Extracte de cèl·lules de Jasminum Sambac com a reforç antioxidant contra l'envelliment de la pell Part 1

Resum: L'estrès oxidatiu té un paper important en el procés d'envelliment de la pell mitjançant la producció d'espècies reactives d'oxigen i la formació de productes finals de glicació avançada (AGE). Per tant, al mercat de la cura de la pell es necessiten ingredients antioxidants i l'ús de molècules procedents de cultius de cèl·lules vegetals ofereix una oportunitat única. En aquest article, es van explorar les característiques d'un extracte hidroetanòlic obtingut per cèl·lules de Jasminum sambac (JasHEx). Les propietats antioxidants i anti-AGE es van investigar mitjançant un enfocament multidisciplinari que combina experiments espectromètrics de masses i bioinformàtics in vitro i ex vivo. JasHEx conté derivats d'àcid fenòlic, lignans i triterpens i es va trobar que redueix la producció d'espècies reactives d'oxigen citosòliques en queratinòcits exposats a estrès exògen. També va mostrar la capacitat de reduir la formació d'AGE i augmentar la producció de col·lagen tipus I a la matriu extracel·lular. Les dades van demostrar que les propietats antioxidants de JasHEx estaven relacionades amb les seves activitats d'eliminació de radicals lliures i quelants metàl·lics i l'activació de la via Nrf2/ARE. Això pot explicar bé l'activitat antiinflamatòria de JasHEx relacionada amb la disminució dels nivells de NO en macròfags estimulats per LPS. Per tant, JasHEx es pot considerar un potent reforç antioxidant contra l'envelliment de la pell induït per l'estrès oxidatiu.

El glicòsid de cistanche també pot augmentar l'activitat de la SOD en els teixits del cor i del fetge, i reduir significativament el contingut de lipofuscina i MDA a cada teixit, eliminant eficaçment diversos radicals reactius d'oxigen (OH-, H₂O₂, etc.) i protegint contra els danys de l'ADN causats. per radicals OH. Els glucòsids feniletanoides de Cistanche tenen una robusta capacitat d'eliminació dels radicals lliures, una capacitat reductora superior a la de la vitamina C, milloren l'activitat de SOD en la suspensió d'esperma, redueixen el contingut de MDA i tenen un cert efecte protector sobre la funció de la membrana espermàtica. Els polisacàrids de Cistanche poden millorar l'activitat de SOD i GSH-Px en eritròcits i teixits pulmonars de ratolins senescents experimentalment causats per D-galactosa, així com reduir el contingut de MDA i col·lagen al pulmó i el plasma, i augmentar el contingut d'elastina. un bon efecte d'eliminació de DPPH, allarga el temps d'hipòxia en ratolins senescents, millora l'activitat de SOD al sèrum i retarda la degeneració fisiològica del pulmó en ratolins senescents experimentalment Amb la degeneració morfològica cel·lular, els experiments han demostrat que Cistanche té la bona capacitat antioxidant. i té el potencial de ser un fàrmac per prevenir i tractar malalties de l'envelliment de la pell. Al mateix temps, l'echinacòsid a Cistanche té una capacitat significativa per eliminar els radicals lliures DPPH i pot eliminar espècies reactives d'oxigen, prevenir la degradació del col·lagen induïda pels radicals lliures i també té un bon efecte reparador sobre el dany dels anions dels radicals lliures de timina.

Feu clic a On puc comprar Cistanche

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】

Paraules clau: envelliment de la pell; espècies reactives d'oxigen (ROS); productes finals de glicació avançada (AGE); extracte hidroetanòlic de Jasminum sambac (JasHEx); espectrometria de masses; metabolòmica; Xarxa molecular social global de productes naturals (GNPS); factor nuclear eritroide 2-factor 2 relacionat (Nrf2)

1. Introducció

Els factors genètics intrínsecs i els agents extrínsecs com la irradiació ultraviolada, la irradiació infraroja, els xenobiòtics i els contaminants ambientals provoquen la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS). Es generen per l'activació de la cadena respiratòria mitocondrial, el citocrom p450 i les NADPH oxidases [1]. Els ROS inclouen radicals lliures (anió superòxid, radical hidroperoxil, radical alcoxi i radical hidroxil) i molècules no radicals (peròxid d'hidrogen i oxigen singlet) [2]. Quan els sistemes antioxidants es veuen desbordats, les ROS s'acumulen a les cèl·lules i generen l'anomenat estrès oxidatiu que contribueix principalment a l'envelliment de la pell [3].

De fet, l'estrès oxidatiu causa tant danys en l'ADN com oxidació de lípids i proteïnes juntament amb l'activació de la via MAPK (AKT, JNK, ERK i p38) [4]. Això, al seu torn, promou l'expressió de citocines proinflamatòries, factors de creixement i molècules adhesives mitjançant l'estimulació dels factors de transcripció AP-1 i NF-κB. A més, l'activació de la via MAPK provoca alteracions de la matriu dèrmica reduint els nivells de col·lagen. Accelera la degradació del col·lagen modulant l'expressió de les metaloproteinases de la matriu (MMP) i els seus inhibidors tissulars TIMPs i redueix la síntesi de nou col·lagen, bloquejant la senyalització del receptor TGF-tipus II/Smad. A més d'això, l'estrès oxidatiu altera les condicions de la pell alterant el gradient de calci epidèrmic, essencial per a la integritat i la funció de l'embolcall cornificat, estimulant la funció de les glàndules sebàcies i induint la degeneració dels melanòcits [5].

Paral·lelament, la formació de biomolècules modificades conegudes com a productes finals de glicació avançada (AGEs) promou l'estrès oxidatiu a les cèl·lules i teixits [6]. El desenvolupament d'aquests biomarcadors d'envelliment està induït per diversos factors ambientals com el fum de la cigarreta, els alts nivells de dietes d'hidrats de carboni senzills i refinats, els aliments cuinats a alta temperatura i un estil de vida sedentari; Els AGE són productes estables i irreversibles derivats de la reacció no enzimàtica entre sucres reductors i proteïnes, àcids nucleics o lípids, seguits de reordenacions posteriors [7]. De fet, el punt de partida de la formació d'AGE és la reacció de Maillard en què els grups carbonil dels sucres reductors reaccionen de manera reversible amb els grups amino lliures de proteïnes, àcids nucleics o aminofosfolípids per formar bases de Schiff. Aquestes imines es reorganitzen espontàniament en ketamina més estable, anomenada productes Amadori. Produeixen dicarbonils reactius (com glioxal o metilglioxal) que reaccionen amb grups funcionals de proteïnes lisina i arginina, donant lloc a una gran varietat d'AGEs [8,9]. Es classifiquen en diferents grups en funció de la seva capacitat per emetre fluorescència i formar enllaços creuats.

L'acció de l'AGE està mediada pels receptors per a AGEs (RAGEs), que són proteïnes transmembrana pertanyents a la superfamília de les immunoglobulines de molècules de superfície cel·lular tipus I, expressades en diferents tipus cel·lulars, com ara queratinòcits, fibroblasts i macròfags. La unió AGEs/RAGEs augmenta la producció de ROS principalment per l'activació de les NADPH oxidases (NOXs) i la cadena respiratòria mitocondrial, provocant estrès oxidatiu i tots els efectes conseqüents descrits anteriorment [6,8].

A més, les proteïnes de la matriu extracel·lular (ECM), especialment el col·lagen, són molt sensibles a la glicació. De fet, els nivells de l'estructura AGE pentosidina, derivada del col·lagen, són significativament més alts en subjectes grans que en subjectes joves [10]. La glicació del col·lagen canvia no només les propietats mecàniques del propi col·lagen, que es torna més rígid i més trencadís [11], sinó també les de la matriu extracel·lular, afectant el comportament de les cèl·lules residents (creixement, diferenciació, motilitat, expressió gènica i resposta a citocines) i les interaccions matriu-cèl·lula [12].

En aquest escenari, els ingredients antioxidants tenen una gran demanda en l'àmbit cosmètic per reduir la formació d'AGE i la seva cascada oxidativa relacionada: els extractes derivats de l'espècie Jasminum sambac, de la família de les Oleaceae, són interessants per les seves propietats antioxidants i el seu ús conjunt en folk. medicament per tractar malalties de la pell [13]. No obstant això, els extractes de plantes presenten diversos inconvenients com la mala biosostenibilitat, la contaminació potencial amb pesticides, fertilitzants o patògens i la variabilitat de la seva composició qualitativa i quantitativa, afectada per les estacions i les condicions ambientals. Una alternativa vàlida a les plantes, com a font d'ingredients cosmètics bioactius, la representen els cultius de cèl·lules vegetals que ofereixen diversos avantatges: (i) alta sostenibilitat del procés productiu, ja que no calen terrenys agrícoles; (ii) subministrament continu de productes naturals sense dependència geogràfica, estacional i del cicle reproductiu de les plantes; (iii) cap risc de contaminació per patògens, contaminants ambientals i residus agroquímics; (iv) condicions de cultiu estandarditzades que permetin obtenir taxes més altes i reproductibles de rendiment de biomassa i metabòlits; (v) alta versatilitat, ja que la concentració de compostos es pot optimitzar canviant les condicions de cultiu i (vi) protocols d'extracció més fàcils i que requereixen menys temps, reduint la necessitat de dissolvents agressius [14,15].

Aquí, es va estudiar un extracte hidroetanòlic derivat de cultius de cèl·lules de Jasminum sambac (JasHEx). L'objectiu del nostre estudi és una caracterització química i biològica àmplia de JasHEx, especialment explorant les seves propietats antiglicació i anti-envelliment. En primer lloc, es van utilitzar enfocaments avançats basats en espectromètrica de masses per obtenir una caracterització estructural detallada de l'extracte. A continuació, es van realitzar experiments in vitro i ex vivo per demostrar l'activitat biològica de JasHEx com a antioxidant.

2. Materials i Mètodes

2.1. Cultius de teixits vegetals i preparació d'extractes

El gessamí àrab certificat (Jasminum sambac) es va obtenir d'un viver local ("Ladre di Piante", Pistoia, Regió de Toscana, Itàlia). Les fulles de Jasminum sambac es van remullar en etanol al 70 per cent (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durant 1 min i es van esterilitzar a la superfície amb un 1 per cent (v/v) de lleixiu comercial complementat amb Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durant 8 min, seguit de tres esbandides amb aigua destil·lada estèril. A continuació, les fulles es van tallar en trossos de 0,5–1.0 cm i es van cultivar en medi MS de força completa [16] que contenia un 3% (p/v) de sacarosa, 0 .2 mg/L 2,4D, i 8 g/L fitoagar. Els explants es van subcultivar mensualment en un medi fresc durant tres mesos. Un cop obtingut un callos groc-verd, friable i de creixement ràpid, les cèl·lules vegetals es van transferir al medi MS líquid, complementat amb un 3% (p/v) de sacarosa i 0,2 mg/L 2,4D. La suspensió es va agitar en un agitador giratori a les 110 pm i 27 ◦ C en una habitació de clima fosc. Les cèl·lules de creixement fosc es van augmentar cada setmana des de flascons a petita escala fins a gran escala fins que es van aconseguir cultius de suspensió líquida d'uns 177 g / L. La preparació de l'extracte hidroetanòlic de cultiu cel·lular de Jasminum sambac (JasHEx) es va dur a terme mitjançant l'addició de 2000 ml d'una solució d'etanol/aigua (90/10, v/v) a 500 g de cèl·lules. La mescla es va homogeneïtzar durant 3 min a 1500 rpm i 6 min a 3800 rpm mitjançant un molí de ganivets Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Alemanya). La suspensió obtinguda es va agitar a 400 rpm durant 2 h a 25 ◦ C, evitant l'exposició a la llum. A continuació, la suspensió es va centrifugar a 6300 rpm durant 10 min a 4 ◦C. El sobrenedant es va eliminar, es va filtrar i després es va concentrar al buit en un evaporador rotatiu (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Alemanya) a 25 ◦C. Finalment, el pH es va portar a 7,0 amb NaOH 10 N i després es va liofilitzar fins a obtenir una pols fina.

2.2. Anàlisi UPLC–MS/MS per a la caracterització química JasHEx

Es va aconseguir una extracció bifàsica butanol/aigua. La fracció de butanol es va dessecar i es va descongelar en metanol (10 mg/ml) abans de l'anàlisi UPLC-MS/MS realitzada en un espectròmetre de masses Q-Exactive Classic equipat amb un sistema UPLC UltiMate™ 3000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). ). Totes les proves cromatogràfiques es van dur a terme tal com ja va descriure Ceccacci et al. [17].

2.3. Anàlisis de xarxes socials moleculars de productes naturals globals

Per a la identificació de metabòlits, es va utilitzar la xarxa molecular social de productes naturals globals [18]. Tots aquells senyals MS i MSMS no assignats per GNPS es van examinar amb prudència i assignar-los en conseqüència a la literatura. Els fitxers en brut es van convertir al format mzXML mitjançant el programari MS Converter General User Interface, abans de la cerca de la biblioteca espectral GNPS. Es va dur a terme utilitzant una tolerància a la massa d'ions precursors de 0.025 Da, una tolerància a la massa d'ions fragments de 0,02 Da, pics coincidents mínims de 2 i un llindar de puntuació de 0,7. Els resultats es van confirmar manualment.

El preprocessament de dades el va dur a terme Mzmine (versió 2.53, Softpedia, Bucarest, Romania) [19] i es va realitzar un treball de xarxa molecular basat en funcions (FBMN) [20] tal com va informar Ceccacci et al. [17]. Els fitxers de xarxa obtinguts es van importar a Cytoscape (versió 3.9.1, Institut Nacional de Ciències Mèdiques Generals dels EUA (NIGMS), Bethesda, MD, EUA) [21].

2.4. Anàlisi quantitativa de lignans i triterpens

Els mateixos paràmetres UPLC indicats per als experiments qualitatius es van utilitzar per a l'anàlisi quantitativa dels lignans, mentre que per a la dels triterpens es van millorar per separar dos parells d'isòmers, àcid arjunòlic/asiàtic i àcid oleanòlic/ursòlic. L'anàlisi es va dur a terme en un espectròmetre de masses Q-Exactive Classic tal com es va definir anteriorment. La separació es va dur a terme mitjançant un Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, EUA) EVO C18 300 Å (150 × 2,1 mm, mida de partícula 5 µm). La fase mòbil constava de A (solució aquosa d'acetat d'amoni 5 mM, pH 9.00 ajustat per hidròxid d'amoni) i B (1{{40}}0 per cent d'acetonitril) utilitzant una elució de gradient del 13-28 per cent de B a 0-20 min, 28-65 per cent de B a 20-24 min, 65-75 per cent de B a 24-28 min, 75-95 per cent a 28-28,5 min, 95 per cent a 28,5 min. -32 min, 95-13 per cent a 32-32,1 min i 13 per cent a 32,1-44 min. El cabal era de 0,450 ml/min i el volum d'injecció era de 5 µL. Tant per als lignans com per als triterpens, les dades es van adquirir amb el mètode de massa descrit per Ceccacci et al. [17]. Hem comprat nortachelogenina (#LCA52174) de Biosynth Carbosynth, matairesinol (#80497) i àcid maslínic (#83209) de PhytoLab GmbH & Co.KG, secoisolariciresinol (#60372) i àcid arjunolic (#SMB001-19) de Saint Louis-Aldrich , MI, EUA), àcid asiàtic (#0027), àcid oleanòlic (#0041 S) i àcid ursòlic (#0037 S) de Extrasynthèse (Genay, França). Les corbes de calibratge es van obtenir injectant estàndards a una concentració de 0,05 a 25 µM per als lignans i de 0,1 a 25/250 µM per a triterpens. El límit de detecció (LOD) i el límit de quantificació (LOQ) per als estàndards es van determinar en funció de la relació senyal-soroll (S/N).

2.5. Cultius i explants de cèl·lules de la pell

Els queratinòcits humans immortalitzats (HaCaT), comprats a Addexbio Technologies (San Diego, CA, EUA), es van conservar al medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) que es va complementar amb sèrum boví fetal al 10 per cent. (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) en un 95 per cent d'aire, un 5 per cent de CO2 i una atmosfera humidificada a 37 ◦C. Els fibroblasts dèrmics humans (HDF) es van conservar al medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EUA) complementat amb un 10 per cent de sèrum boví fetal (FBS; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EUA). ) en un 95 per cent d'aire, un 5 per cent de CO2 i una atmosfera humidificada a 37 ◦C. Els explantes de pell, obtinguts a partir de la pell de dones donants sanes (de 31 i 40 anys) al centre de cirurgia Villa Cinzia (Nàpols, Itàlia), es van cultivar en 24-plaques transwell en DMEM/FBS més antibiòtics en condicions d'aire-líquid. a 37 ◦C en un 5% d'aire humidificat de CO2. Tots els donants havien donat el seu consentiment informat per escrit per a l'ús dels teixits de la pell, segons la Declaració d'Hèlsinki.

2.6. Assaig ROS citosòlic en cèl·lules HaCaT estressades amb H2O2-

Per a aquest procés, es van sembrar 1,8 × 104 HaCaT en 96-plaques de pous i es van fer créixer durant 20 h. A continuació, es van tractar les cèl·lules durant 2 h amb diferents concentracions de JasHEx (0,0006 per cent, 0,002 per cent i 0,006 per cent p/v) o amb àcid ascòrbic 500 µM, utilitzat com a control positiu. Després d'això, es van rentar en PBS (solució salina tamponada amb fosfat) i es van incubar a 37 ◦C amb 100 µL/pou d'una solució que contenia: 10 mM d'Hepes, 1,3 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de glucosa i 5 mM de glucosa. µM CM-H2DCFDA (5-(i-6)-clorometil-20,70 -diacetat de diclorodihidrofluoresceïna, Invitrogen). Després de 45 min, es va realitzar un rentat de PBS i es va mesurar la intensitat de fluorescència de base de les cèl·lules a 535 nm (excitació 485 nm), mitjançant l'instrument EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). A continuació, es va induir l'estrès oxidatiu afegint 450 µM H2O2 i es va mesurar la fluorescència de les mostres després de 30 min.

2.7. Assaig d'immunosorbent lligat a enzims (ELISA) per a la detecció d'AGE en cèl·lules de fibroblasts dèrmics humans (HDF) amb estrès de glioxal

Per a aquest pas, es van sembrar 1,5 × 104 HDF en 96-plaques de pous i es van cultivar durant 2 dies. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van fixar durant 1 {{10}} min amb 100 µL de formaldehid al 4% en PBS. Posteriorment, es van tractar amb JasHEx (0, 0006 per cent i 0, 002 per cent p/v) o el control positiu d'1 µM d'aminoguanidina en presència de 0, 5 per cent de glioxal a 50 ◦ C durant 1 setmana. Després de la incubació, es van processar per a un assaig immunosorbent lligat a enzims (ELISA) mitjançant un anticòs específic contra AGE (Abcam ab23722).

2.8. Assaig d'immunohistofluorescència d'explants de pell amb metil-glioxal per a la detecció de fibril·lina-1

Els explants de pell es van derivar de dos pacients, de 31 i 40 anys. A partir de cada biòpsia de pell, es van generar tres cops de puny per a cada tractament que es va produir a la interfície aire-líquid. El primer dia, els punxons es van tractar amb JasHEx (0.002 per cent i 0,006 per cent p/v) o el control positiu (1 mM d'aminoguanidina) i després de 24 h, 500 µM de metil- s'hi va afegir glioxal. Els tractaments es van refrescar cada dos dies durant un total de set dies. Al final del període, els punxons es van processar per a l'anàlisi histològica, es van fixar en un 4% de PFA, es van incubar en un 15% de sacarosa, després en un 30% de sacarosa i es van crioemmagatzemar en un compost OCT (temperatura de tall òptima) a -80 ◦C. . La criosecció de 5 µm es va obtenir amb el criostat CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, EUA). Les diapositives amb crioseccions es van hidratar durant 30 min en PBS i es van col·locar en una solució de "bloqueig" (6 per cent de BSA, 5 per cent de sèrum, 20 mM de MgCl2, 0, 2 per cent de Tween) durant 1 h. Posteriorment, es van incubar amb l'anticòs primari anti-fibril·lina 1 (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). durant 16 h a 4 ◦C. Les diapositives es van rentar amb PBS durant 30 min i després es van incubar amb l'anticòs secundari anti-conill Alexa-Fluor 546 (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) durant 1 h. Els nuclis es van tenyir amb DAPI (40, 6-5 diamidino{-2-fenilindol) 1 g/mL en PBS durant 10 min. Les imatges es van adquirir amb un microscopi de fluorescència i es van analitzar amb el programari ImageJ (versió 1.53a, National Institutes of Health, EUA).

2.9. Assaig AlphaLISA per mesurar el contingut de pèptids C de procollagen tipus I (PIP).

En aquest pas, es van sembrar 8 × 103 HDF en una placa de 96-pou i es van tractar durant 24 h amb JasHEx (0.{0006 per cent, 0,002 per cent, 0,002 per cent, i 0,006 per cent p/v) o amb TGF- (2,5 ng/mL). Després del tractament, les cèl·lules es van processar segons les instruccions del proveïdor del kit de col·lagen alfa LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA)).

2.10. Assaig d'activació de la transcripció basat en luciferasa Nrf2

Aquí, es van sembrar i fer créixer 6 × 103 cèl·lules HaCaT en una placa de 96-pous durant 16 h. Després d'això, es van sotmetre a un assaig d'activació de transcripció basat en la luciferasa Nrf2, mitjançant el kit de reporter ARE BPS Bioscience (San Diego, CA, EUA, núm. 60514). Un vector informador de luciferasa ARE preparat per a la transfecció (que conté un gen de luciferasa de cuca sota el control d'elements sensibles a ARE situats aigües amunt d'un promotor mínim) juntament amb un control intern (un vector de luciferasa de Renilla que expressava constitutivament) es va co-transfectar de manera transitòria a cèl·lules HaCaT mitjançant Reactiu de transfecció d'ADN HP del gen X-TREME (Roche, Basilea, Suïssa, #6366244001). Després de la transducció durant 24 h, les cèl·lules es van tractar durant 2 h amb l'extracte (0,0006 per cent, 0,002 per cent i 0,006 per cent p/v) o el control positiu Resveratrol (50 µM). Després d'això, es van sotmetre a l'assaig de luciferasa amb el sistema d'assaig de luciferasa Dual-Glo (Promega, Roma, Itàlia #E2920). Breument, les cèl·lules es van incubar amb substrat de luciferasa de cuca durant 10 minuts abans de mesurar la luminescència en un lector de plaques 96-pous (Victor Nivo, Waltham, MA, EUA). Es va calcular la proporció de luminescència de Firefly i Renilla per normalitzar i comparar l'activitat transcripcional de Nrf2.

2.11. Anàlisi de l'expressió dels gens SOD-1(NM_000454.5) i OH{-1(NM{_002133.3) en cèl·lules HaCaT

Per a aquest procés, es van cultivar 1,5 × 105 cèl·lules HaCaT per pou en plaques de 6-pous durant 16 h i es van incubar durant 6 h amb l'extracte (0,002 per cent i 0,006 per cent). p/v) o Resveratrol 50 µM com a control positiu. Al final de la incubació, l'ARN total es va extreure mitjançant el kit "GenElute™ Total RNA Purification" (de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, EUA) i es va tractar amb DNasa I (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) a 37 anys. ◦C durant 30 min, per eliminar el contaminant de l'ADN genòmic. Es van retrotranscriure 500 ng d'ARN total mitjançant l'enzim transcriptasa inversa (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Es van realitzar RT-PCR semiquantitatives utilitzant el parell de primers 18S primer/competitor (Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) com a estàndards interns Els productes de PCR es van separar en gel d'agarosa a l'1,5 per cent i es van visualitzar amb l'instrument iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Les seqüències dels primers utilitzats per a l'amplificació van ser les següents: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAGGCAATGTGAG.

2.12. Assaig d'òxid nítric en RAW estimulat per LPS 264.7

La concentració de NO es va determinar en macròfags murins RAW 264,7, sembrats a una concentració d'1,5 × 105 cèl·lules/pou en 96-plaques de pou durant 24 h i pretractats amb l'extracte ({{1 0}}.0006 per cent, 0,002 per cent i 0,006 per cent p/v) o amb 10 µM de TPCK (control positiu) durant 2 h, abans de la incubació amb 2 µg/mL de LPS durant 18 h. La quantitat de NO, convertida en nitrit, es va calcular afegint reactiu de Griess (solució de N-(1-naftil)etilendiamina i àcid sulfanílic, Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) i, després de 30 min, l'absorbància es va mesurar a 540 nm pel lector de plaques multipous (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, EUA)

3. Resultats

3.1. Anàlisi qualitativa i quantitativa de l'extracte hidroetanòlic de cultiu cel·lular de Jasminum sambac (JasHEx)

Es va realitzar una anàlisi UPLC-MS/MS de JasHEx i es van analitzar dades espectromètriques d'alta resolució mitjançant Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), un sistema d'espectrometria de masses basat en web que ajuda a l'anotació de productes naturals (NP) [18] . En particular, es va realitzar una biblioteca espectral GNPS per aconseguir la dereplicació en línia. Les espècies químiques no identificades pel GNPS es van assignar en conseqüència a la literatura. Tal com es mostra a les figures 1 i 2 i a la taula 1, es van identificar més de 50 compostos pertanyents a diverses classes de metabòlits secundaris, principalment polifenols i terpens. De fet, l'extracte de JasHEx conté derivats de l'àcid fenòlic, lignans (secoisolariciresinol, nortrachelogenina i matairesinol) i triterpenoides (àcid arjunòlic, àcid aspártic, àcid maslínic, àcid oleanòlic i àcid ursòlic).

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】