- L'àcid lipoic augmenta la síntesi i la deposició de col·lagen en ronyons de rates no diabètics i diabètics

Nevena Grdović et al

-L'àcid lipoic (ALA) s'utilitza àmpliament com a suplement nutricional i agent terapèutic en el tractament de la diabetis. Els efectes antioxidants i hipoglucèmics ben establerts de l'ALA es van considerar especialment importants per combatre les complicacions de la diabetis, com ararenallesió. El present estudi va avaluar el potencial de l'ALA per afectar els esdeveniments profibròticsronyóque podria alterar la seva estructura i funcionament. Es va administrar ALA per via intraperitoneal (10 mg/kg) a rates Wistar mascles diabètics no diabètics i induïdes per estreptozotocina durant 4 i 8 setmanes. Els efectes de l'ALA es van avaluar a partir d'alteracions estructurals/morfològiques passant per canvis que caracteritzen els processos profibròtics, fins a la regulació de l'expressió gènica del col·lagen en elronyó. Aquí, vam demostrar que l'ALA va millorar el nivell sistèmic de glucosa i urea, va reduir la formaciórenalproductes finals de glicació avançada (AGE) i mantenir la integritat estructural renal en rates diabètics. Tanmateix, els esdeveniments profibròtics provocats en la diabetis no es van alleujar per l'ALA, ja que la síntesi/deposició de col·lagen i l'expressió del factor de creixement transformant- 1 (TGF{- 1) i l'actina del múscul llis (-SMA) es van mantenir elevades en ALA- rates diabétiques tractades, especialment després de 8 setmanes d'inici de diabetis. A més, 8 setmanes de tractament de rates no diabètics amb ALA van provocar el desenvolupament de característiques profibròtiques reflectides en l'augment de la síntesi/deposició de col·lagen. A més de la senyalització aigües avall de TGF- 1, el mecanisme addicional subjacent a la regulació del col·lagen IV en rates no diabètics tractades amb ALA implica una disminució de la metilació de l'ADN del seu promotor que podria derivar-se de l'augment de l'expressió de Tet1. Aquestes troballes emfatitzen la precaució terapèutica en l'ús d'ALA, especialment en pacients ambrenaldiabèticcomplicacions.

Per a més informació: ali.ma@wecistanche.com

Feu clic a Cistanche extracte en pols per a malalties renals

1. Introducció

DiabèticronyóLa malaltia (DKD) o nefropatia diabètica és una de les complicacions microvasculars amb una incidència del 20-40 per cent entre els pacients diabètics que s'acompanya d'alteracions estructurals progressives i pèrdua de les funcions renals [1]. El mecanisme fisiopatològic subjacent a la DKD és complex i comença amb una hiperglucèmia crònica que, al seu torn, desencadena estrès oxidatiu, formació de productes finals de glicació avançada (AGE), activació de vies de senyalització MAPK/PKC i la posterior expressió de diversos mediadors proinflamatoris i profibròtics [2, 3]. La diafonia entre aquests esdeveniments dóna lloc a l'acumulació de proteïnes de la matriu extracel·lular (ECM) al mesangi i al tubulointerstici amb un patró histopatològic clàssic derenalfibrosi. Comença amb canvis estructurals com l'engrossiment de la membrana basal i l'expansió mesangial, progressant gradualment cap a la glomeruloesclerosi i la fibrosi intersticial que finalment culmina ambrenalfracàs[4, 5].

La senyalització aigües avall del factor de creixement transformador- 1 (TGF{- 1) és una part del procés de cicatrització de ferides que, després d'una inflamació sostinguda, hiperglucèmia o estrès oxidatiu que caracteritzen la diabetis, es converteix en fibrosi fisiopatològica [6] . El TGF- 1 és un mediador central de la patogènesi de la DKD, sent el principal regulador de l'expressió de proteïnes ECM en pacients amb diabetis, probablement com a resultat de l'hiperglucèmia i l'entorn oxidatiu alterat [7–10]. El TGF- 1 indueix l'acumulació d'ECM mitjançant l'estimulació del col·lagen tipus I i IV, l'actina del múscul llis (-SMA), la síntesi de laminina i fibronectina, així com per la inhibició dels enzims que degraden l'ECM [11].

El col·lagen tipus IV és el constituent més abundant de la membrana basal [12], expressat a les membranes basals glomerulars i tubulars en condicions fisiològiques [13]. Tanmateix, la nefropatia diabètica s'acompanya d'una expressió aberrant de col·lagen tipus IV que inclou una producció excessiva i una distribució irregular a través de l'interstici i el mesangi [14–16]. Entre les sis isoformes de col·lagen tipus IV (1- 6), 1(IV) i 2(IV) estan presents universalment a totes les membranes basals. Les cadenes de col·lagen 1(IV) i 2(IV) estan codificades pels gens Col4a1 i Col4a2, la regulació transcripcional dels quals es remet en interaccions cis-trans ben descrites [17], però les troballes recents posen de manifest el paper important dels mecanismes epigenètics, inclosa la metilació de l'ADN, en la regulació de la seva expressió [18–20].

A la vista dels mecanismes fisiopatològics que hi ha darrere de la DKD, les estratègies de tractament són senzilles i tenen com a objectiu la hiperglucèmia i l'estrès oxidatiu. Es troba que el potencial hipoglucèmic i antioxidant de l'ALA, que és un dels antioxidants àmpliament utilitzats, millorarenalcanvis patològics associats a la nefropatia diabètica [21–23]. No obstant això, relacionats amb l'envelliment de la pell, es van informar dels efectes beneficiosos de l'ALA mitjançant l'augment de la síntesi de col·lagen tipus I en els fibroblasts dèrmics humans [24]. Tenint en compte la fisiopatologia de la DKD, un efecte similar de l'ALA podria ser perjudicial per als pacients diabètics ambrenalcomplicacions. Amb aquests antecedents, el present estudi es va centrar a avaluar els efectes de l'ALA sobre les característiques estructurals/morfològiques renals i els processos profibròtics amb èmfasi en l'expressió del gen de col·lagen tipus IV en rates diabètics i no diabètics.

2. Material i Mètodes

2.1.Animals, tractaments i configuració experimental.Tots els experiments es van realitzar amb rates albines Wistar mascles de 2.5-mesos d'edat amb un pes entre 220 i 250 g. Tots els procediments per a animals aprovats pel Comitè Ètic per a l'Ús d'Animals de Laboratori de l'Institut d'Investigació Biològica "Siniša Stan-ković" de la Universitat de Belgrad complien la Directiva 2010/63/UE sobre la protecció dels animals utilitzats per a experiments i altres finalitats científiques. Els animals d'aquest estudi van ser sacrificats mitjançant un mètode físic d'eutanàsia utilitzant una guillotina, d'acord amb totes les recomanacions de les directrius per a l'eutanàsia d'animals. La mort es produeix a l'instant i els animals no van patir. L'eutanàsia es va realitzar a la sala d'operacions, separada de la sala d'habitatge, un animal per un (la resta d'animals de l'experiment es van mantenir a la sala d'experimentació que està separada de la sala d'operacions on es va realitzar l'eutanàsia per evitar l'estrès de l'altre). animals). L'eutanàsia va ser realitzada per material ben format i experimentat. L'equip utilitzat per a la decapitació estava en bon estat de funcionament (els serveis són periòdics per proporcionar l'afilat de les fulles).

La diabetis va ser induïda per múltiples injeccions de dosis baixes (40 mg/kg) d'estreptozoticina (STZ) (MP Biomedicals) durant cinc dies consecutius; Les rates control es van injectar només amb el vehicle (tampó de citrat de sodi 0, 1 M, pH 4, 5). El nivell de glucosa en sang es va mesurar 24 hores després de l'última injecció de STZ amb un glucòmetre Accu-Chek Active i els animals es van considerar diabètics quan el nivell de glucosa en sang en dejú superava els 20 mmol/l. Les rates es van dividir aleatòriament en quatre grups experimentals: control (control, n=8), control tractat amb ALA (ALA, n=8), diabètics (STZ, n=10) i grup diabètic tractat amb ALA (STZ/ALA, n=10). ALA (Ivančić i sinovial, Belgrad, Sèrbia) es va injectar per via intraperitoneal (10 mg/kg) cada dia durant 4 i 8 setmanes, a partir de l'última injecció de STZ. Després del sacrifici i la recollida de sang, es va fer una incisió abdominal i totes duesronyonsvan ser eliminats. Unronyóes va congelar en nitrogen líquid, es va mantenir a -80 graus i es va utilitzar per aïllar proteïnes, ADN i ARN, mentre que l'altre es va fixar en formalina tamponada al 10% per a exàmens histològics.

2.2.Anàlisi Bioquímica.Les rates han dejunat durant la nit abans del sacrifici. El sèrum sanguini es va recollir després de la coagulació de la sang i la centrifugació a 2,000 g durant 10 min. El sèrum es va utilitzar per a la determinació de concentracions de glucosa amb un kit comercial (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), nivell de triglicèrids sèrics pel mètode GPO-PAP mitjançant un kit enzimàtic (Randox Laboratories, Regne Unit), nivell d'urea mitjançant Urea Assay. Kit (Abcam, EUA) i concentracions de creatinina mitjançant l'assaig de creatinina de Cayman segons les instruccions del fabricant.

2.3.Anàlisi histològica i immunotinció.Formalina- fixatronyóels teixits es van deshidratar en una sèrie decreixent de xilol i alcohols per a la inclusió posterior en blocs de parafina. Els blocs de teixit es van seccionar a 5 μm en un micròtom rotatiu (RM 2125RT; Leica Microsystem). Per tal d'observar els canvis en la morfologia renal, es van tenyir seccions de teixit mitjançant el mètode d'àcid periòdic-Schiff (PAS). A més, es van analitzar les seccions tenyides mitjançant un microscopi Olympus (BX-51) equipat amb un microactuador, un escenari motoritzat i una càmera, controlats pel paquet de programari estereològic Visiopharm Integrator System nouCAST. Les àrees de llum tubular es van obtenir amb un augment objectiu de 40x i es van expressar com a percentatge (per cent) per àrea examinada. La fracció de la matriu mesangial es va avaluar com a àrea de tinció positiva de PAS, expressada com a percentatge per àrea glomerular total (ampliació objectiva 100x).

Per a la detecció de fibra de col·lagen, es van tacar seccions de teixit amb una taca de tricrom de Masson. Després de la tinció, es van observar seccions amb un microscopi de llum (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanya, equipat amb càmera Leica DFC 320 CCD; augment de l'objectiu 40x). L'anàlisi d'imatges es va fer mitjançant el programari ImageJ (versió 1.52p, National Institutes of Health). Les imatges es van convertir en piles RGB i es va aplicar un llindar manual per avaluar la proporció d'àrea de col·lagen per àrea de teixit.

L'anàlisi immunohistoquímica es va realitzar tal com es descriu a [25] utilitzant anticossos policlonals generats contra N(?)-(carboximetil)lisina (CML) (dilució 1: 50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) i anticossos secundaris peroxidasa de rave picant (1: 100) (Biotecnologia de Santa Cruz). Les seccions de teixit es van tenyir amb 3,3'-diaminobenzidina (DAB), es van tacar amb hematoxilina i es van muntar i es van observar al microscopi lleuger (fotomicroscopi Leica DM RB; augment objectiu 40x). L'anàlisi d'imatges es va fer mitjançant el programari ImageJ (versió 1.52p, National Institutes of Health). Les imatges es van processar mitjançant la deconvolució del color amb l'opció de vector H DAB. La senyalització CML es va calcular com la intensitat grisa mitjana de la tinció de DAB normalitzada al nombre de nuclis (obtinguda mitjançant l'opció Analitzar partícules).

2.4.Anàlisi Western Blot.25 ug deronyóEls homogeneïtats es van separar per SDS-PAGE, es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè i es van sondar amb anticossos policlonals contra GAPDH (FL-335) i anticossos monoclonals contra TGF{- 1 de rata (3C11) i SMA (CGA7) tots de Santa Cruz Biotechnology i tot diluït en proporcions 1:1,000. La detecció es va realitzar mitjançant un sistema de detecció de quimioluminescència millorat (Santa Cruz Biotechnology). La quantificació de les bandes immunoreactives es va realitzar mitjançant el programari d'electroforesi TotalLab (Phoretix) (versió 1.10) i es va normalitzar al GAPDH utilitzat com a control de càrrega.

2.5.PCR quantitativa en temps real (RT-qPCR).Es va aïllar l'ARN totalronyonsutilitzant el RNeasy Mini Kit (Qiagen). Per a la síntesi d'ADNc, 1 ug de l'ARN total es va tractar amb DNasa I i es va transcriure inversament amb el kit de síntesi d'ADNc RevertAid First- Strand (Fermentas, Burlington, Canadà) mitjançant una barreja d'hexàmers aleatoris i oligo (dT). Els nivells d'ARNm es van quantificar mitjançant 2x Maxima SYBR Green/- ROX qPCR Master Mix (Fermentas) en un sistema de PCR en temps real QuantStudio 3 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) es va utilitzar per dissenyar els primers (que figuren a la taula complementària S1) per a l'avaluació de Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b i Expressions del gen Tet1. Els cicles tèrmics van consistir en una desnaturalització inicial a 95 graus/10 min i 40 cicles de PCR en dos passos a 95 graus/15 s i 60 graus/60 s. Els nivells d'expressió d'ARNm dels gens d'interès es van normalitzar al nivell d'expressió d'ARNm de l'Actb com a gen de referència mitjançant el mètode 2-dCT.

2.6.Aïllament de l'ADN genòmic i conversió de bisulfits de l'ADN.L'ADN genòmic es va aïllar mitjançant l'enfocament Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) [26], segons el protocol d'extracció d'ADN del teixit de mamífers (disponible en línia a https://bomb.bio/protocols/). L'ADN genòmic es va sotmetre al protocol de conversió de bisulfit BOMB (disponible en línia a https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7.Mesura dels nivells globals de metilació de l'ADN.Els nivells globals de metilació de l'ADN es van mesurar mitjançant el kit 5-mC DNA ELISA (Zymo Research, Califòrnia, EUA) segons les instruccions del fabricant. ADN genòmic purificat (100 ng) aïllat deronyonses va utilitzar de tots els grups experimentals i es va analitzar cada mostra per duplicat. La significació estadística es va estimar mitjançant ANOVA unidireccional amb bloqueig, tractant cada placa ELISA com un bloc.

2.8.PCR específica de metilació (MSP).Els parells de primers per a l'anàlisi MSP, dissenyats a la regió promotora de Col4a1 que inclou el lloc d'inici de la transcripció (TSS), es van dissenyar mitjançant MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (Taula suplementària S2 ). Les posicions dels cebadors (respecte al TSS per a Col4a1, marcades com a més 1) utilitzades per a l'anàlisi de MSP són les següents: M fw (-35, -14), M rev (més 44, més 64), U fw (-35, -14) i U rev ( més 45, més 69). Com que cada imprimació cobreix 2 CpG, es van provar 4 CpG en total per determinar l'estat de metilació per parell d'imprimadors. La barreja de reacció per a MSP contenia Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng d'ADN convertit en bisulfit i 0,5 μM de cada cebador específic per a ADN metilat (M) i no metilat (U) a un volum final de 10 μl. MSP es va realitzar amb el sistema QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems). Les condicions de ciclisme de PCR van ser les següents: passos inicials de desnaturalització a 95 graus/10 min i seguits de 40 cicles de desnaturalització a 95 graus/15 s, i recuit i allargament a 58 graus/60 s. El nivell relatiu d'ADN metilat es va expressar mitjançant l'índex de metilació definit com a 2 (cicle desmetilat Ct) - (cicle metilat Ct) [27].

2.9.Anàlisi estadística.Les dades es van expressar com a mitjana ± SD (desviació estàndard) per a tots els paràmetres estudiats. La prova t de l'estudiant es va utilitzar per comparar mitjanes de variables distribuïdes normalment entre dos grups. Les diferències estadístiques entre grups es van analitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA), seguida de la prova de comparació múltiple de Tukey mitjançant GraphPad Prism Software, ver. 5.00 (Programari GraphPad, San Diego, CA, EUA).

3. Resultats

3.1.Efecte de l'ALA sobre els índexs bioquímics en rates diabètics.La glucosa, els triglicèrids, la urea i la creatinina es van determinar en sèrum de control, diabètics i rates diabètics i no diabètics tractats amb ALA (figura 1). La condició diabètica es va seguir 4 setmanes i 8 setmanes, per tal d'incloure el curs temporal necessari perquè es manifestin processos perjudicials. Els dos grups de rates diabètiques es van caracteritzar per hiperglucèmia, tendències creixents de triglicèrids i nivell de creatinina, però sense significació estadística, i per nivells d'urea significativament augmentats. En rates diabétiques, 4 setmanes de tractament amb ALA van donar lloc a una disminució del nivell de glucosa sèrica fins al valor de control, mentre que després de 8 setmanes el nivell de glucosa va disminuir, però encara es va mantenir significativament elevat en comparació amb els controls. En els dos grups diabètics tractats amb ALA, els triglicèrids i la creatinina no es van modificar significativament. El tractament amb ALA va disminuir significativament el nivell d'urea de rates diabètiques després de 4 setmanes, mentre que després de 8 setmanes el nivell d'urea sèric de rates diabétiques va disminuir en comparació amb els controls diabètics, però sense significació estadística. L'administració d'ALA per controlar rates no va afectar significativament els paràmetres bioquímics examinats.

3.2.Avaluació morfològica de l'estructura renal i la formació de LMC després del tractament amb ALA.La tinció de PAS va destacar les característiques histopatològiques renals associades a la diabetis (figura 2 (a)). L'engrossiment de la membrana basal glomerular va aparèixer després de 4 setmanes d'inici de diabetis, mentre que es va observar l'expansió de la matriu mesangial i els túbuls amb la llum eixamplada després de 8 setmanes d'inici de la diabetis. L'anàlisi histològica va revelar que les àrees del lumen tubular, glomerular i matriu mesangial van augmentar significativament en rates diabètics de 8 setmanes en comparació amb les rates control i tractades amb ALA. Tanmateix, després del tractament amb ALA, la dilatació tubular i l'expansió de la matriu mesangial van disminuir significativament, però encara es van mantenir per sobre dels valors de control, mentre que l'àrea glomerular es va revertir completament als nivells de control. En rates control tractades amb ALA, es va trobar que la fracció de la matriu mesangial augmentava, cosa que suggereix que l'ús a llarg termini d'ALA podria afectar algunes de les característiques estructurals de laronyons(Figura 2 (a)).

Els AGE són factors patògens que contribueixen al dany renal en la diabetis. Per inspeccionar si l'ALA afecta l'acumulació de productes AGE a laronyonsde rates diabètiques, el contingut renal de CML es va avaluar mitjançant una tinció immunohistoquímica en control, rates diabètiques (4 i 8 setmanes) i control tractats amb ALA i rates diabètiques (4 i 8 setmanes) (Figura 2 (b)). La tinció de CML va ser positiva en ambdós grups de rates diabètiques, revelant que la CML s'acumula principalment al tubulointerstici i en menor mesura als glomèruls. Segons la quantificació del contingut de CML, aquests canvis van ser estadísticament significatius en comparació amb els controls corresponents (figura 2 (b)). Després del tractament amb ALA de rates diabètiques (4 i 8 setmanes), la immunoreactivitat de la LMC tant tubulointersticial com glomerular va disminuir notablement mentre que en rates control tractades amb ALA, la positivitat de la LMC es va mantenir indetectable com en els controls.

3.3.L'efecte de l'ALA sobre la deposició de col·lagen i l'expressió del gen Col4a1.La tinció de tricrom de Masson va revelar la deposició de col·lagen a les zones tubulointersticials i dins dels glomèruls, en particular a les membranes del soterrani d'ambdós compartiments en grups de rates diabètics (4 i 8 setmanes) (figura 3 (a)). El tractament amb ALA (4 i 8 setmanes) de rates no diabètics també es va associar amb un augment de la deposició de col·lagen caracteritzat per àrees glomerulars i tubulointersticials ocupades per la matriu tacada de col·lagen però sense significació estadística. En rates diabètiques tractades amb ALA (4 i 8 setmanes), la deposició de col·lagen es va mantenir persistentment, ja que no es va detectar una disminució significativa en comparació amb les rates diabètiques. Per verificar l'augment de la síntesi de col·lagen, es va avaluar el nivell d'expressió del gen Col4a1 mitjançant RT-PCR (Figura 3 (b)). Es va detectar un augment significatiu de l'expressió del gen Col4a1 en els ronyons de rates diabètiques en ambdós moments, així com en els ronyons de rates diabètics i no diabètics tractades amb ALA dels dos grups experimentals (4 i 8 setmanes), en comparació amb els respectius controls. .

3.4.Canvis profibròtics associats al tractament de la diabetis i l'ALA.L'anàlisi de Western blot va revelar que el nivell de proteïna TGF- 1 no va variar significativament després de 4 setmanes independentment del tractament (figura 4 (a)). Tanmateix, es va detectar una inducció estadísticament significativa de la proteïna TGF- 1 després de 8 setmanes de diabetis, que es va reduir lleugerament amb el tractament amb ALA, però es va mantenir significativament augmentada en comparació amb el control. A més, es va observar una inducció similar de TGF - 1 en animals no diabètics tractats amb ALA (Figura 4 (a)). Per examinar si la inducció de TGF - 1 va anar acompanyada de l'aparició de marcadors fibròtics, es va analitzar la presència de SMA mitjançant Western blot (figura 4 (b)). L'estat diabètic va desencadenar l'expressió de SMA que es va detectar a partir de la quarta setmana després de l'inici de la diabetis. El tractament amb ALA de rates diabètiques va reduir la SMA al nivell de control després de 4 setmanes, però va ser ineficaç després de 8 setmanes. El tractament amb ALA no va afectar la SMA en rates no diabètics després de 4 setmanes, mentre que després de 8 setmanes, va provocar una expressió augmentada de SMA pel que fa al control, però aquest augment no va ser estadísticament significatiu (figura 4 (b)).

El tractament de rates no diabètics amb ALA va donar lloc a empremtes similars pel que fa a les característiques profibròtiques en comparació amb les rates diabètiques, cosa que indica la necessitat de revelar els mecanismes que subjauen als canvis semblants a fibròtics observats en els ronyons de rates no diabètics tractades amb ALA. Per investigar la possibilitat que les modificacions epigenètiques representin mecanismes addicionals implicats en el paisatge profibròtic induït per ALA observat en rates no diabètics, en un augment particular de l'expressió de Col4a1, els ronyons de rates no diabètics tractades amb ALA i control es van sotmetre a una anàlisi de l'estat de metilació de l'ADN. .

3.5.L'impacte de l'ALA en l'estat de metilació de l'ADN.El nivell global de metilació de l'ADN i l'expressió gènica dels principals actors implicats en la metilació de l'ADN (Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b) i la desmetilació (Tet1) es van avaluar en ronyons de control no diabètic i rates tractades amb ALA durant 4 i 8 setmanes (Figura 5). ). Només el nivell d'ARNm de Tet1 va mostrar un augment estadísticament significatiu després de 8 setmanes de tractament amb ALA, mentre que l'expressió de Dnmts i el nivell global de metilació de l'ADN no van mostrar una diferència significativa després de 4 o 8 setmanes de tractament amb ALA en comparació amb els controls.

El següent experiment es va dirigir a l'examen del nivell local de metilació de l'ADN del gen Col4a1. La forma principal de col·lagen IV conté dues cadenes 1(IV) i una cadena 2(IV), codificades pels gens Col4a1 i Col4a2 que es disposen en una orientació cap a cap formant una unitat transcripcional única i es transcriuen en diferents direccions de la mútua. promotor [17]. Col4a1 es transcriu des de la regió intergènica de 130 pb de llarg que conté dos llocs Sp1, caixes CAAT i CTC [17] (Figura 6 (a)). L'estat de metilació de l'ADN del promotor Col4a1/Col4a2 es va avaluar mitjançant l'anàlisi MSP i la posició dels primers es mostra a la figura 6 (a). Els dos parells d'encebadors, específics per a ADN metilat i no metilat, van cobrir 2 CpG per imprimador. Els resultats de MSP van revelar que l'ALA no va afectar l'estat de metilació del promotor Col4a1/Col4a2 després de 4-un tractament d'una setmana (figura 6 (b)). Tanmateix, es va observar una disminució estadísticament significativa de l'índex de metilació de l'ADN després de 8 setmanes de tractament amb ALA (Figura 6 (b)), cosa que suggereix el potencial de l'ALA per modular l'expressió de Col4a1 durant l'alteració del patró de metilació de l'ADN del seu promotor.

4. Discussió

A causa de la proporció epidèmica de diabetis, la DKD es converteix en la causa més freqüent de malaltia renal en fase terminal a tot el món i el factor més indicatiu de mortalitat prematura en pacients amb diabetis [28, 29]. La incidència de DKD en pacients diabètics no s'ha reduït en les últimes dècades malgrat el tractament intens dirigit al control del sucre en sang [28, 30]. Entre les estratègies potencials de tractament que han demostrat beneficis contra la DKD es troba l'orientació de l'estrès oxidatiu i en aquest terme es va establir que l'ALA pot millorar la funció renal en la diabetis [29, 31, 32]. Els resultats obtinguts en el present estudi van confirmar els efectes hipoglucèmics de l'ALA, però van indicar la ineficàcia de l'ALA contra els nivells d'urea alterats en la diabetis a llarg termini.

Un augment de la glucèmia sola o combinada amb l'estrès oxidatiu és un dels mecanismes implicats en la formació d'AGEs l'acumulació dels quals en els compartiments glomerulars i tubulointersticials es va correlacionar amb el grau de dany renal en un sistema model experimental de nefropatia diabètica [33, 34] . La CML és un dels principals AGE in vivo [35] el nivell dels quals augmenta en la circulació i els òrgans, inclosos els ronyons de pacients diabètics [36], jugant un paper important en la patogènesi de la nefropatia diabètica [37]. Els nostres resultats van mostrar que la deposició de CML s'acumula principalment al tubulointersticial i en menor mesura al compartiment glomerular del ronyó de rata diabètica que va disminuir notablement després del tractament amb ALA. Segons les dades publicades, els túbuls enriquits amb CML podrien ser el compartiment renal més greument lesionat [38–40]. En discrepància amb el nostre resultat, s'han descrit efectes limitats de l'ALA sobre el contingut de CML en rates diabètiques, detectats tant per immunotinció com per anàlisi química [40] i aquesta inconsistència pot sorgir del disseny experimental de l'estudi.

L'anàlisi histològica d'una estructura renal mitjançant la tinció de PAS va confirmar els efectes protectors de l'ALA en la diabetis. Els efectes antioxidants beneficiosos de l'ALA contra la lesió oxidativa induïda per la diabetis als ronyons estaven ben establerts [22, 31, 32]. Es va trobar que el tractament amb ALA prevenia la insuficiència renal i alleujava els canvis patològics estructurals renals, inclosa l'expansió de la matriu mesangial glomerular i la glomeruloesclerosi a causa del seu potencial antioxidant i hipoglucèmic combinat [21, 22]. Tenint en compte que l'alt nivell de glucosa, l'estrès oxidatiu i la formació d'AGE es reconeixen com a factors importants per a la inducció de canvis profibròtics al ronyó [41], efectes antioxidants i hipoglucèmics ben establerts i la capacitat de l'ALA per reduir el contingut de CML advoca fermament per la potencial de l'ALA per alleujar el procés fibròtic als ronyons diabètics. Tanmateix, els nostres resultats van revelar que a les seccions de teixit renal tenyits de Masson, el grau de deposició de fibra de col·lagen no va canviar significativament després del tractament amb ALA de rates diabètiques. A més, el tractament amb ALA va mostrar la tendència a augmentar la síntesi/contingut de col·lagen en rates no diabètics. D'acord amb les nostres troballes, s'han informat dels efectes perjudicials de l'ALA sobre el control / els ronyons sans [42]. Estudiant els mecanismes renoprotectors de l'ALA en la nefropatia diabètica, els autors van descobrir de manera inesperada que el tractament amb ALA estava associat amb el desenvolupament de glomeruloesclerosi, fibrosi tubulointersticial i disminució de la funció renal als ronyons no diabètics. Estudis independents van revelar que dosis més altes d'ALA provoquen danys a les proteïnes oxidatives en rates envellides [43] i fins i tot una disminució de la funció renal en la diabetis [40]. En línia amb això, l'efecte prooxidant de l'ALA es va evidenciar no només en estudis amb animals, sinó també en pacients que pateixen una malaltia renal en fase terminal que rebien ferro per via intravenosa [44].

En el context dels efectes observats de l'ALA sobre la deposició de col·lagen, els nostres resultats també van mostrar que l'ALA no va reduir el nivell de dos marcadors fibròtics, TGF- 1 i -SMA, en rates diabétiques després de 8 setmanes i fins i tot va induir TGF. - 1 expressió en rates no diabètics després de 8 setmanes de tractament. D'acord amb això, l'expressió gènica del col·lagen tipus IV va ser significativament més alta en rates diabétiques, així com en rates diabètics i no diabètics tractades amb ALA en comparació amb els controls. Anteriorment, s'ha demostrat que l'estrès oxidatiu indueix el TGF- 1 i els seus gens diana aigües avall com el col·lagen tipus I, III i IV, així com la fibronectina [9, 45] i que els antioxidants reprimeixen el TGF{{ 10}} expressió [46]. En contrast amb la idea general del paper protector i antifibròtic dels antioxidants, els nostres resultats suggereixen que l'ALA podria tenir múltiples efectes sobre els factors implicats en el procés fibròtic en els ronyons diabètics. Sembla que l'ALA indueix específicament l'expressió d'alguns gens relacionats amb la fibrosi com TGFB1 i especialment Col4a1, l'augment de l'expressió dels quals ja es va detectar després de 4 setmanes de tractament amb ALA en ronyons diabètics i no diabètics. S'ha observat una expressió i deposició millorades de col·lagen tipus I després del tractament amb ALA en fibroblasts dèrmics humans [24]. L'estudi va revelar que la regulació del col·lagen tipus I resulta de la senyalització aigües avall del receptor I del TGF, suggerint així un nou efecte farmacològic de l'ALA implicat en l'envelliment de la pell. Tenint en compte els resultats que es presenten aquí, la regulació dels col·lagens podria ser una resposta cel·lular comuna a l'ALA en lloc d'un mecanisme específic característic dels fibroblasts dèrmics.

La síntesi de col·lagen tipus IV està regulada a nivells transcripcionals, posttranscripcionals i posttraduccionals ben establerts, però estan sorgint més dades sobre el paper de la metilació de l'ADN en l'expressió de Col4a1. Un estudi realitzat fa 40 anys va revelar que el tractament de cèl·lules de teratocarcinoma F9 amb un agent desmetilant de l'ADN 5-l'azacitidina dóna lloc a una expressió més gran de Col4a1, cosa que suggereix per primera vegada que la metilació de l'ADN pot tenir un paper important en la seva expressió [47]. Els estudis de metiloma i transcriptoma humà van revelar una correlació de la metilació del promotor Col4a1 amb la seva expressió en cèl·lules sanes i hepàtiques activades per produir proteïnes ECM [20, 48]. El mateix es va trobar a les cèl·lules mesangials on després del tractament amb 5-azacitidina, els nivells d'ARNm de Col4a1 van augmentar significativament [49]. A més, en pacients amb malaltia renal crònica, es va trobar que el nivell de metilació de l'ADN dels gens Col4a1 i Col4a2 era significativament més baix en comparació amb els subjectes sans i en correlació amb l'augment de l'ARNm i les expressions de proteïnes [50]. Els nostres resultats van confirmar una forta evidència de la regulació de l'expressió de Col4a1 mitjançant la metilació de l'ADN, ja que vam trobar que l'expressió de Col4a1 es correlaciona amb l'estat de metilació del seu promotor al ronyó. Cal tenir en compte que els canvis observats en l'estat de metilació del promotor Col4a1 probablement afecten també l'expressió de Col4a2, ja que dos gens estan regulats mitjançant una regió promotora bidireccional mútua. Els primers MSP utilitzats en els nostres experiments es van dissenyar per solapar-se parcialment amb dos llocs d'unió de Sp1 i una disminució de la metilació de l'ADN que vam observar després del tractament amb ALA podria reflectir-se en la unió millorada de Sp1 i la regulació de l'expressió de Col4a1.

Les nostres troballes que l'expressió de Col4a1 i el seu estat de metilació són propensos a l'acció d'ALA en animals no diabètics després de 8 setmanes de tractament amb ALA també suggereixen el potencial de l'ALA per actuar també com a regulador epigenètic. Segons els nostres resultats, l'ALA va afectar l'enzim Tet1 després de 8 setmanes de tractament, cap a la seva expressió augmentada, cosa que indica la possibilitat que la desmetilació específica del gen es pugui produir sense cap efecte net detectable sobre la metilació de l'ADN a tot el genoma. Tot i que hi ha una correlació entre l'augment de l'expressió de Col4a1 i la disminució de la metilació del seu promotor després de 8 setmanes de tractament amb ALA, tot i així, és difícil considerar inequívocament que la desmetilació de l'ADN és l'únic vincle causal entre el tractament amb ALA i l'augment de l'expressió gènica del col·lagen. a les 4 setmanes, l'augment de l'expressió de Col4a1 no es va associar amb l'alteració del seu estat de metilació. S'ha proposat la capacitat de l'ALA per regular epigenèticament determinats gens per als gens IL-1 i IL{-6 els nivells d'ARNm i proteïnes regulats a la baixa estaven associats amb la hipermetilació de les seves regions promotores [51, 52]. Tot i que la hipermetilació es va proposar com un dels mecanismes d'acció de l'ALA, les vies detallades de regulació epigenètica impulsades per l'ALA encara no s'han dilucidat i esperen que es confirmin també per als altres gens. Per tant, el vincle entre l'augment de la síntesi/deposició de col·lagen que pot donar lloc a un fenotip patològic i la desmetilació de l'ADN mediada per Tet del promotor Col4a1 provocada pel tractament amb ALA requereix proves addicionals i hauria de proporcionar la plataforma per a futurs estudis.

5. Conclusions

El paper protector de l'ALA contra el mal funcionament relacionat amb la diabetis de diferents òrgans, inclosos els ronyons, s'ha atribuït principalment als seus efectes antioxidants i hipoglucèmics. Tanmateix, els resultats presentats en aquest estudi suggereixen que la protecció renal a la diabetis per ALA podria estar limitada a causa de l'augment de la síntesi/deposició de col·lagen als ronyons. Mitjançant l'anàlisi dels efectes de l'ALA sobre els processos profibròtics en els ronyons de rata diabètica, vam trobar que l'ALA no reduïa ni la síntesi de col·lagen ni els marcadors profibròtics. A més, el tractament amb ALA va contribuir a esdeveniments profibròtics i a la síntesi de col·lagen fins i tot en ronyons de rates no diabètics, que està parcialment relacionat amb els canvis en l'estat de metilació de l'ADN del gen Col4a1. En conseqüència, en pacients amb fibrosi renal, cal tenir precaució en l'ús d'ALA per evitar l'agreujament de la complicació renal existent. A més, cal tenir precaució quan s'ha d'utilitzar l'ALA per augmentar el potencial antioxidant en una persona sana o en la gestió d'altres complicacions diabétiques, ja que els efectes beneficiosos d'una complicació podrien ser perjudicials per a l'altra.

1Departament de Biologia Molecular, Institut d'Investigació Biològica "Siniša Stanković", Institut Nacional de la República de Sèrbia, Universitat de Belgrad, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrad, Sèrbia

2Departament de Citologia, Institut d'Investigació Biològica "Siniša Stanković", Institut Nacional de la República de Sèrbia,

Universitat de Belgrad, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrad, Sèrbia

La correspondència s'ha d'adreçar a Aleksandra Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Rebut el 4 de novembre de 2020; Revisat el 19 de febrer de 2021; Acceptat el 27 de febrer de 2021; Publicat el 12 de març de 2021

Editor acadèmic: Alin Ciobica

Copyright © 2021 Nevena Grdović et al. Aquest és un article d'accés obert distribuït sota la llicència d'atribució de Creative Commons, que permet l'ús, la distribució i la reproducció sense restriccions en qualsevol mitjà sempre que l'obra original sigui degudament citada.

Disponibilitat de dades

Totes les dades rellevants utilitzades per donar suport a les conclusions d'aquest estudi s'inclouen a l'article.

Conflictes d'interès

Els autors declaren que no hi ha conflicte d'interessos pel que fa a la publicació d'aquest article.

Aportacions dels autors

Concepció i disseny dels experiments: MM, NG, AU; Manipulació i tractament d'animals: MĐ, JAJ, AU, SD; Anàlisi histològica realitzada, immunotinció i quantificació de resultats: JAJ, MĐ, ST. Anàlisi Western blot realitzada: AU, SD, NG; Va realitzar els experiments RTqPCR: JR, MĐ; Va realitzar els experiments de metilació de l'ADN: JR, AT, MV; Anàlisi estadística: NG; Interpretació de dades i elaboració de xifres: NG, MM; Va escriure el treball: NG, AU; Revisió crítica del manuscrit: MV, SD. Tots els autors van aprovar la versió final per a la seva publicació.

Agraïments

Aquest treball va comptar amb el suport del Ministeri d'Educació, Ciència i Desenvolupament Tecnològic de la República de Sèrbia (subvenció núm. 451-03-9/{2021-14/200007).

Materials complementaris

Taula complementària S1: seqüències d'encebadors utilitzades per a l'anàlisi quantitativa de PCR en temps real de Col4a1 (cadena de col·lagen tipus IV alfa 1), Dnmt1 (ADN metiltransferasa 1), Dnmt3a (ADN metiltransferasa 3 alfa), Dnmt3b (ADN metiltransferasa 3 beta), Tet1 (Tet metilcitosina dioxigenasa 1) i expressió del gen Actb (Actina, beta). Taula complementària S2: seqüències d'encebadors per a l'anàlisi MSP de la metilació de l'ADN de la regió promotora del gen Col4a1. Figura suplementària S1: imatges representatives d'immunoblot. Nivells de proteïnes de TGF- 1 (A) i SMA (B), dues proteïnes relacionades amb la fibrosi, en ronyons de rates control i diabètics tractats o no tractats amb ALA, 4 i 8 setmanes després de la inducció de la diabetis, determinats per Western anàlisi de taques. (Materials complementaris)

Referències

[1]RC Atkins, "L'epidemiologia de la malaltia renal crònica", Kidney International. Suplement, vol. 67, pàgines S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho i B. Masala, "Antioxidant strategies in the management of diabetic neuropathy", BioMed Research International, vol. 2015, ID de l'article 515042, 15 pàgines, 2015.

[3]M. Lv, Z. Chen, GY Hu i QB Li, "Estratègies terapèutiques de la nefropatia diabètica: progrés recents i perspectives futures", Drug Discovery Today, vol. 20, no. 3, pàgines 332–346, 2015.

[4]A. Karihaloo, "Teràpia anti-fibrosi i nefropatia diabètica", Current Diabetes Reports, vol. 12, núm. 4, pàgines 414–422, 2012.

[5]S. Yamagishi i T. Matsui, "Productes finals de glicació avançada, estrès oxidatiu i nefropatia diabètica", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 3, no. 2, pàgines 414–108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal i P. Boor, "La matriu extracel·lular al ronyó: una font de nous biomarcadors no invasius de la fibrosi renal?", Fibrogenesis & Tissue Repair, vol. 7, no. 1, pàg. 4, 2014.

[7]S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono,A. Casaretto i FN Ziyadeh, "El paper clau del sistema beta-factor de creixement transformador en la patogènesi de la nefropatia diabètica", Renal Failure, vol. 23, pàgs. 471–481, 2001.

[8]BB Hoffman, K. Sharma, Y. Zhu i FN Ziyadeh, "Transcriptional activation of transforming growth factor- 1 in mesangial cell culture by high glucose concentration", Kidney International, vol. 54, núm. 4, pàgines 1107–1116, 1998.

[9]M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, et al., "La quinasa lligada a la integrina media la regulació del factor de creixement transformant depenent del peròxid d'hidrogen- 1", Free Radical Biology & Medicine, vol. 61, pàgines 416–427, 2013.

[10]K. Sharma i TA McGowan, "TGF- en la malaltia renal diabètica: paper de noves vies de senyalització", Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11, núm. 1-2, pàgines 115–123, 2000.

[11] FJ López-Hernández i JM Lopez-Novoa, "Role of TGF- in chronic kidney disease: an integration of tubular, glomerular and vascular effectes", Cell and Tissue Research, vol. 347, núm. 1, pàgs. 141–154, 2012.

[12]PD Yurchenco i JJ O'Rear, "Basal lamina assembly", Current Opinion in Cell Biology, vol. 6, no. 5, pàgs. 674–681, 1994.

[13]A. Nerlich i E. Schleicher, "La localització immunohistoquímica dels components de la matriu extracel·lular en lesions glomerulars diabètics humans", The American Journal of Pathology, vol. 139, núm. 4, pàgines 889–899, 1991.

[14]RM Mason i NA Wahab, "Metabolisme de la matriu extracel·lular en la nefropatia diabètica", Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, núm. 5, pàgines 1358–1373, 2003.

[15] RE Gilbert, A. Cox, LL Wu et al., "Expressió del factor de creixement transformant-beta 1 i col·lagen tipus IV al tubulointerstitium renal en diabetis experimental - efectes de la inhibició de l'ACE", Diabetes, vol. 47, núm. 3, pàgines 414–422, 1998.

[16]MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita, et al., "Synthesis of type III collage and type IV collagen by tubular epithelial cells in diabetic nefropathy", Pathology, Research and Practice, vol. 191, núm. 11, pàgines 1099–1104, 1995.

[17]JP Grande, DC Melder, DL Kluge i ED Wieben, "Structure of the rat collagen IV promoter", Biochimica et Bio-Pysica Acta, vol. 1309, núm. 1-2, pàgs. 85–88, 1996.

[18]E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti, et al., "La interrupció d'un lloc d'unió miR-29 que condueix a la regulació positiva de COL4A1 provoca microangiopatia autosòmica dominant pontina amb leucoencefalopatia", Annals of Neurology, vol. 80, no. 5, pàgs. 741– 753, 2016.

[19]M. Griffiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk i E. Dimitriadis, "la sobreexpressió de miR-29c i la regulació a la baixa de COL4A1 en l'endometri humà infèrtil redueix la capacitat adhesiva de les cèl·lules epitelials endometrials _in vitro_ implicant rols en la receptivitat", Scientific Reports, vol. 9, no. 1, pàg. 8644, 2019.

[20]A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner, et al., "Anàlisi a tot el genoma de la metilació de l'ADN i els patrons d'expressió gènica en cèl·lules hepàtiques humanes purificades i sense cultivar i cèl·lules estelades hepàtiques activades", Oncotarget, vol. 6, no. 29, pàgines 26729– 26745, 2015.