Els estudis han demostrat que el domini C de l'helicasa té un paper important en la immunitat. En primer lloc, el domini de l'helicasa C pot garantir l'estabilitat i l'eficiència de codificació dels gens ajudant a la replicació, reparació i transcripció normals de l'ADN cel·lular, millorant així la immunitat del cos humà. En segon lloc, el domini de l'helicasa C pot promoure el reconeixement de les molècules d'heterogeneïtat de proteïnes per part de les cèl·lules i regular la transducció del senyal del sistema immunitari, donant suport a la funció de defensa del cos. Els dos mètodes anteriors han jugat un paper positiu en la promoció del manteniment i la millora de la immunitat.

A més, l'estudi en profunditat de la relació entre el domini de l'helicasa C i la immunitat també ens proporciona una inspiració important per descobrir nous fàrmacs per al tractament del càncer i les malalties relacionades amb el sistema immunitari. El desenvolupament de fàrmacs i la teràpia gènica dirigides al domini de l'helicasa C poden millorar la resistència del cos al càncer i altres malalties relacionades amb el sistema immunitari, i ajudar els pacients a afrontar millor el tractament i la recuperació de malalties relacionades.

En resum, la relació entre el domini de l'helicasa C i la immunitat és molt estreta, i té un paper vital per garantir l'estabilitat dels gens, promoure la immunitat cel·lular i donar suport a la defensa del cos. S'espera que mitjançant mètodes de recerca i tractament rellevants, puguem mantenir i millorar la immunitat humana i crear una vida més sana i millor per a nosaltres. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la immunitat personal. El cistanche té un efecte important en la millora de la immunitat perquè la pasta de carn és rica en una varietat de substàncies antioxidants, com la vitamina C, la vitamina C, els carotenoides, etc. Aquests ingredients poden eliminar els radicals lliures i reduir l'estrès oxidatiu. Estimular i millorar la resistència del sistema immunitari.

Cliqueu els avantatges de cistanche tubulosa

Paraules clau

Polimorfisme d'un sol nucleòtid (SNP) · Model molecular · Interferó induït amb domini C de l'helicasa 1 (IFIH1) · Diferenciació associada a melanoma 5 (MDA5) · Metilació de l'ARN.

Introducció

Els gens i els mecanismes implicats en les malalties autoimmunes, que afecten aproximadament el 5 per cent de la població, segueixen sent esquivos, però l'acumulació de dades suggereix fortament que diferents malalties autoimmunes poden compartir un fons genètic comú, assenyalant així l'existència de variants que comparteixen diferents malalties autoimmunes. (Zhernakova et al. 2009). Intentar desentranyar aquesta informació genètica en mecanismes biològicament significatius que condueixen a malalties es refereix a la identificació de gens causals. La identificació de variants que causen malalties és una tasca difícil però necessària en l'intent d'establir mètodes efectius per a la predicció, la prevenció i la intervenció de la malaltia (Biros et al. 2005).

Diferents tipus de molècules d'ARN estan implicades en la regulació de diversos processos biològics, com ara l'ARN missatger (ARNm), l'ARN de transferència (ARNt), l'ARN ribosòmic (ARNr), el microARN (miRNA) i l'ARN no codificant llarg (lncRNA). Les molècules d'ARN contenen nombroses (més de 150) modificacions químiques (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Aquestes modificacions estan funcionalment vinculades a totes les etapes del metabolisme de l'ARN, com ara l'estructura, l'estabilitat i les interaccions, i tenen un paper crític en diversos processos biològics, com ara la modulació de la replicació de virus i les respostes immunitàries antivirals (Machnicka et al. 2013). Entre elles, la metilació de la ribosa és una de les modificacions més omnipresents que es troben a l'ARN. La 2′-O -metiluridina es troba a l'ARNr, snRNA, snoRNA i tRNA d'Archaea, Bacteria i Eucariota (Aučynaitė et al. 2018). La ribosa-2′-ometilació augmenta la hidrofobicitat dels nucleòtids i els protegeix de l'acció de les nucleases (Yildirim et al. 2014).
L'evidència acumulada indica que la 2'-O-metilació de l'ARN viral (2'OMe-ARN) té un paper important en l'evasió de les respostes immunes innates cel·lulars a les cèl·lules hostes (Dimitrova et al. 2019). Züst i els seus col·legues han demostrat que 2′ OMe d'ARN viral va contribuir a l'evasió de la resposta antiviral mediada per interferó (IFN), promovent així la replicació viral (Züst et al. 2011). A més, Vitali i Scadden han proposat que IU-dsDNA suprimeix la via estimulant de l'IFN MDA5 (Vitali i Scadden 2010).

L'interferó induït amb el gen del domini 1 de l'helicasa C (IFIH1) codifica una ARN helicasa citoplasmàtica també coneguda com MDA5 (proteïna 5 associada a la diferenciació del melanoma) i és un receptor similar al RIG-I (RLR) que realitza una funció antiviral en la immunitat innata. mitjançant la detecció d'ARN virals. MDA5 reconeix 0.5–1 kb l'estructura de tija dúplex d'ARN que es forma normalment durant la replicació picornaviral i media una resposta immune a la infecció viral (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5, després de la detecció d'ARN bicatenaris llargs (dsRNA), generats durant la replicació de picornavirus, activa la via de senyalització de l'interferó de tipus I. Els estudis han demostrat que MDA5 forma un filament al llarg de la longitud del dsRNA i utilitza la dinàmica del filament dependent de l'ATP per discriminar entre un mateix i el no propi en funció de la longitud del dsRNA (Toro et al. 2015). Es va demostrar que MDA5 està implicat en la modulació de la diafonia entre les cèl·lules i el sistema immunitari innat/adaptatiu mitjançant la producció local de citocines i quimiocines.

Els canvis en l'expressió i/o l'activitat de MDA5 poden desencadenar respostes cel·lulars a dsRNA, un subproducte de la replicació del virus (Colli et al. 2010). També s'ha demostrat que la mutació dels residus associats a la formació de flaments provoca la pèrdua de la formació de filaments i de la senyalització dependent de MDA5-, excepte un parell de mutacions, que milloren moderadament la senyalització. Aquests resultats suggereixen que els mecanismes independents de l'ATP, és a dir, una unió d'ARN més estreta i/o una interacció proteïna-proteïna més estable, és probable que siguin responsables de l'estabilitat observada de la formació del filament MDA5 in vitro i d'una major activitat de senyalització a les cèl·lules (Sohn i Hur 2016).

Smyth et al. (2006) i Nejentsev et al. (2009) van descriure un al·lel rar del gen IFIH1 que confereix protecció contra la diabetis tipus 1 (T1D). Aquest polimorfisme d'un sol nucleòtid (SNP) IFIH1 rs35667974, on la isoleucina conservada (codó [ATT]) a la posició #923 canvia a valina (codó [GTT]), és una variant rara ja que la freqüència d'al·lel menor (MAF) és C {{ 9}},010031 (2655 individus en una mostra total de 264690) basat en TOPMED (Taliun et al. 2021) i C = 0,016267 (3343 individus en una mostra total de 205514) basat en ALFA (Phan et al. 2021) al. 2020; Sherry et al. 2001). A la Taula 1 es presenta la biogeografia humana de la freqüència del polimorfisme a diferents regions continentals a partir de les dades del projecte ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Estudis posteriors van confirmar que aquest al·lel rar tenia el mateix efecte sobre la DM1, la psoriasi (PS) (Li et al. 2010) i l'artritis psoriàsica (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Per contra, aquest SNP s'ha associat com a factor de risc per a la susceptibilitat del desenvolupament d'espondilitis anquilosant (EA) (Ellinghaus et al. 2016), malaltia de Crohn (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017). ), i la colitis ulcerosa (CU) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Chistiakov et al. (2010) han demostrat que les mutacions de pèrdua de funció E627X i I923V de MDA5 s'associen amb una menor producció d'interferó induïda per poli (I: C) en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica de pacients amb diabetis tipus 1 i, per tant, són protectores de la T1D. També s'afirma que a la molècula MDA5, la substitució d'aminoàcids I923V resideix a les proximitats d'un residu H927, que contribueix a la unió de dsRNA (Yoneyama i Fujita 2008). Tanmateix, es va demostrar que la variant de MDA I923V tenia una capacitat normal d'unir dsRNA, però una activitat catalítica reduïda 2.5- vegades (Shigemoto et al. 2009). Per tant, aquest polimorfisme sembla no afectar de manera important les propietats d'unió d'àcids de nucleòtids d'aquesta helicasa sensible a l'ARN citoplasmàtic, però altera la seva funció per un mecanisme encara desconegut.

S'ha trobat la relació entre el polimorfisme IFHI1 i la incidència d'infecció per enterovirus en la DT1 i l'associació entre la variant MDA5 I923V i la freqüència d'ARN enteroviral en pacients amb DT1 (Looney et al. 2015). A més, estudis recents sobre ratolins MDA5- i MAVSknockout van mostrar un paper crític d'aquestes proteïnes en la mediació de les respostes d'interferó tipus 1 contra el virus Coxsackie B (Wang et al. 2010). S'ha demostrat que una proteïna líder de mengovirus prevé l'expressió d'IFN- bloquejant la dimerització de l'IRF3 necessària per a l'activació d'aquest factor (Hato et al. 2007). Aquesta observació suggereix que les variants que alteren la funció d'IFIH1 en la resposta antiviral de l'amfitrió s'han seleccionat negativament, en lloc de seleccionades positivament perquè confereixen protecció contra la DT1 (Crow 2011).

Chow et al. (2018) han analitzat àmpliament, entre d'altres, els receptors semblants a RIG-I, mentre que Brisse i Ly (2019) van revisar àmpliament l'evolució i l'especiació de MDA5 i el seu RIG-I relacionat. La ubicació dels residus alterats dins o prop dels llocs d'unió a l'ARN i a l'ATP o a la interfície del filament ens va portar a plantejar la hipòtesi que les mutacions observades podrien millorar l'estabilitat del filament IFIH1 augmentant l'afinitat intrínseca entre IFIH1 i dsRNA o entre IFIH1. molècules del filament o disminuint l'eficiència de la hidròlisi d'ATP i, per tant, la velocitat de desmuntatge del filament (Rice et al. 2014).

Aquest treball representa un estudi estructural del paper potencial de la variant compartida rs35667974 del locus autoimmune IFIH1, que s'ha informat que condueix a un fenotip de funció inhibida que codifica una substitució d'aminoàcids Ile923Val en el producte proteic del gen IFIH1 MDA5. Aquest últim és un gen candidat causal biològicament plausible compartit entre diverses malalties, que influeix en el control de l'expressió local de citocines i quimiocines que protegeixen contra l'autoimmunitat (Colli et al. 2010). Aquest treball té com a objectiu explorar el mecanisme desconegut pel qual la substitució d'Ile923Val redueix l'activitat catalítica de l'MDA5 humà. En aquest estudi, es van investigar les diferències en la interacció de MDA5 amb dsRNA entre la variant nativa i rara Ile923Val en l'inici del mecanisme d'inflamació. En conseqüència, vam tenir com a objectiu investigar el comportament dinàmic del complex MDA5/dsRNA humà en un ambient aquós en presència d'Ile923 o Val923 quan l'uracil 2′-O està metilat o no. Aquesta anàlisi estructural de la susceptibilitat genètica compartida rara o els loci de protecció pot proporcionar informació sobre la nostra comprensió de la fisiopatologia de les malalties autoimmunes i els resultats de la investigació poden afectar la millor gestió de les malalties en estudi.

Materials i mètodes

Recuperació de seqüències, construcció d'arbres filogenètics i anàlisi de selecció positiva

La seqüència de proteïnes d'Homo sapiens (ID de seqüència: NP{0}}.2) es va recuperar de la base de dades UniProt (The UniProt Consortium 2021). Per trobar homòlegs entre espècies, es van realitzar cerques BLAST amb Mega BLAST (Centre Nacional d'Informació Biotecnològica, NCBI, Bethesda, MD, EUA) a la base de dades de proteïnes RefSeq i NR (i PDB i UniProt) mitjançant Blastp (proteïna-proteïna BLAST) amb paràmetres per defecte (Altschul et al. 1997). Inicialment es van seleccionar 1000 homòlegs de les proteïnes MDA5 humanes i es va utilitzar una selecció entre espècies centrada en el domini C-terminal que conté la seqüència al voltant de la substitució humana I923V per identificar aquesta variació en altres espècies. Clustal Omega, el programa d'alineació de seqüències múltiple (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) i el servidor d'alineació de seqüències múltiple T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) es van utilitzar per realitzar alineaments de seqüències de proteïnes. i el programari de bioinformàtica de la plataforma Unipro UGENE (Okonechnikov et al. 2012) per visualitzar de manera selectiva múltiples alineacions.

L'anàlisi evolutiva s'utilitza per identificar les posicions de les seqüències de proteïnes que es conserven molt entre les espècies, cosa que indica la importància estructural (Andreou et al. 2018). L'arbre filogenètic es va construir mitjançant el mètode de màxima probabilitat (Nei i Kumar 2000) i el model Tamura-Nei (Tamura i Nei 1993) amb 500 rèpliques bootstrap (Felsenstein 1985). Els arbres inicials per a la cerca heurística es van obtenir automàticament aplicant els algorismes Neighbor-Join i BioNJ a una matriu de distàncies per parelles estimades mitjançant el model Tamura-Nei i després seleccionant la topologia amb un valor de probabilitat logarítmica superior. L'anàlisi filogenètica va implicar 52 seqüències de nucleòtids homòlegs (39 ortòlegs i 13 paralogs) del gen humà IFIH1. Les posicions de codons incloses eren 1r més 2n més 3r més No codificació. Hi havia un total de 3729 posicions al conjunt de dades final. Les anàlisis evolutives es van realitzar mitjançant el paquet de programari MEGA11 (Tamura et al. 2021).

Per detectar si el gen IFIH1 ha evolucionat de manera adaptativa, hem utilitzat el programa codeml del paquet de programari PAML v4.9j (Yang 2007). La seqüència de nucleòtids i el fitxer d'alineació de la seqüència de proteïnes corresponent es van enviar a PAL2NAL (Suyama et al. 2006) per formar els fitxers d'alineació de nucleòtids d'entrada de CODEML adequats. Les anàlisis de selecció positiva dels gens ortòlegs MDA5 es van realitzar mitjançant models de llocs i branques (Yang et al. 2005; Yang i Bielawski 2000). La relació de taxa de substitució no sinònim/sinònim (ω=dN/dS) proporciona una mesura de la pressió selectiva a nivell d'aminoàcids. La magnitud del valor de dN/dS (ω) representa els tipus de selecció: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 per a la selecció positiva (Yang et al. 2005). A CODEML es van seleccionar els models de llocs (M0, M1, M2, M3, M7 i M8) i els models de sucursals (Clades A i C) per realitzar l'anàlisi de selecció positiva (Bielawski i Yang 2004; Yang i Nielsen 2002). En els models de lloc, es va utilitzar la prova de relació de probabilitat (LRT) per provar la selecció positiva comparant els tres parells de models (M0/M3, M2/M1 i M7/M8). L'anàlisi es va realitzar tant per a la seqüència de longitud completa com per a la seqüència del domini C-Terminal (CTD).

Anàlisi Estructural i Simulacions de Dinàmica Molecular

L'estructura de microscòpia crioelectrònica (crio-EM) del filament hMDA5–dsRNA en presència d'ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) es va utilitzar com a sistema model per a la dinàmica molecular ( MD) simulacions. Tots els residus de proteïnes es van resoldre (307–1020), es van conservar els 14 parells de bases d'ARN de doble cadena (dsRNA) i el zinc coordinat, mentre que els residus que faltaven es van modelar mitjançant el servidor SWISS-MODEL (Waterhouse et al. 2018). Els paràmetres del camp de força i els àtoms d'hidrogen es van afegir mitjançant el mòdul XLEaP d'AMBER 18 (Case et al. 2005). Els camps de força AMBER f14SB (Maier et al. 2015) i f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) es van utilitzar per a la proteïna i l'ARN, respectivament, amb els paràmetres modrna08 (Aduri et al. 2007) per als nucleòsids modificats. La mutació I923V es va introduir a MDA5 eliminant manualment el grup metil Cδ de I923, mentre que la ribosa modificada d'U12 es va metilar a 2′-O mitjançant el residu de la biblioteca modrna08 MRU. L'ió zinc es va unir amb els 4 residus de cisteïna 907, 910, 962 i 964, utilitzant paràmetres de camp de força adequats per retenir una esfera de coordinació tetraèdrica (longituds d'enllaç Zn–S de 2,35 Å amb 50 kcal·mol–1·Å–2). constants de força i angles S–Zn–S de 109,5 graus amb 25 kcal·mol–1·rad–2).

D'aquesta manera, vam preparar 4 sistemes per a les simulacions de MD: (i) el MDA5–dsRNA natiu, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA (2′OMe) i (iv) MDA5( V923)–dsRNA (2′OMe). Tots els sistemes es van solvatar en caixes de dissolvents octaèdrics truncats de molècules d'aigua TIP3P preequilibrades, amb un tampó mínim d'10 Å al voltant del complex i després es va afegir el nombre necessari de contra-ions per obtenir la neutralització de càrrega dels sistemes. Les simulacions MD es van realitzar amb la versió accelerada per GPU del mòdul PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2013) a AMBER 18 i un pas de temps de 2 fs. La temperatura es va regular mitjançant el termòstat Langevin amb una freqüència de col·lisió d'1,0 ps–1, mentre que la pressió es va regular mitjançant el baròstat Berendsen amb un temps de relaxació de pressió d'1,0 ps. SHAKE es va utilitzar per restringir enllaços que implicaven àtoms d'hidrogen amb una tolerància de 10-6 Å, mentre que les interaccions no enllaçades es van calcular amb un límit d'espai directe de 10 Å.

La minimització d'energia es va realitzar inicialment durant 1{{20}},000 passos amb restriccions posicionals d'100 kcal·mol–1·Å–2 constant de força sobre els àtoms no hidrogen de MDA5–dsRNA. A continuació, el dissolvent es va equilibrar a 300 K i 1 atm mitjançant rondes curtes de simulacions en els conjunts NVT i NPT, 100 ps i 400 ps, ​​respectivament, mantenint les restriccions als àtoms no hidrogen del solut. Posteriorment, es va realitzar una minimització d'energia durant 10 passos 000, però amb restriccions posicionals de 10 kcal·mol–1·Å–2 només en els àtoms de C de MDA5 i la columna vertebral de fosfat de l'ARNdb. En 3 sub es van relaxar gradualment (10, 0, 1, 0, 0, 1 kcal · mol–1 · Å–2) durant 1 ns, seguit de 9 ns d'equilibri sense restricció a pressió constant. Després d'aquests 10 ns inicials d'equilibri (no utilitzats a l'anàlisi), es van realitzar 100 ns de simulacions de producció en el conjunt NPT per a cada sistema a 300 K i 1 atm, mentre s'emmagatzemaven instantànies del sistema cada 5,0 ps per a l'anàlisi mitjançant el CPPTRAJ. mòdul de AMBER 18 (Roe i Cheatham 2013). Totes les figures que representen models 3D es van generar mitjançant el sistema de gràfics moleculars PyMOL (build de codi obert v.2.3).

Resultats

Anàlisi filogenètica de la substitució Ile923Val de MDA5

L'evolució i l'especiació de MDA5 i el seu RIG-I relacionat són revisats àmpliament per (Brisse i Ly 2019). Aquí es va utilitzar l'evolució IFIH1 per definir elements de conservació a la seqüència MDA5 sobre el polimorfisme particular. L'anàlisi evolutiva va revelar una gran conservació de seqüències entre MDA5 de diferents espècies (984 de les 1000 seqüències investigades tenen isoleucina a la posició equivalent de hMDA #923) al domini RD/CTD, cosa que indica una importància estructural/funcional. El polimorfisme rs35667974 a l'exó 14 del gen humà provoca una mutació d'aminoàcids conservada a la posició 923 d'Ile a Val a hMDA5. Tanmateix, hi ha altres setze espècies llunyanes que tenen la mateixa posició ocupada per una valina (Fig. 1) que indica la viabilitat d'aquest canvi entre espècies al domini RD/CTD de MDA5 i al domini RS/GY molt homòleg de les isoformes X1, helicases X3 i DHX58 (Fig. 2). A més, l'alineació de la seqüència de la regió al voltant de la posició hMDA #923 (el bucle d'interacció MDAs CTD) revela una seqüència moderada a altament conservada entre espècies llunyanes que indica la importància funcional de la regió entre espècies.

Detecció de selecció positiva

Per detectar si el gen IFIH1 ha evolucionat de manera adaptativa, es van utilitzar models de llocs i models de branques per realitzar anàlisis de selecció positiva d'ortòlegs de tot el gen i el domini CTD. En els models de llocs, no es van identificar llocs de selecció positius per al domini CTD (taula 2). M0 implica una taxa d'evolució constant (ω=dN/dS=0.2) (Taula 2). Alguns llocs que havien sofert una selecció positiva es van identificar mitjançant el mètode dels models de lloc M{2- i M{8-per a tot el gen (taula suplementària 1), encara que no a les regions d'interacció de l'ARN i al domini CTD. En els models de lloc, ω (dN/dS) és<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

En particular, per al model C del lloc de branca per al domini CTD (taula suplementària 3), el 33 per cent dels llocs estan evolucionant a la categoria ω0=0. 036. Com que els llocs que evolucionen sota aquesta categoria no distingeixen entre els tipus de branques, tots dos tipus de branques tenen el mateix valor de ω per als llocs d'aquesta categoria. A més, el 55 per cent dels llocs estan evolucionant sota la categoria ω2. No obstant això, aquests tenen valors ω que estan condicionats al tipus de branca (ω20=0.25 i ω21=0). A més, per al model C del lloc de branca per als 39 gens ortòlegs MDA5 (taula suplementària 4), el 33 per cent dels llocs estan evolucionant a la categoria ω0=0. 027. D'altra banda, el 41 per cent dels llocs estan evolucionant sota la categoria ω2. Tanmateix, aquests tenen valors ω que estan condicionats al tipus de branca (ω20=0.25 i ω21=15.32).

Anàlisi Estructural

L'anàlisi evolutiva realitzada demostra que la substitució d'Ile923Val no és una variant única en l'espècie humana, ja que Val també existeix en la posició de la seqüència MDA5 en altres espècies. MDA5 és un receptor d'ARN de doble cadena viral (ARNdc) que té un paper clau en la immunitat antiviral gràcies a la seva especificitat diferent per a l'ARN viral (Wu et al. 2013). S'ha demostrat que la 2'-O-metilació de l'ARNm viral és important per a les respostes immunitàries innates, per tant s'ha suggerit que la 2'-O-metilació és una signatura molecular per a la distinció de l'ARNm propi i no propi. (Zust et al. 2011). Per investigar el paper potencial de la substitució Ile923Val en la variant IFIH1 rs35667974, es va analitzar l'estructura de microscòpia crioelectrònica (crio-EM) del filament MDA5-dsRNA en presència d'ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). La posició 923 es troba al bucle 921-927 que interacciona directament amb el dsRNA (Fig. 3A). En particular, Ile923 es troba a 4,8 Å de 2′-ΟΗ de l'uridina U12, i la seva interacció s'estabilitza mitjançant un enllaç d'hidrogen entre l'His927 adjacent i la base d'uracil. No s'espera que la substitució d'Ile923 per Val a la variant rs35667974 introdueixi cap xoc estèric, en lloc de minimitzar les interaccions amb 2′-ΟΗ d'uridina U12 (Fig. 3B). En cas que l'ARN estigui metilat a la ribosa d'U12, la variant natural de MDA5 amb Ile923 mostra un contacte favorable de Van der Waals amb un grup 2′-OMe d'U12 a 3,6 Å (Fig. 3C), mentre que Val923 de la variant rs35667974 és situat a 5,0 Å (Fig. 3D). Aquestes diferències no poden suggerir un efecte important de la substitució Ile923Val per se; tanmateix, els canvis estructurals subtils sovint condueixen a canvis funcionals significatius mitjançant la interrupció de la dinàmica estructural del sistema.

Càlculs de Dinàmica Molecular

Per investigar l'efecte de la mutació I923V de MDA5 en la seva interacció amb dsRNA, tant natiu com 2′-Ο-metilat, hem emprat simulacions de dinàmica molecular de 4 sistemes a l'escala de temps 100-ns. La dinàmica dels sistemes es va controlar mitjançant les fluctuacions de l'arrel quadrada mitjana (RMSF) de cada residu de proteïna i la distància d'enllaç d'hidrogen de H927 amb U12 (Fig. 4). Els nostres càlculs suggereixen que la mutació de I923 a V923 en MDA5 va provocar una petita pertorbació de la dinàmica dins de la regió de contacte de l'ARN (residus 923-934) i el bucle d'interacció interproteïna (950-955) del complex amb dsRNA natiu (Fig. 4C). . Aquesta observació va ser similar en el cas de la 2′-O-metilació a U12, tot i que es va observar un efecte més pronunciat en la dinàmica global de la regió carboxi-terminal del mutant MDA5 V923 (Fig. 4D).

Ara tenint en compte la interacció clau d'enllaç d'hidrogen del residu H927 adjacent amb la base d'uracil, les nostres simulacions de MD suggereixen que la metilació a 2′-O no l'afecta a la MDA5 nativa (Fig. 4E). Tanmateix, la mutació V923 no afecta l'enllaç d'hidrogen de H927 en l'ARNdb natiu, però va mostrar un efecte desestabilitzador en presència de 2'-O-metilació (Fig. 4F). En conjunt, les nostres simulacions de MD suggereixen que, tot i que l'efecte de la mutació I923V de MDA5 en la interacció amb dsRNA nadiu és marginal, el seu efecte en la dinàmica i l'estabilitat del complex MDA5/ARN és més significatiu quan l'uracil està 2′-O-metilat. .

Discussió

Aquest estudi representa una investigació evolutiva i estructural del paper de la variant compartida rs35667974 del locus autoimmune IFIH1, que s'ha informat que condueix a un fenotip de funcionalitat modificat per a MDA5 (Downes et al. 2010). L'aplicació de models de llocs evolutius i de branques per realitzar anàlisis de selecció positiva indica que no hi ha llocs de selecció positius als llocs d'interacció de l'ARN on resideix el polimorfisme rs35667974. Ni els models de sucursals indiquen que cap lloc en particular ha sofert una selecció positiva al domini CTD.

Això està d'acord amb les freqüències d'aparició molt baixes de la variant Ile923Val fins i tot entre la població humana (taula 1). No obstant això, la població europea en comparació amb les altres té una diferència en la freqüència de l'al·lel C d'un ordre de magnitud. Sense oblidar la petita mida de la mostra, la distribució geogràfica del polimorfisme en estudi mostra que la seva aparició a la població europea com a punt de partida pot ser deguda a les condicions de vida i nutrició que han canviat en els darrers anys. La investigació estructural del paper de l'SNP examinat es va realitzar examinant l'estructura del complex dsRNA-MDA5 (natiu i mutant).

A nivell de formació del complex dsRNA-MDA5, la introducció de la mutació Ile923Val influeix en la interacció del domini C-terminal de la proteïna (CTD) amb el dsRNA amb la introducció d'una cavitat hidròfoba al costat del sucre de ribosa de la cadena única del dsRNA. . Hem demostrat que en el cas de l'ARN metilat a la cadena fosforibosil d'una cadena, altres efectes dinàmics poden influir en la interacció del mutant sense afectar el tipus salvatge. Això està d'acord amb estudis experimentals (Looney et al. 2015; Brisse i Ly 2019) que mostren que l'efecte del polimorfisme Ile923Val identificat a les proximitats d'un punt d'interacció MDA5-dsDNA pot no influir en les propietats natives d'unió a dsRNA, però alterat per 2. 5-reducció de l'activitat catalítica (Shigemoto et al. 2009). A més, els estudis de dinàmica molecular han demostrat el paper crític de la metilació en el mutant pel que fa a la mobilitat i l'estabilitat dels bucles MDA5 941–959 i 970–977 implicats en la interacció dsRNA i la interacció interproteïna en la formació del filament MDA. Aquests efectes poden dificultar el conjunt de filaments MDA5, l'associació MDA5-MAVS i el conjunt de filaments MAVS que activen encara més l'expressió dels gens d'interferó tipus I (IFN1: IFN i IFN). En els casos de T1D i PsA, com a conseqüència, els nivells reduïts d'activitat de la proteïna MDA5 i, per tant, la menor producció d'IFN protegeix contra l'autoimmunitat. Aquestes observacions suggereixen que diverses variants d'IFIH1, previstes per afectar la interacció de MDA5 amb MAVS i la reducció de la producció d'IFN, disminuirien el risc de malalties, mentre que la funció normal de MDA5 s'associa amb elles (Shigemoto et al. 2009).

Això condueix a la conclusió que, com en el cas de l'ARN viral, la metilació de l'auto-dsRNA, una mutació identificada per l'ARN, és un factor de selecció/activació important per a la introducció d'efectes protectors en algunes malalties autoimmunes. Els resultats del present estudi amplien el coneixement de la importància biològica de rs35667974 SNP del locus IFIH1 en el desenvolupament de les malalties esmentades anteriorment i destaquen la importància dels estudis de gens compartits per múltiples malalties autoimmunes. Tanmateix, en estudis poblacionals per a l'associació genètica de SNP amb malalties autoimmunes, utilitzant, per exemple, PCR-RFLP, xips de seqüenciació o genotipat, no es té en compte un cas de metilació de l'ARN. Per tant, és important conèixer l'estat de metilació de l'ARNdb que interactua i el seu efecte sobre l'al·lel MDA5. Com en el cas del reconeixement d'ARNdb viral (Wu et al. 2013) i la distinció entre ARNm propi i no propi (Züst et al. 2011), la pèrdua d'un grup metil del MDA5 que interacciona, com en el cas del mutant Ile923Val MDA5, pot afectar la formació del filament i la inducció d'interferó tipus I.

Cal destacar que Plenge et al. (2013) havien discutit anteriorment el potencial d'una variant rara en un gen de malaltia causal per representar un objectiu terapèutic putatiu per a la intervenció farmacèutica. Per a això, s'ha de conèixer la funció biològica de la variant causant en qualsevol intent d'enllaçar les troballes genètiques amb una nova diana terapèutica. Per tant, localitzar la posició d'una variant causant a l'estructura 3D de la proteïna respectiva i investigar el seu paper des del punt de vista estructural/funcional en una via patogenètica que condueix a una malaltia autoimmune sembla ser d'una importància cabdal per a la gestió posterior i un millor tractament de els pacients. Encara hi ha una necessitat suprema d'anar més enllà del descobriment dels SNP associats a una comprensió més profunda de les variants causatives per dilucidar els mecanismes moleculars i les vies de la malaltia. Es requereix una anàlisi estructural-funcional addicional per investigar la unió de l'auto-dsRNA metilat de ribosa -2'-Ο a MDA5 i com això afecta el conjunt de fibril·les MDA5. El paper biològic 2′-Ο-metilat de l'ARNm com a sensor de distinció entre el virus i l'ARNm propi en la inducció de l'interferó de tipus I pot haver-se estès a un sensor protector en determinades autoimmunopaties.

Conclusió

El rar polimorfisme del gen rs35667974 IFIH1 protegeix de T1D, PS i PsA, mentre que l'al·lel IFIH1 portat per la majoria de la població predisposa a les malalties. El finançament que el mutant Ile923Val MDA5 funciona de manera diferent en la interacció amb l'auto-dsRNA i en particular amb el 2′-O-metilat suggereix que, en alguns casos, les variants que interaccionen amb dsRNA metilat pertorben la formació de filaments MDA5, la interacció MAVS i la formació de filaments, i És possible que la senyalització d'IFN, com en la resposta antiviral de l'hoste, hagi estat seleccionada negativament perquè confereix protecció contra malalties.

Aportacions dels autors

Conceptualització: AA, AP, EEE i GNG, metodologia: AA, AP i EEE, validació: AA, AP, MIZ, GNG i EEE, investigació: GNG, AA, AP i MIZ, recursos: GNG, AA, AP i MIZ, curació de dades: AA i AP, redacció i preparació de l'esborrany original: EEE, GNG, AA, AP i MZ, escriptura, revisió i edició del manuscrit: AA, AP, MZ, GNG i EEE, visualització: AA, AP i EEE, supervisió: EEE i adquisició de finançament: EEE. Tots els autors han llegit i acceptat la versió publicada del manuscrit.

Finançament

El finançament d'accés obert és proporcionat per HEAL-Link Grècia. Aquest treball va comptar amb el suport del projecte "INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization" (Grant MIS 5002550), que s'implementa en el marc de l'Acció "Reinforcement of the Research and Innovation Infrastructure," finançat pel Programa Operatiu "Competitivitat, Emprenedoria i Innovació" (NSRF 2014–2020) i cofinançat per Grècia i la Unió Europea (Fons Europeu de Desenvolupament Regional).

Disponibilitat de dades

Els conjunts de dades utilitzats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a l'autor corresponent a petició.

Declaracions

Conflicte d'interessos

Els autors declaren no conflicte d'interessos. Els finançadors no van tenir cap paper en el disseny de l'estudi; en la recollida, anàlisi o interpretació de dades; en la redacció del manuscrit, o en la decisió de publicar els resultats.

Aprovació ètica

No aplicable.

Consentiment per participar

No aplicable.

Consentiment per a la publicació

No aplicable.

Accés Obert

Aquest article té una llicència Creative Commons Attribution 4.0 International License, que permet l'ús, la compartició, l'adaptació, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà o format, sempre que doneu el crèdit adequat als autors originals. ) i la font, proporcioneu un enllaç a la llicència Creative Commons i indiqueu si s'han fet canvis. Les imatges o altres materials de tercers d'aquest article s'inclouen a la llicència Creative Commons de l'article tret que s'indiqui el contrari en una línia de crèdit del material. Suposem que el material no està inclòs a la llicència Creative Commons de l'article i que l'ús previst no està permès per la normativa legal o supera l'ús permès. En aquest cas, heu d'obtenir el permís directament del titular dels drets d'autor.

Referències

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) Paràmetres de camp de força AMBER per als nucleòsids modificats naturals de l'ARN. J Teoria Química Comput 3:1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST i PSI-BLAST: una nova generació de programes de cerca de bases de dades de proteïnes. Àcids nucleics Res 25:3389–3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Coneixements estructurals i evolutius dins de la família del gen polisacàrid deacetilasa del bacillus anthracis i bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Identificació d'una hidrolasa de nucleòsids 2′-O-metiluridina mitjançant les biblioteques metagenòmics. Molècules.

5.Berman HM, Westbrook J, Feng Z et al (2000) El banc de dades de proteïnes. Àcids nucleics Res 28:235–242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Un mètode de màxima probabilitat per detectar la divergència funcional en llocs de codons individuals, amb aplicació a l'evolució de la família de gens.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Gens mediadors entorn interaccions en tipus 1 diabetis.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: a database of RNA modification pathways. actualització 2017. Àcids nucleics Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Anàlisi comparativa d'estructura i funció dels receptors semblants a RIG-I: RIG-I i MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Un al·lel codificant rar a IFIH1 és protector de l'artritis psoriàsica. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com