Les cèl·lules intercalades renals són fagocítiques i acidifiquen Escherichia Coli uropatògena interioritzada

edmund.chen@wecistanche.com

Ronyóles cèl·lules intercalades estan implicades en l'homeòstasi àcid-base mitjançant l'expressió vacuolar d'ATPasa. Aquí informem de sis subtipus de cèl·lules intercalades humanes, incloses les cèl·lules intercalades principals híbrides identificades a partir de la transcriptòmica de cèl·lules individuals. La maduració del fagosoma és un procés biològic que augmenta el rang d'anàlisi de la via biològica després de l'exposició a Escherichia coli uropatògena en dos dels subtipus de cèl·lules intercalades. Visualització amb microscòpia confocal en temps real de murírenaltúbuls perfusos amb proteïna fluorescent verda que expressen Escherichia coli o pHrodo Green E. coli BioParticles demostra que les cèl·lules intercalades fagociten activament els bacteris i després acidifiquen els fagolisosomes. A més, les cèl·lules intercalades han augmentat l'expressió d'ATPasa vacuolar després d'una UTI experimental in vivo. En conjunt, les cèl·lules intercalades presenten una resposta transcripcional favorable a lade ronyódefensa, engoleix els bacteris i acidifica els bacteris interioritzats. Les cèl·lules intercalades representen una cèl·lula epitelial amb característiques de fagòcits professionals com els macròfags.

Paraules clau:malaltia renal; teixit renal; cèl·lules renals; ronyó; renal

El túbul col·lector del ronyó és la ubicació terminal per a la regulació àcid-base 1 . El túbul col·lector està format per cèl·lules principals i cèl·lules intercalades (IC). Les cèl·lules principals (PC) medien la reabsorció de sal i aigua i es caracteritzen per l'aquaporina 2 citoplasmàtica (AQP2) 2 . Els CI ajuden a mantenir l'homeòstasi àcid-base i tenen tres subtipus descrits, tipus A (A-IC), tipus B (B-IC) i no A–no B 2,3. Els A-IC segreguen protons mitjançant la H-ATPasa vacuolar apical (V-ATPasa) i regeneren el bicarbonat mitjançant el transportador de clorur/bicarbonat basilar (Cl - /HCO 3 ), intercanvi d'anions 1 (AE1/banda 3/SLC4A1) 1,4. Els B-IC segreguen HCO 3 - mitjançant un transportador apical de Cl - /HCO 3, pendrina (SLC26A4) i expressen la V-ATPasa basolateral 2,3. Els IC de rosegadors no A–non B tenen pendrina apical i V-ATPasa, però no AE1, i s'han identificat al conducte col·lector i al túbul de connexió (CNT) 3 . L'augment de l'evidència admet un paper immune innat per als CI juntament amb la seva funció tradicional de regulació del pH. En primer lloc, la majoria de deu pacients no relacionats amb distalrenalEs va informar que l'acidosi tubular, una condició caracteritzada per una disfunció de la CI, tenia antecedents d'ITU 5 . En segon lloc, l'Escherichia coli uropatògena (UPEC), l'organisme aïllat en el 70 per cent de la pielo-nefritis aguda en els homes i el 80 per cent en les dones, es localitza selectivament al citoplasma de les CI 6,7. En tercer lloc, vam identificar que els CI expressen pèptids antimicrobians (AMP) com la ribonucleasa 7 (RNASE7) 8-11. Aquests AMP tenen activitat directa contra una sèrie de patògens, inclosos els bacteris, a la línia de base i/o en resposta a la infecció 8-11. En quart lloc, nosaltres i altres hem informat de manera independent que els ratolins amb un desenvolupament anormal d'IC ​​han augmentat la susceptibilitat a les infeccions del tracte urinari (ITU) i/o a la pielonefritis 12,13. En cinquè lloc, els CI senten i medien la inflamació 14 . Finalment, hem demostrat l'expressió gènica immune innata en CI murins aïllats 15,16

CISTANCHE MILLORArà LA FUNCIÓ RENAL/RENAL

Entendre com els CI defensen el tracte urinari de la infecció és important perquè les ITU es troben amb freqüència. Més del 50% de les dones pateixen una ITU durant la seva vida, i les ITU representen entre l'1 i el 6% de totes les visites mèdiques 17 . Quan els bacteris ascendeixen a laronyonsresultant en pielonefritis, les complicacions potencials inclouen hipertensió, crònicamalaltia de ronyó, i urosèpsis 18,19 . S'estima que hi ha 250000 casos de pielonefritis anualment als Estats Units 17 . La resistència a múltiples fàrmacs està emergint com un repte crític pel que fa al tractament de les ITU i altres infeccions 20 . Per tant, els mecanismes que utilitzen els CI per defensar-se dels uropatògens ascendents podrien ser dianes terapèutiques que es podrien aprofitar per desenvoluparronyó- Tractament específic de la pielonefritis. Com que la majoria dels estudis de CI inclouen models animals, es necessitarà una millor comprensió dels CI humans per guiar els estudis científics bàsics cap a una millor atenció clínica.

Perquè elronyóés un òrgan complex, els perfils d'ARNm poden ser difícils d'interpretar. Per exemple, la nefrona té una especialització regional amb diferents segments tubulars i subtipus cel·lulars. Elronyóconté cèl·lules inflamatòries endotelials, epitelials, intersticials i reclutades, totes amb diferents funcions biològiques i patrons d'expressió gènica. La seqüenciació d'ARN unicel·lular (scRNA-seq) representa una metodologia que avança ràpidament per identificar i perfilar diferents tipus de cèl·lules a la línia de base o en resposta a factors d'estrès 21 . Aquí, mostrem l'ús de la tecnologia scRNA-seq que l'ésser humàronyóEls IC consisteixen en sis subconjunts diferents que inclouen tres A-IC, un híbrid IC-PC, un IC no A-noB i un B-IC. L'anàlisi de la velocitat de l'ARN va revelar el canvi transcripcional dels PC cap als subconjunts A-IC després de l'exposició a UPEC. L'anàlisi de la via de l'enginy va revelar la maduració del fagosoma com la via biològica clau en un subconjunt A-IC després de l'exposició a UPEC. Dins d'aquesta via, les V-ATPases són els components clau implicats. Hem utilitzat microscòpia intravital per visualitzar l'absorció d'UPEC in vivo per part dels CI i l'acidificació confirmada de la UPEC interioritzada en aquests CI. Finalment, un model d'UTI murí va demostrar un augment de l'expressió d'ARNm de V-ATPasa (Atp6v1b1). Aquest estudi proporcionarà la base per explorar i manipular terapèuticament les cèl·lules epitelials que expressen la V-ATPasa com a fagòcits bacterians.

Resultats

Els CI humans es poden enriquir mitjançant la classificació de cèl·lules activades magnèticament (MACS) amb perles magnètiques recobertes del receptor del factor de creixement de cèl·lules mare/mast (CD117/c-KIT). Humansronyóteixit, principalment dels marges normals deronyóreseccions massives, es va disseccionar en trossos de 2–4-mm i després es va passar la nit al nostre laboratori al mitjà d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) sobre gel per la Cooperative Human Tissue Network [https://www.chtn.org]. Hem avaluat c-KIT com a marcador de superfície cel·lular per classificar els CI humans perquè el c-KIT s'ha utilitzat amb èxit per a aquest propòsit en ratolins 22 . L'expressió de c-KIT es va localitzar als CI humans basant-se en la constatació que el c-KIT i el marcador IC humà V-ATPasa, subunitat B1 (gen ATP6V1B1), van coetiquetar les mateixes cèl·lules de l'ésser humà.ronyósecció (Fig. 1 suplementària) 22,23 . Després de la classificació magnètica que incloïa l'eliminació de CD45 més cèl·lules immunitàries i cèl·lules mortes; l'enriquiment dels presumptes IC positius de c-KIT es va demostrar mitjançant l'expressió d'ARNm d'ATP6V1B1 que va augmentar 8-12- vegades en positius c-KIT en comparació amb les cèl·lules negatives de c-KIT. Tant SLC4A1 com SLC26A4 es van enriquir de manera variable en IC demostrant que l'enriquiment tant A-IC com/o B-IC és possible mitjançant aquesta metodologia (figura suplementària 2). Els antecedents del teixit renal utilitzat en aquest estudi es presenten a la taula suplementària 1.

L'anàlisi de clúster integrada va identificar sis subtipus d'IC.ScRNA-seq es va completar el 1861 dissociatronyócèl·lules que es van enriquir per a IC tal com es descriu anteriorment. Els CI enriquits es van obtenir a partir dels marges normals d'un solronyóresecció massiva. El filtratge de control de qualitat (QC) va passar per 859 cèl·lules exposades a UPEC in vitro durant 1 h i 1002 cèl·lules exposades a solució salina in vitro durant 1 h. L'anàlisi de la funció de Seurat va identificar 12 grups en la preparació de cèl·lules ordenades (Fig. 1a). Els nou marcadors més conservats dins de cada clúster es presenten a les figures suplementàries. 3–14. En general, els subtipus IC van representar 1066 (57 per cent) de les 1861 cel·les. Sis dels clústers representaven subtipus IC. Concretament, hem trobat tres subtipus A-IC, un B-IC, un no A-noB-IC i un subtipus híbrid PC-IC.RonyóLa nomenclatura de cèl·lules epitelials recomanada per Chen i els seus col·legues, es van utilitzar fabricants conservats que anteriorment eren marcadors de tipus cel·lular o marcadors conservats que diferenciaven un dels 12 grups d'altres per assignar un tipus cel·lular a cada clúster (taula suplementària 2). , Fig. 1b, c, Fig. 2) 24–28.

El subtipus A-IC i l'expressió híbrida de proteïnes PC-IC es correlacionen amb els resultats de scRNA-seq. Vam validar les troballes clau de scRNA-seq, sobretot que SLC8A1 (també conegut com a intercanviador de Na més / Ca més 1 (NCX1)) és un marcador per a PC-IC híbrids i que el membre 1A de la família de proteïnes de xoc tèrmic A (Hsp70) (HSPA1A) juntament amb la resposta de creixement primerenca 1 (EGR1) són marcadors que poden diferenciar els subtipus A-IC (Fig. 3). Perquè hem utilitzat els marges normals deronyóreseccions de càncer, vam validar que els nostres SLC8A1, HSPA1A i EGR1ronyóels patrons d'expressió eren coherents amb els que s'observen en la normalitatronyóteixit de l'Atles de proteïnes humanes disponible a http://www.proteinatlas.org (figura suplementària 15) 29

Recollida de perfils de marcadors de subtipus de cèl·lules de conductes demostrats anteriorment en muríronyóles cèl·lules romanen en gran part intactes en humansronyócèl · lules. Com que serà important contextualitzar les troballes futures del model murí a la fisiopatologia humana, vam avaluar l'expressió IC humana dels marcadors de cèl·lules del conducte de recollida de murins identificats anteriorment en estudis scRNA-seq realitzats per Chen et al. 22 i Ransick et al. 30 . A la figura 4 es presenta una gràfica de punts dels resultats. Els marcadors de tipus de cèl·lules del conducte col·lector de murina es conserven majoritàriament a les cèl·lules del conducte col·lector humà.

El subtipus A-IC A augmenta en percentatge relatiu amb 1 h d'exposició a la UPEC. Els percentatges de cèl·lules dins dels clústers eren coherents entre el tipus d'exposició, a excepció del subtipus A-IC A/cluster 0, que va augmentar del 16,2 al 20,1 per cent, i el subtipus A-IC C/cluster 5, que va disminuir del 9,4. al 6,6 per cent, amb exposicions salines vs. UPEC, P =0,03 (taula 1).

Les cèl·lules híbrides PC-IC canvien la seva velocitat d'ARN lluny dels PC i cap als A-IC en resposta a 1 h d'exposició a UPEC. L'abundància relativa dels pre-ARNm no empalmats transcrits recentment versus l'ARNm empalmat madur es pot utilitzar per calcular el canvi en l'abundància de l'ARNm, anomenada velocitat de l'ARNm 31 . Una velocitat positiva de l'ARNm en estudis unicel·lulars indica que els gens s'estan regulant a l'alça, mentre que una velocitat negativa de l'ARNm significa que els gens s'estan regulant a la baixa 31 . La direcció de la velocitat de l'ARN dedueix que una cèl·lula té una trajectòria d'expressió d'ARNm cap a un altre tipus de cèl·lula 31,32. La velocitat de l'ARNm en resposta a l'exposició a UPEC es presenta a la figura 5. És important que els PC-IC híbrids canvien la seva velocitat d'ARN lluny dels PC i cap als IC en resposta a UPEC. A més, els IC mantenen la seva activitat de transcripció, mentre que l'activitat transcripcional es torna mínima en altresronyótipus de cèl·lules.

El perfil immune innat del ronyó demostra alguns canvis primerencs en l'expressió unicel·lular després d'1 h d'exposició a la UPEC.Els patrons d'expressió d'scRNA-seq de gens immunes innats seleccionats després de l'exposició a la UPEC enfront de la solució salina durant 1 h es presenten a les figures suplementàries. 16 i 17. Les troballes clau inclouen una alta expressió de l'AMP adrenomedullina (ADM) en els subtipus A-IC A i B, PC-IC híbrids i B-IC. Els PC no expressen adrenomedullina a la línia de base, però han augmentat significativament l'expressió en resposta a l'exposició a la UPEC. La proteïna que conté SH2-inducible per citocines (CISH) i l'expressió del factor d'autointegració 1 (BANF1) s'indueix significativament en els CI no A–non B després de l'exposició a UPEC. Només es va identificar la interleucina 18 (IL18), la galectina 3 (LGALS3), la beta defensina 1 (DEFB1) i el transductor de senyal CD24 lipocalina 2/lipocalina associada a la gelatinasa de neutròfils (LCN2/NGAL).

en PC-IC híbrids i només hi havia una expressió mínima d'ARNm del receptor 4 de tipus toll. No vam identificar l'expressió de la ribo-nucleasa 7 (RNASE7) a scRNA-seq. Es va avaluar l'expressió d'ARNm de RNASE7 en IC i no IC agrupats magnèticamentronyócèl · lules. L'expressió d'ARNm de RNASE7 es va identificar en IC d'un de cada quatreronyons(Fig. 18 suplementària).

El procés biològic de maduració del fagosoma està associat amb els CI exposats a UPEC durant 1 h.Les deu vies biològiques principals associades a cada clúster es van classificar segons el valor p determinat per l'anàlisi de la ruta d'enginy. Tres cúmuls col·lectors assignats per conductes A-IC subtipus A/cluster 0, A-IC subtipus B/cluster 3 i A-IC subtipus C/cluster 5 tenien processos de via biològic diferencial després de l'exposició a UPEC en comparació amb la solució salina (Fig. .6a–c). La maduració del fagosoma va ser la funció més valorada a les cèl·lules exposades a UPEC i solució salina al subtipus A-IC C/cluster 5, es va passar de la segona a la primera posició en el subtipus A-IC A/cluster 0 i de la quarta a la tercera posició més alta. al subtipus A-IC B/ clúster 3. Cap dels subtipus de cèl·lules del conducte col·lector restants (figura suplementària 19) tenia deu principals vies associades que eren diferents després de l'exposició a la UPEC en comparació amb la solució salina. El perfil d'expressió gènica que va donar lloc a la classificació de maduració del fagosoma per al subtipus A-IC A/clúster 0 es presenta a la taula complementària 3.

L'expressió d'ARNm d'IC ​​Atp6v1b1 augmenta en resposta apielonefritis experimental in vivo.La via de maduració del fagosoma Ingenuity va destacar la V-ATPasa com a implicada en els CI (taula suplementària 3). Per determinar si la V-ATPasa s'activa després de l'exposició a la UPEC, hem utilitzat un model d'UTI murí. Una hora després de la UPEC transuretral versus la inoculació salina, els ratolins "reporter d'IC", que tenen expressió de tdTomato (tdT, una variant de proteïna fluorescent vermella) en IC, van ser sacrificats i els IC es van enriquir a partir de dissociats.cèl·lules renals. Els CI enriquits tenien una expressió d'ARNm d'Atp6v1b1 més alta en ratolins amb inoculació UPEC en comparació amb el control salí (Fig. 6d).

Els IC fagociten UPEC in vivo.Hem desenvolupat una metodologia per perfondre un solronyótúbul amb UPEC en un ratolí viu amb un ratolí intacteronyó.Es van visualitzar agregats UPEC que expressaven proteïna fluorescent verda (GFP) microperfusos en un sol lumen de túbul renal de ratolins "reporters IC" fluint a través dels túbuls, adherint-se selectivament a la superfície luminal i interioritzats per IC (Fig. 7) durant la microscòpia intravital.

Els IC acidifiquen UPEC que contenen fagolisosomes in vivo iin vitro.També hem perfusat túbuls amb biopartícules d'E. coli pHrodo Green que només fluoreixen quan s'acideixen. L'absorció i la fluorescència d'aquestes biopartícules només es va visualitzar durant la microscòpia intravital en CI (Fig. 8). L'anàlisi de segmentació d'Imaris va demostrar que la fluorescència verda va augmentar significativament amb el temps en tdT més IC dins de 2 túbuls perfusos amb pHrodo Green E. coli BioParticles en comparació amb un control tdT més túbul (Fig. 9a, b). Quan es va avaluar la fluorescència sobre una base cel·lular, 12/16 (75 per cent) de cèl·lules tdT més van demostrar un augment de la fluorescència verda al llarg del temps després de la perfusió tubular amb biopartícules d'E. coli pHrodo Green (Fig. 9b). Els resultats de la regressió lineal de cada cèl·lula es presenten a la taula suplementària 4. Les troballes d'imatge intravital in vivo de fagocitosi i acidificació de les biopartícules d'E. coli PHrodo Green per IC es van validar mitjançant un assaig de citometria de flux in vitro. Murícèl·lula renalla suspensió de ratolins "reporters d'IC" en què els CI (CD45 - tdT plus) expressen de manera endògena tdT es van exposar a biopartícules d'E. coli pHrodo Green versus cèl·lules amb medis sols. Les cèl·lules immunes residents CD45 més en suspensió cel·lular es van tancar com a control positiu i les cèl·lules CD45 - tdT - (no IC) es van tancar com a control negatiu. Comparant els mitjans sols amb

L'exposició a biopartícules, la fluorescència verda indicativa de l'adquisició de biopartícules i l'acidificació van augmentar de {{0}},7 a 62,8 per cent de les cèl·lules CD45 plus. Aquesta troballa demostra l'absorció bacteriana esperada per fagòcits professionals com els neutròfils. Curiosament, el 22,2 per cent dels IC tenien captació de biopartícules verdes en comparació amb el 5,6 per cent de les que no són IC (figura suplementària 20), el control dels mitjans va tenir captació en el 0,7 per cent dels IC i el 0 per cent dels que no són IC.

Discussió

Els IC són difícils d'estudiar, sobretot en humans, perquè només en representen el 7%.ronyócèl·lules, consisteixen en una sèrie de subtipus i no conserven el seu fenotip en cultiu 33 . Chen et al. 22 van informar d'anàlisi unicel·lular en muríronyócells i Lake et al. va informar d'una canalització de seqüenciació d'ARN d'un sol nucli en humansronyócel·les 34,35 . Aquests estudis van identificar dos subtipus d'A-IC. Aquí, hem desenvolupat una metodologia per realitzar la seqüenciació unicel·lular en CI humans enriquits viables. Ens hem enriquit per a circuits integrats viables en lloc de seqüenciar-los totsronyócèl·lules per permetre una major atenció a aquest tipus de cèl·lules. Els nostres resultats principals van ser (a) la identificació que els PC-IC híbrids poden canviar la direcció de la seva velocitat d'ARN lluny dels PC i cap als A-IC en resposta a l'exposició a UPEC, (b) existeixen almenys tres subtipus d'A-IC i els seus relatius. les freqüències poden canviar en resposta a l'exposició a la UPEC, (c) la maduració del fagosoma és una via biològica líder en múltiples subtipus A-IC i pot augmentar en importància relativa amb l'exposició a la UPEC, i (d) els IC fagociten i acidifiquen UPEC in vivo durant la imatge en viu. ratolins.

Els CI es diferencien en resposta a l'acidosi invertint la seva polaritat 36,37. S'ha informat que els CI sorgeixen de cèl·lules que expressen AQP2- 38 . El 2017, Chen i els seus col·legues van identificar cèl·lules dobles positives que expressaven Aqp2 juntament amb Slc4a1 o Slc26a4 mitjançant el perfil d'una cèl·lula murina. Aquestes troballes van ser validades per Park i els seus col·legues l'any següent 22,35. El 2019, vam demostrar mitjançant l'immunomarcació de proteïnes i ARNm que existeixen PC-IC híbrids 15 . Concretament, el 9 per cent dels CI murins definits per l'immunomarcatge fluorescent de V-ATPasa B1 també expressaven l'ARNm d'Aqp2 definit per hibridació fluorescent in situ 15 . El present estudi va definir una població humanaronyó- Recull de cèl·lules de conductes que expressen AQP2, ATP6V1G3 i SLC4A1 consistents amb PC-IC híbrids. A les parcel·les tSNE i UMAP, aquestes cèl·lules híbrides es van agrupar més a prop dels ordinadors, però eren diferents dels ordinadors tradicionals basats en l'expressió del marcador IC. L'expressió SLC8A1 era diferent a aquest tipus de cèl·lules. Curiosament, SLC8A1 està molt implicat en la transició epitelial-mesenquimal. Concretament, l'absència de SLC8A1 transforma els fenotips de les cèl·lules epitelials mitjançant la desestabilització mediada per -catenina d'E-cadherina 39 . Aquí, demostrem que els CI es diferencien en resposta a l'exposició a uropatògens. Les cèl·lules híbrides PC-IC canvien la seva velocitat d'ARN, el derivat del temps de l'expressió de l'ARNm, lluny dels PC i cap als A-IC en resposta a UPEC. En ratolins, Ransick et al. 30 va identificar l'expressió Slc8a1 principalment al túbul contornejat distal i cèl·lules que s'assemblen a PC al túbul de connexió. A la nostra microcòpia confocal avaluant imatgesronyóL'expressió SLC8A1, vam trobar cèl·lules aïllades que expressaven SLC8A1 en túbuls positius AQP2- (p. ex., conductes col·lectors o túbuls de connexió). També vam identificar túbuls negatius AQP2-en què la majoria de cèl·lules expressaven SLC8A1, potencialment coherent amb l'expressió Slc8a1 del túbul contornejat distal esmentada anteriorment en ratolins. Alguns subtipus A-IC tenen vies biològiques líders diferencials després de l'exposició a UPEC i el subtipus A-IC A va augmentar en freqüència relativa en resposta a UPEC. Aquestes troballes indiquen que el subtipus A A-IC pot representar una variant immune innata. El paper de SLC8A1 en la diferenciació IC justifica investigació en estudis futurs.

CISTANCHE MILLORARÀ LA INSUFICIÈNCIA RENAL/RENAL

Vam realitzar scRNA-seq en 1861 humansronyócèl·lules de les quals 1066 eren IC. Per contextualitzar els models experimentals murins a la fisiopatologia humana, serà important comparar els CI humans i murins. Chen i els seus col·legues es van enriquir per a circuits integrats murins amb c-KIT i van realitzar scRNA-seq 22. Van classificar 74 cèl·lules com a PC, 87 com a A-IC i 23 cèl·lules com a B-IC 22 . Ransick et al. 30 van realitzar scRNA-seq en 688 IC. No van enriquir els CI, sinó que van dividir elsronyóa l'escorça, la medul·la interna i la medul·la externa per avaluar les diferències zonals 30 . Vam demostrar que l'expressió del marcador del tipus de cèl·lules del conducte de recollida murina semblava conservada en gran mesura a les cèl·lules del conducte de recollida humana. Si els ratolins tenen subtipus A-IC comparables als humans, probablement requerirà una avaluació dirigida d'una sola cèl·lula d'un nombre més gran d'IC ​​murins.

Hem identificat l'expressió IC de scRNA-seq de proteïnes immunitàries innates com la galectina 3 (LGALS3) i la mediadora immune i inflamatòria (LGALS3) i l'ADM que hem informat anteriorment en els IC de rosegadors 15,40-42. Tot i això, algunes proteïnes immunitàries innates clau que es van informar anteriorment en els CI, com la Lipocalina 2 (LCN2/NGAL), la RNASE7 i el receptor 4 de tipus toll (TLR4) tenien una expressió mínima o no es van veure en els CI humans a nivell de cèl·lula única en la nostra anàlisi 6,9 . La manca d'expressió de LCN2/NGAL i TLR4 en IC és coherent amb el que s'ha informat en IC murins pel nostre grup de recerca juntament amb Ransick et al. 30ronyócellexplorer/] 15 . Chen et al. 22 va informar d'alguna expressió d'ARNm de TLR4 i NGAL en IC, però diverses vegades menys que en PC. Vam avaluar els CI humans agrupats per a l'expressió de RNASE7 i els vam identificar en els CI d'1 de cada 4ronyons(Fig. 18 suplementària), que indica que la seva expressió pot ser intermitent en funció de la regió, el punt temporal i les condicions fisiològiques. S'ha demostrat que l'expressió CISH, que s'indueix en ICs no A no B en resposta a UPEC, regula la resposta immune innata a Mycobacterium tuberculosis al pulmó i la melsa 43 . Els IC van fagocitar bacteris durant diversos minuts i les nostres cèl·lules per a scRNA-seq van ser exposades a UPEC durant un temps relativament curt d'1 hora. Es necessiten estudis futurs per determinar si altres vies d'IC, com l'expressió d'AMP o la regulació de la mort cel·lular, esdevenen més destacades en punts de temps posteriors després de l'exposició a la UPEC.

Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 μm per l'embolcall de la membrana plasmàtica 44 . Els "fagòcits professionals", les cèl·lules immunitàries derivades de mieloides, inclosos els macròfags, els neutròfils i els osteoclasts, diferencien els microbis invasors de la microbiota i les cèl·lules sanes, engloben l'objectiu en un fagosoma, generen espècies reactives d'oxigen (ROS), secreten AMP i presenten antígens a altres cèl·lules 45–49. És important que l'acidificació robusta per V-ATPasa dels fagolisosomes creant un microambient àcid suficient per matar la majoria de microbis és un segell característic dels fagòcits professionals 48,50. Per exemple, la inhibició de la V-ATPasa amb bafilomicina A1 suprimeix l'activitat bactericida dels macròfags 51 . Algunes cèl·lules epitelials fagociten microbis, però són menys eficients per matar bacteris que els fagòcits professionals i s'han descrit com a fagòcits no professionals 52 . Els IC representen un llinatge epitelial que té capacitats de fagocitosi i presentació d'antigen (Figs. 6-9) juntament amb una expressió robusta d'AMP i mitocondris generosos per generar ROS; per tant, els IC semblen tenir un potencial de matança bacteriana més comparable amb els macròfags que els fagòcits no professionals esmentats 8,53–55. Anteriorment, s'ha demostrat que els A-IC són capaços d'augmentar les taxes d'endocitosi apical del dextran a les vesícules citoplasmàtiques 56 . Especulem que la fagocitosi IC de la UPEC és una extensió de les característiques compartides amb els macròfags, inclosa l'expressió V-ATPasa, el potencial redox, la secreció d'AMP i les capacitats d'endocitosi 8,16,49,57,58. Queda per determinar si els IC poden fagocitar restes cel·lulars i bacteris diferents de la UPEC d'una manera similar als fagòcits professionals.

Imatge confocal d'un solronyóEl túbul perfusat in vivo amb bacteris s'expandeix en tècniques anteriors in vitro com el cultiu cel·lular i la perfusió de túbuls dissecats. Aquí, vam desenvolupar una metodologia per provar directament en ratolins vius si la fagocitosi és una funció IC. La microscòpia intravital permet un estudi complex dels processos cel·lulars dinàmics dins del murí en funcionamentronyons59 . Les estratègies anteriors per utilitzar la microscòpia intravital han implicat la injecció sistèmica de colorants o marcadors intravitals en ratolins per estudiar l'endocitosi del túbul proximal,ronyódinàmica del flux sanguini, i permeabilitat vascular o glomerular 60 . Quan la microscòpia intravital es combina amb tècniques quirúrgiques sofisticades, es poden estudiar els primers punts de temps dels processos infecciosos difícils d'avaluar 61 . Anteriorment, els bacteris eren microperfusos en túbuls proximals de rata per avaluar el flux sanguini, el reclutament de neutròfils i l'obstrucció urinària 62,63. La gran majoria de les ITU es deuen a patògens ascendents i inicialment es trobarien amb el conducte col·lector 64,65. Per tant, proposem que el conducte col·lector és una regió tubular crítica per avaluar les interaccions hoste-patogen. El nostre sistema de model intravital recrea eficaçment un clàssic

CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL

estudi de perfusió del túbul col·lector únic, però en un ratolí viu amb un ratolí intacteronyó,subministrament de sang, limfàtic i neuronal juntament amb la capacitat retinguda d'interaccionar amb les cèl·lules immunitàries. La fisiopatologia de la pielonefritis té distincions entre homes i dones. Per exemple, en humans, les femelles tenen cinc vegades més probabilitats de desenvolupar pielonefritis aguda, però els ratolins mascles tenen un augment de la gravetat de la pielonefritis mediada per andrògens 66,67. Ransick i els seus col·legues van demostrar diferències diferencials masculines i femenines en les cèl·lules del túbul proximal, especialment en els transportadors d'anions orgànics 30 . Els IC masculins es van avaluar tant en els nostres estudis de seqüenciació unicel·lular com intravitals. A causa del paper dels CI en la defensa bacteriana de laronyói l'equilibri d'electròlits, la diversitat relacionada amb el sexe en les funcions IC, com ara la fagocitosi i l'expressió gènica unicel·lular, seran àrees clau per a futurs estudis. Aquest estudi sí que té limitacions. L'exposició de la UPEC a IC humans al nostre scRNA-seq va ser in vitro a un solronyói pot tenir distincions en comparació amb l'exposició a la UPEC in vivo. A més, les nostres troballes van representar la regió anatòmica de l'ésser humàronyóEls estudis mostrejats i futurs amb diferents ubicacions poden tenir una diversitat regionalitzada, tal com ho demostren Ransick et al. 30 . Els IC comprenien el 57 per cent de les cèl·lules del nostre scRNA-seq, enriquits a partir de la composició d'IC ​​del ~ 7 per cent aronyonsa la línia de base 33. La nostra mostra contenia altres tipus de cèl·lules epitelials i endotelials, però va ser negativa per a CD45 més cèl·lules immunitàries que es van classificar abans de l'enriquiment dels CI (Fig. 1, Fig. 1 suplementària). Amb scRNA-seq, els IC objectiu es podrien identificar i avaluar per separat. Les cèl·lules mare hematopoètiques expressen c-KIT, però probablement no representenronyópoblacions de cèl·lules mieloides residents 68 . No vam identificar altres cèl·lules que expressen c-KIT presents en humans sansronyons, com les cèl·lules estromals/telòcits 69 . S'ha informat anteriorment d'algun bucle aïllat de Henle i la positivitat del túbul proximal c-KITronyóimmunohistoquímica coherent amb els nostres resultats scRNA-seq 70