La modulació de la via de senyalització del receptor d'hidrocarburs aril impacta en la replicació del virus Junín Part 2

3. Resultats i discussió

3.1. La via AHR està sobrerepresentada durant la infecció JUNV

El fetge és un dels principals objectius durant la infecció per JUNV [22]. Per dilucidar els mecanismes moleculars implicats en una infecció d'hepatòcits, vam realitzar un cribratge de microarrays Affymetrix per determinar els gens expressats de manera diferent en cèl·lules HepG2 humanes derivades del fetge infectades amb JUNV IV4454 durant 24 o 48 h.

Hem utilitzat el programari Transcriptome Analysis Console de ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA per avaluar els gens expressats de manera diferent a les cèl·lules infectades amb JUNV en comparació amb el control (figura 1a, b). Es van detectar un total de 266 i 313 gens expressats de manera diferent a les 24 i 48 h pi, respectivament (figura 1a, b).

Assaig de microarrays Affymetrix (n=3 experiments independents per condició). Els gens hostes que mostren almenys un canvi d'expressió d'1,6-vegament i una probabilitat del 95% d'expressar-se de manera diferencial (p=0,05) es van considerar per a una anàlisi posterior. Els gens mostrats en vermell estaven regulats a l'alça, els gens mostrats en verd estaven regulats a la baixa i els gens en gris no van mostrar cap canvi en l'expressió en comparació amb les cèl·lules HepG2 no infectades. ( b ) Gens expressats de manera diferenciada entre cèl·lules HepG2 infectades amb simulacres i infectades amb JUNV a 48 h pi. ( c ) Ontologia gènica Anàlisi de gens expressats de manera diferencial en cèl·lules HepG2 infectades per JUNV a 48 h pi. ( d ) Anàlisi de sobrerepresentació de la via de cèl·lules HepG2 infectades amb JUNV en comparació amb cèl·lules infectades simulades que mostren les principals vies de senyalització afectades durant la infecció. La barra vermella destaca la via AHR. La línia blava discontínua indica p=0.05. Els valors p es van determinar mitjançant el programari WebGestalt (http://www.webgestalt.org, consultat el 3 de juliol de 2020).

Hi ha una estreta relació entre els gens hoste i la immunitat. Els gens hostes determinen en gran mesura el desenvolupament i la funció del sistema immunitari d'una persona i poden afectar la resistència d'una persona a diferents patògens.

Diversos estudis han demostrat que determinades mutacions gèniques poden provocar desequilibris en el sistema immunitari. Per exemple, algunes persones poden patir malalties en les quals el sistema immunitari reacciona de manera excessiva, fent que el sistema immunitari atac els teixits del seu cos, com ara el reumatoide, el lupus eritematós sistèmic i altres malalties. A més, la resistència als patògens com ara bacteris, virus i paràsits també s'associa amb diferències genètiques. Algunes persones neixen amb un sistema immunitari més eficient que elimina els patògens més ràpid i completament.

La investigació sobre la relació entre els gens hoste i la immunitat ens ha permès aprofundir en els mecanismes de defensa de l'organisme i també ens ha ajudat a entendre millor la resposta de l'organisme a diferents malalties. Això és de gran importància per a la prevenció i el tractament de malalties.

Per tant, hauríem de prestar atenció a la importància de les proves genètiques i aprendre i entendre les diferències entre els gens humans per protegir millor el nostre sistema immunitari, enfortir el nostre físic i construir un cos fort. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la nostra immunitat. Cistanche pot millorar significativament la immunitat, perquè el Cistanche és ric en una varietat de substàncies antioxidants, com ara vitamina C, vitamina C, carotenoides, etc. Aquests ingredients poden eliminar els radicals lliures i reduir l'estrès oxidatiu. Estimular i millorar la resistència del sistema immunitari.

Cliqueu els avantatges de cistanche tubulosa

Per estudiar més l'impacte de JUNV en el paisatge cel·lular, hem utilitzat el programari WebGestalt (http://www.webgestalt.org, consultat el 3 de juliol de 2020), que utilitza la base de dades Wikipathways com a dipòsit per realitzar una anàlisi d'ontologia gènica ( Figura 1c) i per determinar quines vies de senyalització es van alterar de manera diferent en comparació amb el control (figura 1d).

Pel que fa a l'anàlisi d'ontologia gènica a partir dels gens expressats de manera diferent, es va concloure que la infecció per JUNV afecta l'expressió de gens relacionats amb el metabolisme de l'ARN, les cinases hoste i el metabolisme dels lípids (figura 1c). Val la pena assenyalar que s'ha informat que aquests processos biològics i funcions moleculars són objectiu de JUNV durant el seu cicle de replicació [23].

A més, l'anàlisi de sobrerepresentació de la via va revelar que la infecció per JUNV enriqueix la via de senyalització AHR a 48 h pi (figura 1d) entre moltes altres vies (p <{2}}.05). En particular, vam detectar una expressió augmentada del gen objectiu AHR CYP1B1, que evidencia una major activitat de la via AHR.

Durant els darrers anys, diversos estudis van revelar la importància de l'AHR com a diana terapèutica en diferents escenaris patològics; així, s'ha desenvolupat una gran varietat de petits compostos per modular la seva activitat. Vam decidir estudiar més l'impacte de la modulació de l'AHR durant la infecció in vitro de JUNV.

3.2. La modulació farmacològica de l'AHR afecta la replicació viral

Per dilucidar el paper que juga l'AHR en les infeccions per JUNV, vam decidir provar els efectes dels lligands AHR coneguts CH223191 (antagonista) i la quinurenina (agonista) en infeccions in vitro amb dues soques diferents de JUNV atenuades: IV4454 i Candid #1. Els tractaments i les infeccions es van realitzar utilitzant cèl·lules Huh-7 i Vero. Com que aquesta darrera línia cel·lular no pot expressar i secretar interferó tipus I (IFN-I), el seu ús permet determinar la importància de l'expressió d'IFN-I en la possible interacció hoste-virus mediada per AHR.

En primer lloc, es va avaluar la citotoxicitat de diferents concentracions tant de CH223291 com de quinurenina mitjançant un assaig MTT (figura 2a, b) i observacions de microscòpia òptica (figura 2c, d).

Pel que fa a CH223191, només es va detectar una disminució de la viabilitat cel·lular i alteracions morfològiques associades amb efectes citotòxics a concentracions de 80 µM (figura 2a, c). D'altra banda, la quinurenina no va induir efectes citotòxics a cap concentració provada (figura 2b, d).

Per investigar l'efecte de la modulació farmacològica de l'AHR durant la infecció per JUNV, els cultius cel·lulars es van tractar amb vehicle (DMSO), CH223191 o quinurenina i després es van infectar amb JUNV durant 48 h per determinar el rendiment viral. Breument, les cèl·lules Vero i Huh-7 van ser tractades amb vehicles o tractades amb diferents concentracions de la petita molècula CH223191 (2,5, 5 µM, 10 µM i 20 µM) o quinurenina (5 µM, 10). µM, 20 µM i 40 µM) abans i després de la infecció JUNV amb IV4454 i Candid#1 a un MOI de 0,5. Després de 48 h, es van recollir els sobrenedants i es van utilitzar per infectar cèl·lules Vero per a l'assaig PFU (figura 3).

El bloqueig de l'AHR va reduir significativament la producció de partícules virals d'una manera dosi-resposta, fins i tot amb la concentració més baixa de CH223191 provada. És important destacar que aquest resultat no només es va observar utilitzant ambdues soques atenuades amb JUNV, sinó també en ambdues línies cel·lulars infectades (Vero i Huh7). El tractament CH223191 de cèl·lules Vero i Huh-7 infectades amb JUNV va disminuir el nombre de plaques virals en un 93 per cent i un 97 per cent, respectivament (figura 3a, b). Aquests resultats suggereixen fortament que la via de senyalització AHR és un factor cel·lular important durant la infecció per JUNV (figura 3a, b). D'altra banda, l'administració de quinurenina abans i després de la inoculació de JUNV no va canviar significativament el títol viral obtingut en comparació amb el control viral (figura 3c, d).

Amb tot, els resultats van evidenciar per primera vegada que l'AHR és un factor cel·lular important durant la infecció in vitro de JUNV, la qual cosa implica un paper pro-viral facilitant el cicle de replicació viral.

3.3. La modulació de l'AHR té un impacte en l'expressió de proteïnes JUNV

Per estudiar més els efectes de la modulació de l'AHR sobre la infecció per JUNV, vam realitzar un assaig d'immunofluorescència indirecta. La proteïna JUNV NP és la proteïna estructural i funcional més abundant dins de la família Arenaviridae. Així, es va escollir NP com un objectiu de tinció interessant atès que només uns pocs estudis van informar del patró d'expressió de NP de diferents soques atenuades de JUNV. El nostre primer pas va ser determinar la distribució de NP de les dues soques JUNV als nostres models cel·lulars per comparar la permissivitat de les diferents línies cel·lulars i la difusió viral d'ambdues soques atenuades en aquests cultius cel·lulars (figura 4).

La localització de NP era exclusivament citoplasmàtica i presentava un patró d'acumulació de puntuació gran homogeni, similar per a les dues soques a les línies cel·lulars Vero i Huh-7 (figura 4).

A continuació, es va avaluar per immunofluorescència l'impacte de la modulació farmacològica de l'AHR en l'expressió de NP en cultius cel·lulars infectats amb JUNV.

Breument, les cèl·lules es van sembrar sobre cobertors de vidre, es van tractar prèviament amb vehicle (DMSOCH223191 (10 uM) o quinurenina (40 uM) i després es van infectar amb simulacre o infectades per JUNV durant 48 h. Després, les cèl·lules es van fixar i processar mitjançant una immunofluorescència. assaig (figura 5).

L'administració de CH223191 va disminuir notablement el nombre de cèl·lules NP positives en ambdós cultius cel·lulars i per a les dues soques JUNV (figura 5). Aquestes observacions es correlacionen amb els resultats anteriors que es mostren a la figura 3a, b. El bloqueig de l'AHR va reduir no només el percentatge de cèl·lules infectades amb JUNV, sinó també la mida dels focus virals. Els cultius de cèl·lules Vero pretractats amb CH223191 i infectats amb IV4454 o Candid #1 van mostrar una reducció de la mida dels focus del 57,14% (SD ± 7,98) i un 41,17% (SD ± 9,05), respectivament. A més, els cultius de cèl·lules Huh-7 pretractats amb l'antagonista i infectats amb IV4454 o Candid #1 van mostrar una reducció de la mida dels focus del 28,57 per cent (SD ± 8,70) i ​​del 12,50 per cent (SD ± 9,30), respectivament. D'altra banda, es va observar que el tractament amb quinurenina no va alterar el percentatge de cèl·lules NP positives (figura 5) ni la mida dels focus (no mostrats), en comparació amb les cèl·lules infectades no tractades.

A més, una inspecció microscòpica més detallada va mostrar que els focus virals eren més grans en cultius de cèl·lules Vero infectades en comparació amb els cultius de cèl·lules infectades amb Huh-7-. Vam observar que la mitjana de cèl·lules Vero infectades per JUNV per focus consistia en 35 cèl·lules, mentre que la mitjana de cèl·lules Huh-7 infectades per JUNV per focus consistia en 6 cèl·lules. Aquesta observació esperada està en línia amb l'entorn viral restringit que les cèl·lules competents en IFN van imposar a la multiplicació de JUNV [24].

3.4. La supressió de l'AHR redueix els nivells virals de JUNV

Finalment, per avaluar si un bloqueig de l'AHR afecta els nivells d'ARN de JUNV, les cèl·lules Vero i Huh-7 es van tractar amb qualsevol vehicle, CH223191 (10 µM) o quinurenina (40 µM), i després van ser simulades o infectades amb JUNV per 48 h. Després, les monocapes cel·lulars es van recollir i processar per a RT-qPCR per controlar els nivells d'ARN ahr, cyp1a1 i np (figura 6).

Es va observar que les cèl·lules tractades amb CH223191- i infectades amb JUNV mostraven una tendència a nivells d'ARNm ahr més baixos en comparació amb les mostres infectades amb JUNV tractades amb vehicles (figura 6a, b). Per contra, l'administració de quinurenina va mostrar una tendència cap a una millora dels nivells d'ARNm ahr a les cèl·lules infectades amb JUNV en comparació amb les mostres infectades amb JUNV tractades amb vehicles (figura 6a, b). D'acord amb aquests resultats, el tractament amb CH223191 va mostrar una tendència cap a una reducció dels nivells d'ARNm de cyp1a1 a les cèl·lules Huh-7, mentre que el tractament amb quinurenina va mostrar efectes contraris (figura 6c). Pel que fa al nivell d'ARN de JUNV, es va observar que el tractament amb l'antagonista de l'AHR CH223191 va reduir els nivells d'ARN viral a les cèl·lules infectades en comparació amb les mostres infectades amb JUNV tractades amb vehicles, mentre que les cèl·lules tractades amb quinurenina i les infectades amb JUNV van tendir a un augment del nivell viral. Nivells d'ARN (figura 6d, e).

En aquest treball, vam demostrar per primera vegada que la infecció in vitro de JUNV indueix l'activació de la via de senyalització AHR en cultius de cèl·lules derivades del fetge. Les dades d'anàlisi de microarrays van mostrar que la via de senyalització AHR està sobreexpressada en cultius cel·lulars infectats amb JUNV a 48 h pi.

Diversos estudis van informar que l'activació de l'AHR pot tenir una varietat d'efectes sobre la fisiologia cel·lular, afectant la proliferació i les respostes immunes innates [6,25]. De fet, en l'última dècada, s'ha descrit que l'activació de l'AHR té efectes que exerceixen l'activitat moduladora d'IFN sobre la secreció de citocines [26,27]. És important destacar que la senyalització de regulació de l'AHR pot reduir les respostes immunitàries antivirals d'IFN-I [28]. En aquest sentit, es va avaluar l'impacte de la modulació de la via de senyalització AHR en cultius de cèl·lules IFN no competents i competents, com ara models cel·lulars Vero i Huh-7, utilitzant petites molècules comercials antagonistes i agonistes d'AHR durant la infecció in vitro de JUNV amb dues soques atenuades diferents.

Mitjançant diferents enfocaments, es va confirmar que la modulació negativa de l'AHR mitjançant inhibició farmacològica amb CH223191 tenia activitat antiviral contra JUNV. Després del bloqueig de l'AHR, es va trobar inhibida la infecció in vitro de JUNV. Es va observar una disminució important de l'expressió de proteïnes virals en cultius cel·lulars infectats amb JUNV tractats amb l'antagonista AHR. A més, el bloqueig de l'AHR va disminuir la producció de partícules virals infeccioses extracel·lulars de les soques IV4454 i Candid # 1 atenuades de JUNV estudiades en aquest treball. A més, es va observar una tendència cap a una disminució dels nivells d'ARN viral a les cèl·lules tractades amb CH223191-. Curiosament, aquestes troballes es van observar tant a les línies cel·lulars Huh-7 com a Vero i van mostrar una magnitud equivalent, cosa que suggereix que el paper pro-viral de l'AHR durant la infecció per JUNV podria ser independent de la via de senyalització de l'IFN-I. Aquests resultats estan en línia amb les nostres observacions anteriors en altres models virals [13]. Es necessitaran més estudis per dilucidar quin pas del cicle de replicació de JUNV està afectat pel bloqueig de l'AHR.

Els estudis que mostren l'activació de l'AHR per lligands antropogènics han guanyat un interès particular a causa de la creixent consciència que implica una explotació ambiental inadequada i la seva interacció amb la gravetat de la infecció viral [2]. Tingueu en compte que l'àrea d'hàbitat coberta pels rosegadors vectors JUNV comprèn un gran territori; tanmateix, actualment, l'AHF només afecta una regió restringida i confinada on es duen a terme principalment activitats rurals [29]. A més, els treballadors agrícoles són la principal població amb risc de patir manifestacions greus durant la malaltia de l'AHF. El nostre treball actual suggereix que l'exposició dels rosegadors / humans als agonistes de l'AHR podria tenir un impacte en el resultat de la infecció per JUNV.

Tot i que en les últimes dècades s'han dedicat esforços intensius a la investigació antiviral contra els arenavirus [30], actualment no hi ha quimioteràpia antiviral específica disponible per al tractament de l'AHF i les malalties humanes causades per altres membres patògens d'Arenaviridae. En particular, el virus de Lassa (LASV) és l'agent de la febre de Lassa (LF), que representa una amenaça humana greu a les regions de l'Àfrica occidental amb una taxa de mortalitat molt alta [31]. Actualment, l'únic tractament alternatiu contra la LF és l'ús fora de l'etiqueta de l'anàleg de guanosina ribavirina, que s'ha demostrat que és parcialment eficaç en pacients amb LF només si la seva administració s'inicia dins dels 6 dies posteriors a l'aparició dels símptomes [32,33]. A més, la ribavirina pot induir efectes secundaris adversos limitant la recomanació de la seva administració només a pacients amb alt risc. Aleshores, hi ha una demanda real de nous antivirals efectius per al tractament de les febres hemorràgiques arenavirus. AHR representa un nou objectiu d'amfitrió a considerar. De fet, hi ha diversos assaigs clínics en curs amb inhibidors de l'AHR (BAY2416964, IK-175 i HP163) en el tractament de diferents càncers. No obstant això, aquests assaigs es troben en les primeres etapes i cap se centra en el potencial antiviral de l'orientació farmacològica de l'AHR. Notablement, els fàrmacs dirigits a factors cel·lulars necessaris en el cicle de multiplicació del virus han recuperat l'interès en el desenvolupament antiviral donada la possibilitat d'obtenir un inhibidor d'ampli espectre que afecti un objectiu hoste comú a diversos patògens humans [34,35], una característica associada amb l'AHR.

En conclusió, els resultats combinats del present estudi posen de manifest la rellevància de la modulació de la via de senyalització AHR com a potencial objectiu terapèutic contra JUNV. Es necessitaran estudis futurs per implementar teràpies dirigides a AHR per superar reptes importants, com ara el lliurament dels lligands AHR als teixits i cèl·lules desitjats per minimitzar els possibles efectes de modulació de l'AHR fora de l'objectiu.

Contribucions de l'autor:

Conceptualització, CCG; metodologia, MAP, AEADL i ABM; programari, FG; validació, MAP i FG; anàlisi formal, MAP i MFT; investigació, MAP i MFT; recursos, EBD i CCG; curació de dades, FG; redacció: preparació de l'esborrany original, MAP i MFT; redacció: revisió i edició, EBD i CCG; supervisió, CCG; administració de projectes, CCG; adquisició de finançament, EBD i CCG Tots els autors han llegit i han acceptat la versió publicada del manuscrit.

Finançament:

Aquest treball ha estat finançat per la Universidad de Buenos Aires (UBA) (número de beca 20020170100363BA) i el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (número de beca PIP11220170100171CO). EBD i CCG són membres de la Carrera Investigadora del CONICET; MFT, AEADL i ABM són becaris del CONICET. MAP és becari de la UBA.

Declaració de la Junta de Revisió Institucional:

No aplicable.

Declaració de consentiment informat:

No aplicable.

Declaració de disponibilitat de dades:

Les dades que donen suport a les conclusions d'aquest estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.

Agraïments:

Donem les gràcies a tots els membres dels laboratoris implicats pels consells i discussions útils.

Conflictes d'interès:

Els autors declaren no conflicte d'interessos. Els finançadors no van tenir cap paper en el disseny de l'estudi; en la recollida, anàlisi o interpretació de dades; en la redacció del manuscrit; o en la decisió de publicar els resultats.

Referències

1. Cap, JL; Lawrence, BP El receptor d'hidrocarburs aril és un modulador de la immunitat antiviral. Bioquímica. Pharmacol. 2009, 77, 642–653. [PubMed]

2. Torti, MF; Giovannoni, F.; Quintana, FJ; García, CC El receptor d'hidrocarburs aril com a modulador de la immunitat antiviral. Davant. Immunol. 2021, 12, 624293. [PubMed]

3. Shinde, R.; McGaha, TL El receptor d'hidrocarburs aril: connectant la immunitat al microentorn. Tendències Immunol. 2018, 39, 1005–1020. [PubMed]

4. Stockinger, B.; Hirota, K.; Duarte, J.; Veldhoen, M. Influències externes sobre el sistema immunitari mitjançant l'activació del receptor d'hidrocarburs aril. Semin. Immunol. 2011, 23, 99–105.

5. Rothhammer, V.; Borucki, DM; Tjon, EC; Takenaka, MC; Chao, CC; Ardura-Fabregat, A.; de Lima, KA; Gutiérrez-Vázquez, C.; Hewson, P.; Staszewski, O.; et al. Control microglial dels astròcits en resposta als metabòlits microbians. Natura 2018, 557, 724–728. [Ref creuat]

6. Quintana, FJ; Basso, AS; Iglesias, AH; Korn, T.; Farez, MF; Bettelli, E.; Caccamo, M.; Oukka, M.; Weiner, HL Control de la diferenciació de cèl·lules Treg i TH17 pel receptor d'hidrocarburs aril. Natura 2008, 453, 65–71. [Ref creuat]

7. Marshall, NB; Kerkvliet, NI Dioxina i regulació immune: paper emergent del receptor d'hidrocarburs aril en la generació de cèl·lules T reguladores. Ann. NY Acad. Ciència. 2010, 1183, 25–37.

8. Vogel, CFA; Khan, EM; Leung, PSC; Gershwin, ME; Chang, WLW; Wu, D.; Haarmann-Stemmann, T.; Hoffmann, A.; Denison, MS Conversa entre el receptor d'hidrocarburs aril i la resposta inflamatòria: un paper per al factor nuclear-KB. J. Biol. Chem. 2014, 289, 1866–1875. [Ref creuat]

9. Bankoti, J.; Rase, B.; Simones, T.; Shepherd, DM Efectes funcionals i fenotípics de l'activació AhR en cèl·lules dendrítiques inflamatòries. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010, 246, 18–28. [Ref creuat]

10. Vogel, CFA; Goth, SR; Dong, B.; Pessah, IN; Matsumura, F. La senyalització del receptor d'hidrocarburs aril media l'expressió de la indoleamina 2, 3-dioxigenasa. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 2008, 375, 331–335. [Ref creuat]

11. Jin, GB; Moore, AJ; Cap, JL; Neumiller, JJ; Lawrence, BP L'activació del receptor d'hidrocarburs aril redueix la funció de les cèl·lules dendrítiques durant la infecció pel virus de la grip. Toxicol. Ciència. 2010, 116, 514–522. [Ref creuat]

12. Giovannoni, F.; Bosch, I.; Polonio, CM; Torti, MF; Wheeler, MA; Li, Z.; Romorini, L.; Rodríguez Varela, MS; Rothhammer, V.; Barroso, A.; et al. AHR és un factor amfitrió del virus Zika i un objectiu candidat per a la teràpia antiviral. Nat. Neurosci. 2020, 23, 939–951. [Ref creuat]

13. Giovannoni, F.; Li, Z.; Remes-Lenicov, F.; Dávola, ME; Elizalde, M.; Paletta, A.; Ashkar, AA; Mossman, KL; Dugour, AV; Figueroa, JM; et al. La senyalització AHR és induïda per la infecció amb coronavirus. Nat. Commun. 2021, 12, 5148. [CrossRef]

14. Buchmeier, MJ; de La Torre, JC; Peters, CJ Arenaviridae: Els virus i la seva replicació. A Fields Virology, 4a ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Filadèlfia, PA, EUA, 2013; pàgines 1283–1303.

15. Enria, DA; Briggiler, AM; Sánchez, Z. Tractament de la febre hemorràgica argentina. Antivir. Res. 2008, 78, 132–139. [Ref creuat]

For more information:1950477648nn@gmail.com