Malaltia poliquística del ronyó
Mar 25, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Part Ⅱ: organoides renals generats a partir de cèl·lules progenitores eritroides de pacients amb malaltia renal poliquística autosòmica dominant
Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.
Antecedents:RonyóEls organoides s'han obtingut àmpliament a partir de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSCs) disponibles comercialment; tanmateix, ha estat un gran repte produir de manera eficient models d'organoides renals a partir de pacients amb poliquístic autosòmic dominantronyómalaltia (ADPKD) que recapitulen tant l'embriogènesi com els mecanismes de la cistogènesi.
Feu clic a cistanche efectes secundaris i beneficis per al ronyó
Mètodes: progenitors eritroides sanguinis (EP) de dos ADPKD (poliquístics autosòmics dominants).ronyópacients amb malaltia) i un donant sa (HC) es va utilitzar com a control comparatiu per normalitzar els molts passos tècnics per a la reprogramació de PE i per a la generació d'organoides. Els PE van ser reprogramats per un vector episomal en iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes), que es van diferenciar en organoides tubulars renals i després estimulats per la forskolina per induir la formació de quists.
Resultats: les iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes) derivades dels EP van mostrar totes les característiques de la pluripotència i van poder diferenciar-se en les tres capes germinals. Els organoides tubulars 3D es van generar a partir de cèl·lules individuals després de 28 dies a Matrigel. HC i ADPKD (poliquístic autosòmic dominantronyómalaltia) els organoides no van formar quists espontàniament, però després de l'estimulació de la forskolina, es van observar estructures semblants a quists a l'ADPKD (poliquística autosòmica dominant).ronyómalaltia) organoides, però no en els organoides derivats de l'HC.
Conclusió: les conclusions d'aquest estudi ho van demostrarronyóEls organoides es van generar amb èxit a partir de les cèl·lules EP de la sang d'ADPKD (poliquística autosòmica dominantronyómalaltia) pacients i un donant control sa. Aquest enfocament hauria de contribuir com una eina poderosa per a l'embrióronyómodel de desenvolupament, que és capaç de recapitular els mecanismes fisiopatològics molt primerencs implicats en la citogènesi.
FEU CLIC AQUÍ PER PARTICIPARⅠ
Discussió
En el present estudi, vam descriure amb detall un procediment per generar organoides renals a partir de iPSC humanes (cèl·lules mare pluripotents induïdes) obtingudes a partir de cèl·lules progenitores eritroides de la sang de pacients amb ADPKD (malaltia poliquística renal autosòmica dominant). Molts tipus de cèl·lules somàtiques s'han reprogramat amb èxit en iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes), incloses les cèl·lules sanguínies [Z]. Aquí, vam optar per utilitzar els progenitors eritroides sanguinis com a tipus de cèl·lula inicial per diverses raons, com ara la seva integritat genòmica, la memòria epigenètica i la reprogramació eficient [11,17,18]. L'eficiència amb la qual els progenitors eritroides s'havien convertit en iPSC va ser fins a dos ordres de magnitud millor (7 per cent -28 per cent) que l'eficiència dels tipus de cèl·lules sanguínies diferenciades (0.0). 2 per cent -0,60 per cent )o fibroblasts (0,74 per cent )[Z]. Malgrat la baixa abundància d'aquestes cèl·lules a la sang perifèrica, es poden aïllar i expandir fàcilment in vitro per produir un nombre suficient per a la reprogramació. Un dels reptes més importants per establir iPSC adequats és el seu genotip i la seva variabilitat fenotípica [6], però hi ha algunes estratègies tècniques proposades per evitar o reduir aquesta variabilitat. En els presents experiments, hem utilitzat un sistema episòmic no integrador per a la reprogramació que no requereix integració del genoma perquè els gens de reprogramació s'expressin [10], permetent menys immunogenicitat i fent cèl·lules més estables genèticament [19,20]. A més, totes les mostres es van derivar de la mateixa font, cosa que ajuda a minimitzar la variabilitat epigenètica [12] assumint que la diferenciació de la cèl·lula inicial podria influir en l'eficiència dels resultats finals. L'anàlisi dels marcadors de pluripotència i la capacitat de les iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes) per diferenciar-se en les tres capes germinals es van comparar una al costat de l'altra, i també es van comparar amb la línia cel·lular embrionària H9, que es va utilitzar com a control positiu. . Totes aquestes comparacions no van mostrar diferències significatives entre pacients amb ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant), HC i cèl·lules H9.
S'han desenvolupat diversos protocols per induir la diferenciació d'iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes) en organoides renals [13,21]. A partir dels protocols descrits per Cruz et al. [6], vam obtenir estructures amb les característiques dels túbuls proximals, inclosa l'expressió de NHE3 i AOP1. A més, els organoides expressaven NPHS2, cosa que indica la presència de cèl·lules semblants als podòcits.
Per contra, AQP2 no es va expressar en aquests organoides tubulars. Aquesta troballa està d'acord amb estudis anteriors que assenyalen diverses limitacions en el desenvolupament d'estructures derivades del brot uretèric (UB) in vitro, amb el desenvolupament de l'UB que requereix protocols específics, ja que la finestra temporal per a l'addició de l'inductor específic és molt limitada. 6,22,23].
En el procés de generació d'organoides renals a partir de iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes), tota l'embriogènesi renal es recapitula in vitro, implicant inicialment la formació d'esferoides cavitats a partir de cèl·lules individuals [14]. De fet, vam trobar que iPSCss indiferenciades (cèl·lules mare pluripotents induïdes) tant de pacients amb ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) com de control sa formaven estructures esferoides semblants a l'epiblast que eren morfològicament similars. Tot i que en el present estudi no es va realitzar la seqüenciació d'ADN dels gens PKD1 i PKD2, les troballes actuals indiquen que el tipus de mutació portada pels pacients no va tenir cap influència en la morfogènesi típica dels epiblasts. Encara calen més estudis per avaluar més adequadament l'expressió de molècules fonamentals implicades en aquesta fase del desenvolupament embrionari.
Segons el protocol desenvolupat per Freedman et al. [14], vam observar que els esferoides es van diferenciar en organoides tubulars 26 dies després de la inducció de la diferenciació, i el moment era similar tant per als pacients amb ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) com per a HC (Fig ③). No obstant això, hem observat una certa variabilitat pel que fa a l'horari d'expressió i els nivells de marcadors de diferenciació. D'altra banda, la morfologia de les estructures tubulars era similar i comparable entre les mostres dels pacients amb ADPKD i HC. En canvi, utilitzant iPSC (cèl·lules mare pluripotents induïdes) provinents de biòpsies renals de pacients amb ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant), el grup de Cruz et al, va trobar una major variabilitat en la capacitat d'aquestes cèl·lules per formar organoides[6]. a més de l'enorme diversitat de mutacions inherents a aquesta malaltia, aquestes diferències en l'eficiència en l'obtenció d'organoides també es poden explicar pels tipus de cèl·lules heterogenis presents a les mostres de biòpsia, en contrast amb els progenitors eritroides, que constitueixen una població cel·lular més homogènia. En conjunt, aquests resultats indiquen que, malgrat la variabilitat i les diferències en l'eficiència de diferents clons iPSC per formar organoides renals, l'obtenció d'aquests últims a partir de pacients amb ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) pot constituir un model únic per estudiar les múltiples formes de manifestacions fenotípiques. d'aquesta malaltia. A més, és important assenyalar que si hi ha una variabilitat considerable de mutacions a la població afectada per ADPKD, les iPSC específiques del pacient (cèl·lules mare pluripotents induïdes), essent totalment immunocompatibles, es podrien utilitzar per a teràpies regeneratives individuals en el futur. , a més de permetre el desenvolupament d'un model in vitro per comprovar si les manifestacions fenotípiques molt primerenques també són tan diverses com la presentació clínica.
Els organoides no estimulats derivats dels pacients amb HCor ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) no van formar quists espontàniament. La morfologia típica dels quists i l'expressió dels marcadors de cistogènesi no van ser detectables en cap mostra, fins i tot allargant la diferenciació organoide en cultiu fins a completar 35 dies. S'ha demostrat que la proliferació cel·lular sola no produeix quists[24]. A més, es requereix un tercer esdeveniment independent (conegut com a tercer cop) per accelerar la formació i el creixement del quist in vivo [23]. Per contra, la formació de quists induïda per la forskolina es va produir en els organoides de pacients amb ADPKD, però no en els de HC. Cal destacar que, encara que presents, es van observar quists en un percentatge baix a les mostres d'ADPKD fins i tot en presència de forskolina, com també ha observat Freedman et al. [14] en organoides formats a partir del model CRISPR/Cas9 de la malaltia ADPKD. Es poden plantejar algunes hipòtesis per explicar la baixa freqüència de quists que es troben en el model actual. 1) Els organoides cultivats en un medi de suspensió 3D van mostrar una eficiència de cistogènesi molt més alta en comparació amb els organoides adherents [6], cosa que indica que el microambient està directament implicat en la cistogènesi.2) El protocol experimental emprat en el present estudi va formar organoides del túbul proximal, però no porcions distals de la nefrona [23]. Tot i que tots els segments de nefrona poden originar quists, inclosos els túbuls proximals [25], sembla que els derivats dels conductes col·lectors semblen ser més grans i en major nombre que els d'altres segments [26], 3) Finalment, recentment s'ha demostrat que l'origen dels quists. pot estar relacionat amb la presència de múltiples mutacions PKD1 que determinen la gravetat de la malaltia i que la formació de quists als conductes col·lectors es va associar amb la gravetat de la malaltia [27, 28].
En conclusió, les presents troballes van demostrar que és factible generar organoides amb estructures tridimensionals similars a l'arquitectura del progenitor renal mitjançant iPSCs (cèl·lules mare pluripotents induïdes) reprogramades a partir de progenitors eritroides que es van aïllar fàcilment de l'ADPKD (malaltia poliquística renal autosòmica dominant). pacients i que aquests organoides són capaços de formar quists sota l'estimulació de la forskolina. Aquesta metodologia prometedora revela un mètode per augmentar la comprensió dels passos genètics, fenotípics i fisiològics molt primerencs en la formació de quists en l'entorn ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant).
Referències
1. Chebib FT, Torres VE: Malaltia renal poliquística autosòmica dominant: currículum bàsic 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:086653
2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: La mutació somàtica en quists hepàtics individuals admet un model de cistogènesi de dos èxits en la malaltia renal poliquística autosòmica dominant.Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362
3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Les mutacions somàtiques de PKD2 en quists hepàtics i renals individuals donen suport a un model de cistogènesi "de dos cops" en la malaltia renal poliquística autosòmica dominant de tipus 2.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208
4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Un interruptor de desenvolupament crític defineix la cinètica de la formació de quists renals després de la pèrdua de Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720
5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: La lesió renal és un tercer èxit que promou el ràpid desenvolupament de la malaltia renal poliquística de l'adult. Hum Mol Genet, 18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421
6. Creu NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: La cistogènesi organoide revela un paper crític del microambient en la malaltia renal poliquística humana. Nat Mater, 16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916
7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Inducció de cèl·lules mare pluripotents a partir de cultius de fibroblasts. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707
8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al: Policistina ciliar reduïda-2 en cèl·lules mare pluripotents induïdes de pacients amb malaltia renal poliquística amb mutacions PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235
9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Derivation of Transgene-Free Induced Pluripotent Stem Cells from a Single Drop of Blood.Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818
10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human induced pluripotents stem cells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077
11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: L'etapa de diferenciació determina el potencial de les cèl·lules hematopoètiques per a la reprogramació en cèl·lules mare pluripotents induïdes. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214
12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Derivació eficient de cèl·lules iPS humanes mitjançant un plasmidi no integrador de cèl·lules sanguínies amb signatures epigenètiques i d'expressió gènica úniques. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013
13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: organoides renals derivats de cèl·lules mare pluripotents: una tecnologia in vitro semblant a in vivo. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https:/ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081
14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Modelatge de la malaltia renal amb organoides renals mutants CRISPR derivats d'esferoides epiblasts pluripotents humans. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500
15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Criteris unificats per al diagnòstic ecogràfic de l'ADPKD (malaltia poliquística renal autosòmica dominant). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943
16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: Un inhibidor de ROCK permet la supervivència de cèl·lules mare embrionàries humanes dissociades. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971
17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Reprogramació nuclear i pluripotència.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240
18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Un sistema d'alta eficiència per a la generació i l'estudi de cèl·lules mare pluripotents induïdes per humans. Cel/ Cèl·lula mare. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420
