KLRG1 marca subconjunts de cèl·lules T CD4 que infiltran tumors associats amb la progressió del tumor i la resposta d'immunoteràpia

Resum

Els mètodes actuals per al descobriment de biomarcadors i la identificació d'objectius en immuno-oncologia es basen en instantànies estàtiques de la immunitat tumoral. Per caracteritzar a fons la naturalesa temporal de les respostes immunitàries antitumorals, vam desenvolupar un panell de citometria de flux espectral de 34-paràmetres i vam realitzar anàlisis d'alt rendiment en contextos crítics.

Vam aprofitar dos models preclínics diferents que recapitulen la immunoedició del càncer (NPKC1) i la resposta al bloqueig del punt de control immune (ICB) (MC38), respectivament, i vam perfilar múltiples teixits rellevants als punts d'inflexió clau de la vigilància i la fugida i/o la resposta ICB.

Les dianes fan referència a biomolècules importants de les cèl·lules, com ara proteïnes, enzims i receptors. El reconeixement d'objectius és l'ús de mètodes químics i biològics per identificar les propietats i funcions específiques d'aquestes biomolècules per a l'aplicació en el tractament de malalties i el desenvolupament de fàrmacs.

La immunitat fa referència a la capacitat del cos per resistir la invasió de patògens estrangers i el creixement de cèl·lules endògenes anormals. El nucli del sistema immunitari són les cèl·lules i les molècules immunitàries, que tenen connexions i interaccions estretes amb els seus objectius.

En el tractament de la malaltia i el desenvolupament de fàrmacs, la relació entre la identificació d'objectius i la immunitat és molt important. Per exemple, el mecanisme d'acció de molts fàrmacs passa pel reconeixement d'objectius, dirigint-se a proteïnes específiques, enzims, receptors i altres molècules, afectant les seves funcions i regulant la transducció del senyal, per aconseguir efectes terapèutics. Les cèl·lules i les molècules del sistema immunitari també poden ser objectius dels fàrmacs. Per exemple, els fàrmacs anticancerígens aconsegueixen efectes terapèutics afectant la resposta immune de les cèl·lules canceroses i regulant l'apoptosi i la proliferació cel·lular.

Per tant, en el desenvolupament de fàrmacs i el tractament clínic, la consideració exhaustiva de la identificació d'objectius i els factors d'immunitat pot conduir a un desenvolupament de fàrmacs més eficaç i un efecte terapèutic millorat. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la immunitat. Cistanche pot millorar la immunitat. Cistanche és ric en una varietat de substàncies antioxidants, com ara vitamina C, vitamina C, carotenoides, etc. Aquests ingredients poden eliminar els radicals lliures, reduir l'estrès oxidatiu i millorar la immunitat. resistència del sistema.

Feu clic en pols d'extracte de cistanche tubulosa

L'anàlisi de dades impulsada per l'aprenentatge automàtic va revelar un patró d'expressió KLRG1 que identificava de manera única les poblacions de cèl·lules T CD4 efectores intratumorals que s'associen de manera constitutiva amb la càrrega tumoral en els models de tumors i es perden en els tumors que pateixen regressió en resposta a l'ICB. De la mateixa manera, un subconjunt Helios-KLRG1 més de cèl·lules T reguladores que infiltraven el tumor (Tregs) es va associar amb la progressió del tumor des de l'equilibri immune fins a escapar i també es va perdre en els tumors que responien a l'ICB.

Els estudis de validació van confirmar signatures KLRG1 en cèl·lules T CD4 infiltrades en tumors humans associades a la progressió de la malaltia en càncer renal. Aquestes troballes nomenen poblacions de cèl·lules T KLRG1 més CD4 com a subconjunts per a una investigació addicional sobre la immunitat del càncer i demostren la utilitat del perfil de flux espectral longitudinal com a motor de biomarcador dinàmic i/o descobriment d'objectius.

Introducció

La immunoteràpia és ara un pilar del tractament del càncer. Tanmateix, les respostes a la majoria dels agents immunoterapèutics segueixen sent rares, restringides a un nombre limitat de tipus de tumors i difícils de predir (1). Millorar les taxes de resposta i desenvolupar biomarcadors predictius de la resposta són objectius centrals del camp de la immunologia tumoral, però això segueix sent un repte.

Una multitud d'interaccions multicel·lulars complexes poden regir el resultat d'una resposta immune antitumoral en qualsevol pacient determinat. Per tant, és comú que els biomarcadors únics, o la modulació terapèutica de vies singulars, tendeixin a tenir utilitat en alguns pacients amb càncer, però no en la majoria.

Per exemple, hi ha tres biomarcadors relacionats amb el sistema immunitari actualment en ús clínic generalitzat; (i) càrrega mutacional del tumor (TMB), mesurada directament o inferida mitjançant la presència de mutacions discapacitants en la maquinària de reparació de l'ADN (2-4), (ii) expressió de PD-L1 per immunohistoquímica (IHC) (5) i (iii) immunitat preexistent mesurada per la presència de cèl·lules T CD8 dins i dels tumors circumdants, anomenada Immunoscore (6).

Tot i que cadascun s'associa significativament amb la resposta a la immunoteràpia en determinats contextos, la sensibilitat i l'especificitat d'aquests predictors segueixen sent subòptimes(7). Aquests enfocaments unimodals probablement no aconsegueixen capturar completament els complexos mecanismes subjacents a la immunitat antitumoral, inclosa la naturalesa dinàmica d'aquestes respostes que es produeixen a través dels teixits i al llarg del temps.

Com a tal, l'aplicació d'enfocaments de perfil immune unicel·lular altament multiplexat per a la detecció de biomarcadors i el descobriment d'objectius de manera longitudinal i transversal pot proporcionar fenotips immunitaris matisats amb una major utilitat predictiva i translacional.

Amb aquesta finalitat, hem desenvolupat un 34-tauler de citometria de flux espectral de paràmetres i un pipeline d'anàlisi de dades d'alta dimensió per interrogar fenotips immunitaris a nivell de proteïnes associats a diferents fases del cicle d'immunoedició del càncer, inclosa la fugida immune i el creixement del tumor, i el punt de control immune. resposta de bloqueig (ICB) en models preclínics.

Hem perfilat els models MC38 tractats amb NPK-C1 i ICB, analitzant diversos teixits (tumor, ganglis limfàtics drenants versus no drenants i sang) sobre i al voltant dels punts d'inflexió clau en la progressió del tumor. Això va facilitar la caracterització profunda de la dinàmica subjacent a la regressió del tumor natural i induïda per ICB, la transició a l'equilibri immune i la transició posterior de l'equilibri a la fugida del tumor incontrolada. Els estudis de validació en conjunts de dades unicel·lulars humans de càncer renal van confirmar la rellevància translacional d'aquestes troballes.

Materials i mètodes

Els ratolins. Els ratolins C57BL/6J mascles i femelles (5-6 setmanes d'edat) es van comprar al Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Els ratolins tenien 6-8 setmanes en el moment d'utilitzar-los. Tots els animals van ser allotjats d'acord estricte amb les normes del NIH i de l'Associació Americana de Cura dels Animals de Laboratori. Tots els experiments i procediments per a aquest estudi van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals (IACUC) del Centre Mèdic de la Universitat de Columbia.

Línies cel·lulars. La línia cel·lular NPK-C1 (originalment LM7304) va ser proporcionada pel Dr. Cory AbateShen de la Universitat de Columbia. Vegeu les referències anteriors per a més detalls (8,9). Les cèl·lules NPK-C1 es van mantenir a R10, que consistia en un medi RPMI (Corning; Corning, NY) complementat amb un 10 per cent de FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL de penicil·lina i 100 mg/mL d'estreptomicina (Gibco; Gaithersburg, MD). Les cèl·lules de carcinoma de còlon MC38 es van comprar a Kerafast i es van cultivar a D10 que consta de DMEM (Corning; Corning, NY) complementat amb un 10 per cent de FBS, 100 U/mL de penicil·lina i 100 mg/mL d'estreptomicina (Gibco; Gaithersburg, MD).

Repte del tumor i injeccions de teràpia. Les cèl·lules NPK-C1 a un 70-90 per cent de confluència o cèl·lules MC38 a un 50-75 per cent de confluència es van recollir amb 0.05 per cent de tripsina (Gibco, Gaithersburg, MD), rentada amb PBS, comptat i resuspès a 10 x 106 cèl·lules/ml en PBS fred amb gel. El dia 0, es van implantar ratolins de 6-8 setmanes al flanc dret amb 1x106 cèl·lules NPK-C1 o MC38. Les mesures del tumor es van registrar en les dimensions X, Y i Z (diàmetre més gran, diàmetre més petit i alçada més gran, respectivament) cada 2-3 dies mitjançant un calibre digital i es va calcular el volum del tumor multiplicant X * Y * Z. L'anticòs isotip anti-PD-1 (RMP{1- 14 IgG2a,κ) o Rat IgG2a (Bio X Cell; Lebanon, NH) es va diluir en PBS estèril i es va administrar per injecció intraperitoneal (IP) a 200 ug/ ml per ratolí els dies 3, 6, 9 i 12 després de les implantacions MC38.

Recollida de teixits. Després de l'eutanàsia del ratolí, es va aïllar ~ 200 ul de sang mitjançant punció cardíaca mitjançant una agulla de xeringa recoberta d'heparina al 0,2% (StemCell Technologies; Vancouver, BC) i es va col·locar sobre gel en tubs que contenien 10 ul 0,5M EDTA (Corning; Corning, NY). Els ganglis limfàtics inguinals drenants i no drenants del tumor es van disseccionar i es van col·locar en 48-plaques de pou que contenien 150 ul de medi R10 sobre gel.

Els tumors es van recol·lectar, es van amassar i es van tallar fins a 50 mg de tumors i es van col·locar en un medi X-Vivo 15 (Lonza; Basilea, Suïssa) en tubs Eppendorf de 5 ml sobre gel. Es van afegir DNasa (40 ul de solució de 20 mg/mL; Roche; Basilea, Suïssa) i col·lagenasa D (125 ul de solució de 40 mg/mL; Roche; Basilea, Suïssa) a les mostres de tumor abans de la incubació en un agitador a 37o C per 30 minuts. Les reaccions de digestió es van apagar mitjançant vòrtex (30 segons) i afegint 5 ml de medi R10. Els digerits del tumor es van filtrar a través de filtres de 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) i es van granular. Les mostres de sang es van lisar RBC amb dues incubacions successives de 2-minuts en tampó ACK de 2 ml (Quality Biological; Gaithersburg, MD) i es van apagar a R10 abans de la granulació. Els ganglis limfàtics es van desagregar físicament amb un pistó de xeringa d'1 ml a la placa del pou 48-, i després les suspensions es van filtrar a través de filtres 40-um. Totes les mostres es van col·locar en plaques 96-de fons en U per a la tinció.

Citometria de flux. Les mostres es van rentar amb PBS. Les cèl·lules mortes es van tacar mitjançant la resuspensió en 100 ul de PBS més colorant blau fixable Live/Dead (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Aquest i tots els passos de tinció o fixació posteriors es van realitzar durant 30 minuts a temperatura ambient en un agitador de plaques, protegit de la llum. Les mostres es van rentar 2 vegades amb PBS, després es van tornar a suspendre en FACS (PBS més 3 per cent de FBS més 1 mM EDTA més 10 mM HEPES) complementat amb TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) i TruStain Monocyte Blocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) i col·locat sobre gel.

Els anticossos de superfície es van preparar a dilucions òptimes (vegeu la taula complementària S1) en FACS complementat amb tampó Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), i després es van afegir a les mostres en una solució de bloqueig. Després de la tinció, les mostres es van rentar 2 vegades amb tampó FACS i es van fixar en 100 ul de tampó FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit (eBioscience; San Diego, CA). Les mostres es van rentar dues vegades amb tampó de permeabilització 1X (1X PW) i després es van tacar amb 1X PW més anticossos intracel·lulars. Les mostres es van rentar dues vegades en 1X PW i després es van fixar en 100 ul de tampó FluoroFix (BioLegend: San Diego, CA), es van rentar dues vegades amb FACS, després es van tornar a suspendre en 200 ul FACS i es van segellar a les plaques de 96 pous per a l'adquisició l'endemà. Cytek Aurora 5-citòmetre làser.

Es van utilitzar mostres d'esplenòcits tenyides simultàniament per a controls de taca única. Anàlisi i estadística. Els experiments de perfils longitudinals es van realitzar una vegada cadascun per als models MC38 i NPK-C1. Es van avaluar un total de n=10-25 ratolins per punt de temps. Les dades de citometria de flux es van analitzar a FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ) i es van descarregar els algorismes de complements d'alta dimensió UMAP i FlowSOM de FlowJo Exchange. Es van concatenar fins a 30.000 CD45 vius més cèl·lules infiltrades en tumors i fins a 15.000 CD45 vius més cèl·lules derivades de sang o LN per mostra per a una anàlisi d'alta dimensió.

Tota la reducció de la dimensionalitat i la agrupació es van realitzar a FlowJo. Les anàlisis estadístiques es van realitzar a GraphPad Prism v9.3.1. Es va utilitzar la correlació de Pearson per generar coeficients de correlació i es van utilitzar proves T de Student no aparellades amb la correcció de Welch per comparar les freqüències de clúster entre grups. Els mètodes analítics unicel·lulars es descriuen prèviament (10,11).

El regulon KLRG1 es va extreure del regulon metaVIPER KLRG1 de consens d'Obradovic, et al (11). Per calcular la signatura de regulons KLRG1, encaixem un model de regressió forestal aleatòria amb gens de regulons com a característiques i KLRG1 com a objectiu, després vam calcular les puntuacions d'importància de Gini dels gens de regulons per determinar el seu impacte en l'expressió de KLRG1. La puntuació de regulons KLRG1 de cada cèl·lula es va donar per la suma ponderada de les mesures d'expressió de tots els gens de regulons de la cèl·lula amb puntuacions d'importància com a pesos.

For more information:1950477648nn@gmail.com