La pèrdua de JAK1 condueix a la deficiència immune innata

La via de senyalització Janus cinasa: transductors de senyal i activadors de la transcripció (JAK-STAT) és fonamental per ajustar les respostes immunitàries i la seva desregulació està estretament associada amb el càncer i els trastorns immunitaris. La interrupció de la via de senyalització de la interleucina (IL)-15/STAT5 a causa de la pèrdua de les cadenes del receptor IL-15, JAK3 o STAT5 condueix a deficiències immunitàries amb anomalies de cèl·lules assassines naturals (NK). JAK1, juntament amb JAK3, transmet senyals aigües avall d'IL-15, però la contribució exacta de JAK1 a la biologia de les cèl·lules NK encara està per dilucidar. Per estudiar les conseqüències de la deficiència de JAK1 a les cèl·lules NK, vam generar ratolins amb supressió condicional de JAK1 a les cèl·lules NKp46+ (Jak1fl/flNcr1Cre). Mostrem aquí que la supressió de JAK1 intrínsec de cèl·lules NK va reduir significativament el nombre de cèl·lules NK a la medul·la òssia i va afectar el seu desenvolupament. En línia, vam observar una pèrdua gairebé completa de cèl·lules NK a la melsa, la sang i el fetge, demostrant el paper crucial de JAK1 en les cèl·lules NK perifèriques. En línia, els ratolins Jak1fl / + Ncr1Cre van mostrar una vigilància tumoral mediada per cèl·lules NK significativament deteriorada. Les nostres dades suggereixen que JAK2 no és capaç de compensar la pèrdua de JAK1 a les cèl·lules NK. És important destacar que la supressió condicional de JAK2 a les cèl·lules NKp46+ no va tenir cap efecte sobre les cèl·lules NK perifèriques, revelant que el JAK2 intrínsec de les cèl·lules NK és prescindible per a la supervivència de les cèl·lules NK. En resum, vam identificar que la pèrdua de JAK1 a les cèl·lules NK condueix a la deficiència immune innata, mentre que la deficiència de JAK2 deixa el nombre de cèl·lules NK i la maduració inalterats. Per tant, proposem que, a diferència dels inhibidors JAK1/JAK2 que s'utilitzen actualment, l'ús d'inhibidors específics de JAK2-seria avantatjós per als pacients deixant les cèl·lules NK intactes.

Paraules clau: JAK-STAT, cèl·lules assassines naturals, JAK1, JAK2, vigilància del tumor

Beneficis de cistanche tubulosa-Antitumor

INTRODUCCIÓ

Les cèl·lules assassines naturals (NK) són limfòcits innats que reconeixen i maten cèl·lules infectades o transformades per virus (1). La deficiència de cèl·lules NK és un subtipus d'immunodeficiència primària (PID) rar però cada cop més apreciat. La deficiència clàssica de cèl·lules NK es caracteritza per l'absència de cèl·lules NK a la sang perifèrica i dóna lloc a una major susceptibilitat a les infeccions víriques (2). La via de senyalització Janus kinase (JAK), transductor de senyal i activador de la transcripció (STAT) actua aigües avall de múltiples citocines, factors de creixement i hormones, regulant així de manera crítica les respostes immunes (3, 4). En unir-se un lligand específic al seu receptor afí, els canvis conformacionals condueixen a l'oligomerització del receptor i l'activació dels JAKs associats al receptor. Els JAK s'auto i trans-fosforilen entre si i fosforilen cadenes de receptors, proporcionant els llocs d'acoblament per a molècules STAT. Aleshores, els STAT se sotmeten a una fosforilació mediada per JAK, es dimeritzen i es transloquen al nucli, on regulen la transcripció dels gens diana (5). JAK3 i STAT5 són actors crucials en la transducció del senyal aigües avall de les citocines que utilitzen el receptor c (6). Les mutacions de "pèrdua de funció" (LOF) en gens que codifiquen JAK3 (7) o STAT5B (8) condueixen a PID amb una anormalitat de cèl·lules NK que subratlla la importància de la via per als limfòcits innats. La immunodeficiència d'aquests pacients s'ha explicat per les respostes IL-7 i IL-15 alterades (6). És important destacar que JAK1 té un paper dominant sobre JAK3 en l'activació de STAT5 aigües avall dels receptors de citocines que contenen c (9). És atractiu especular que les mutacions LOF de JAK1 també podrien provocar PID. Fins ara, només s'ha identificat un pacient que albergava mutacions de la línia germinal de JAK1, on JAK1 es va reduir però no n'hi havia absent, i de fet s'ha presentat amb supressió immune (10). En els ratolins, la pèrdua completa de JAK1 condueix a la letalitat perinatal i els ratolins nounats mostren una forta reducció de timòcits i cèl·lules B (11). Aquestes observacions es van confirmar en ratolins adults: la supressió induïble de JAK1 condueix a un deteriorament de l'homeòstasi de les cèl·lules mare hematopoietiques (HSC) i redueix notablement les freqüències de les cèl·lules B i el subconjunt B{220+CD11c+NK1.1+ de Cèl·lules NK (12). Tanmateix, fins ara, cap estudi ha analitzat directament l'efecte de la pèrdua de JAK1 sobre les cèl·lules NK convencionals.

Cistanche deserticola ma-Manteniment del fetge

Les primeres idees sobre la contribució de JAK1 a la biologia cel·lular NK es deriven d'estudis que utilitzen inhibidors de JAK: fàrmacs aprovats per al tractament de càncers i malalties autoimmunes (13). Tant els ratolins com els pacients tractats amb l'inhibidor de JAK1/JAK2 Ruxolitinib van mostrar un nombre reduït de cèl·lules NK, una maduració i una funció deteriorades (14, 15). Atès que JAK2 també ha estat implicat en l'impuls de la diferenciació de cèl·lules NK (14, 16), queda per dilucidar quina de les dues cinases és responsable dels efectes observats del tractament amb Ruxolitinib. Utilitzant ratolins amb eliminació de Jak1 o Jak2 a les cèl·lules NKp46+, aquí mostrem que JAK2 és prescindible per a la supervivència de les cèl·lules NK. En canvi, la supressió de JAK1 a les cèl·lules NK madures condueix a una deficiència de cèl·lules NK i la pèrdua d'un al·lel de Jak1 és suficient per deteriorar el control del creixement del tumor. Així, vam identificar JAK1 com un factor clau per a les cèl·lules NK madures i vam generar un model de ratolí de deficiència de cèl·lules NK clàssica.

MATERIALS I MÈTODES

Ratolins i línies cel·lulars

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; va ser amablement proporcionat pel Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Viena, Àustria). L'al·lel Jak1tm1c del mutant es va generar a partir de ratolins amb el primer al·lel eliminatori Jak1tm1a (descrit per International Mouse Phenotyping Consortium https://www.mousephenotype.org) mitjançant l'excisió del casset lacZ-neo mitjançant la recombinació Flp.

El potencial condicional dels ratolins Jak1fl/fl es va activar mitjançant la recombinació Cre i l'excisió de l'exó 3 flanquejat per loxP de Jak1. La recombinació específica del teixit es va induir mitjançant la reproducció creuada de Jak1fl/fl o Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] amb B6NTg(Ncr1Cre); (18) ratolins. Abans es van descriure ratolins Stat5fl/fl (19) i Stat5fl/flNcr1Cre (18). Els ratolins Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre estaven en fons C57B6/N i Jak2fl/fl en fons mixt. Els animals experimentals es van emparellar per edat (8-12 setmanes) i es van mantenir en condicions específiques lliures de patògens a la Universitat de Medicina Veterinària de Viena segons les directrius de la Federació per a Associacions de Ciència Animal de Laboratori (FELASA) (2014). Els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica i Benestar Animal de la Universitat de Medicina Veterinària de Viena i l'autoritat nacional (Ministeri Federal de Ciència i Recerca d'Àustria) segons §§ 26ff. of Animal Experiments Act, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, sota les llicències BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 i BMBWF{-68.205/0174-V/3b /2018 i es van realitzar segons les directrius de FELASA i ARRIVE. Al llarg del document, Jak1WT es refereix a dades agrupades de ratolins Jak1fl/+ i Jak1fl/fl. Les línies cel·lulars de limfoma de ratolí RMA-Rae1 [amabilitat proporcionada pel Prof. A. Cerwenka; (20)] i YAC-1 es van cultivar en un medi complet RPMI1640 (Sigma) que contenia un 10% de FCS (Bio & Sell), 100 U/mL de penicil·lina, 100 mg/mL d'estreptomicina (Sigma) i 50 µM {{58} }}mercaptoetanol (Sigma).

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Model de tumors in vivo

Els ratolins Jak1fl/+ i Jak1fl/+Ncr1Cre es van injectar sc amb 106 cèl·lules RMA-Rae1 als dos flancs i es va controlar el creixement del tumor cada dos dies. Deu dies després de la injecció, es van sacrificar els ratolins i es va determinar el pes del tumor. Per a l'anàlisi citomètrica de flux de cèl·lules NK infiltrades en el tumor, els tumors es van tallar en trossos d'aproximadament 5 mm2 i es va obtenir la suspensió cel·lular única mitjançant gentleMACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) amb tampó de digestió que contenia col·lagenasa D (1 mg/mL; Sigma Aldrich) i DNAsa I (20 mg/mL; Roche).

Aïllament, expansió i estimulació de cèl·lules NK

Les cèl·lules NK es van aïllar de suspensions unicel·lulars de melsa mitjançant perles MACS marcades amb DX5-d'acord amb les instruccions del fabricant (Miltenyi Biotec). Les cèl·lules NK es van expandir en un medi complet RPMI1640 complementat amb 5,000 U/mL rhIL-2 (Proleukin, Novartis) durant 7 dies. El nombre de cèl·lules CD3−NK1.1+ es va avaluar mitjançant citometria de flux els dies 0, 3, 5 i 7. El dia 7 es van lisar les cèl·lules per a l'anàlisi de Western blot. Per a l'anàlisi pSTAT5, es van estimular 106 esplenòcits amb 50 ng/ml de rmIL-15 (PeproTech) durant 15 min i les cèl·lules es van fixar en un 2% de PFA seguit de permeabilització i rehidratació de metanol.

Assaig de citotoxicitat de cèl·lules NK

Per als assajos de citotoxicitat in vitro, les cèl·lules NK classificades per DX5-MACS es van expandir durant 7 dies en IL-2 tal com es descriu anteriorment i es van barrejar a les proporcions efector: objectiu indicades amb èster succinimidil de diacetat de carboxifluoresceïna (CFSE, Molecular Probes). , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) cèl·lules diana etiquetades. Després de 4 h d'incubació a 37 ◦ C, les cèl·lules es van tacar amb Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer) i es va avaluar la lisi específica de la cèl·lula diana mitjançant citometria de flux.

Citometria de flux

Es van preparar suspensions unicel·lulars a partir de la melsa, la medul·la òssia o el fetge. El fetge es va perfondre a través de la vena porta amb 5–1 0 ml de PBS estèril. La separació de limfòcits es va realitzar amb un 37,5% de personal (GE Healthcare). Per a l'anàlisi de sang, els eritròcits es van lisar amb BD FACS Lysing Solution segons el protocol del fabricant (BD Bioscience). Els anticossos (clons) dirigits a les proteïnes següents es van comprar a eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB{6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) i Ter119 (TER-119). Els anticossos CD49a (Ha31/8) i pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] es van comprar a BD Pharminogen i es va comprar pan-Rae1 (186107) a R&D Systems. El nombre total de cèl·lules es va avaluar mitjançant citometria de flux utilitzant perles de recompte Count Bright Beads (Invitrogen). Els experiments de citometria de flux es van realitzar en un BD FACSCanto II (BD Bioscience) o Cytoflex (Beckman Coulter) i es van analitzar mitjançant el programari BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) o FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

FIGURA 1|La pèrdua de JAK1 a les cèl·lules NKp46+ condueix a una absència gairebé completa de cèl·lules NK perifèriques. (A) La freqüència (tauler esquerre) i el nombre total (tauler dret) de cèl·lules NK Lin-(CD3-CD19-Ly-6G-Ter119-) CD122+ a la medul·la òssia es van avaluar per flux citometria. (B) Les cèl·lules Lin-CD122+ de medul·la òssia es van dividir encara més en precursors NK (NKPs: NKp46-NK1.1-), cèl·lules NK immadures (iNKs: NKp46-NK1.1+) i madures Cèl·lules NK (mNKs: NKp46+NK1.1+). (C) La freqüència de les cèl·lules NK CD3-NKp46+ a la melsa es va avaluar mitjançant citometria de flux i es mostren gràfics representatius. (D, E) La freqüència (tauler esquerre) i el nombre total (tauler dret) de cèl·lules NK CD3-NKp46+ a la melsa (D) i la sang (E) es van avaluar mitjançant citometria de flux. (F) La freqüència de les cèl·lules NK convencionals (CD3−NK1.1+NKp{46+CD49b+, panell esquerre) i les cèl·lules ILC1 (CD3−NK1.1+NKp{46+CD49a+) , panell dret) es va analitzar al fetge de ratolins Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre i Jak1fl/flNcr1Cre mitjançant citometria de flux. (A, B, D–F) Els gràfics de barres representen la mitjana ± SEM d'1–2 experiments independents; n=3–11. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

FIGURA 2|Les cèl·lules NK Jak1fl/flNcr1Cre restants mostren un fenotip immadur. (A, B) Les cèl·lules NK esplèniques CD3−NKp46+ es van analitzar per a l'expressió de CD27 i CD11b mitjançant citometria de flux. (A) Es mostra la freqüència de les cèl·lules en cada etapa de maduració: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}CD11b−), DP (CD{27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). El nombre total de cèl·lules en cada etapa de maduració es mostra a la figura S1C. (B) Es mostren gràfics representatius. (C) Les cèl·lules pSTAT5 (Y694) + es van analitzar dins de la població CD3−NKp46+NK1.1+ ex vivo després d'una estimulació de 15 minuts amb IL-15 mitjançant citometria de flux. (D) Es van analitzar les cèl·lules NK CD3-NKp{{30}} esplèniques per a l'expressió dels receptors activadors i inhibidors indicats mitjançant citometria de flux. Es mostra el percentatge de cèl·lules NK positives per a cada receptor. Les dades d'intensitat de fluorescència mitjana es presenten a la figura S1D. (A-D) Els gràfics de barres i els números a les parcel·les representen la mitjana ± SEM de 2 experiments independents; n=5–8. **p <0,01, ***p <0,001.

Western Blot

La lisi cel·lular, SDS-PAGE i Western blots es van realitzar tal com es va descriure anteriorment (21). La detecció de la quimioluminescència es va realitzar mitjançant el substrat Clarity Western ECL (BioRad) i el ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) i es va analitzar mitjançant el programari Image Lab (BioRad). Es van utilitzar els anticossos següents: anti-actina (C4, sc-47778) de Santa Cruz com a control de càrrega, anti-JAK2 (D2E12; #3230), antiPerforin (#3693) i anti-JAK1 (#3332). ) de Cell Signaling Technology.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Anàlisi estadística

Es van realitzar proves t no aparellades o ANOVA unidireccional amb posttests de Tukey mitjançant GraphPad Prism versió 5.00 (Programari GraphPad). El nivell de significació s'indica per a cada experiment (∗p < 0.05; ∗∗p <0,01; ∗∗∗p < 0,001).

RESULTATS

La supressió de JAK1 redueix els nombres de cèl·lules NK i ILC1 d'una manera dependent de la dosi

S'ha demostrat que l'inhibidor de JAK1/JAK2 Ruxolitinib redueix el nombre de cèl·lules NK, la maduració i la funció (14, 15). Per comparar i abordar la contribució de JAK1 i JAK2 per a la biologia cel·lular NK, vam generar ratolins amb supressió condicional de JAK1 o JAK2 a les cèl·lules NKp46+. Així, vam creuar ratolins Ncr1Cre (18) amb ratolins Jak1fl/fl o Jak2fl/fl [vegeu la secció Materials i mètodes i (17)], respectivament. Les cèl·lules NK es desenvolupen a la medul·la òssia a partir de precursors de cèl·lules NK (NKP), que es defineixen com Lin-CD122+NK1.1-NKp46-. Es desenvolupen en cèl·lules NK immadures (iNK) que es converteixen en NK1.1+ mentre que només les cèl·lules NK madures (mNK) són NK1.1+NKp46+ (22). Com que l'expressió de la recombinasa Cre als ratolins Ncr1Cre és impulsada pel promotor NKp46, la supressió mediada per Cre es limita a les cèl·lules NK. Vam observar una disminució significativa del percentatge i del nombre total de cèl·lules NK de medul·la òssia en ratolins Jak1fl/flNcr1Cre (figura 1A). Les cèl·lules Lin−CD122+ NK dels ratolins Jak1fl/flNcr1Cre van mostrar percentatges enriquits de precursors de cèl·lules NK (NKP) i cèl·lules NK immadures, mentre que les mNK es van reduir significativament a la medul·la òssia en línia amb un bloc de desenvolupament a la cèl·lula iNK. etapa que prevé la progressió a l'etapa de cèl·lules mNK (figura 1B). La supressió d'un al·lel de Jak1 va provocar un nombre intermedi de cèl·lules NK de medul·la òssia (figura 1A). De manera consistent, el desenvolupament de cèl·lules NK va mostrar un fenotip intermedi que suggereix un efecte de dosificació del gen Jak1 en el desenvolupament de cèl·lules NK (figura 1B). El bloqueig en el desenvolupament de cèl·lules NK de medul·la òssia es va traduir en un nombre dràsticament reduït de cèl·lules NK a la perifèria. La pèrdua de JAK1 va provocar una deficiència gairebé completa de cèl·lules NK esplèniques i sanguínies (figures 1C-E). D'acord amb un efecte de dosificació del gen Jak1, els ratolins Jak1fl / + Ncr1Cre van mostrar percentatges i nombres totals de cèl·lules NK reduïts fins al 50% en comparació amb els companys de tipus salvatge a la melsa i la sang (figures 1C-E). La supressió de l'efector aigües avall JAK1 i el factor de transcripció STAT5 a les cèl·lules NKp46+ també condueix a una reducció de les cèl·lules NK madures (18). Una comparació directa dels ratolins Jak1fl/flNcr1Cre i Stat5fl/flNcr1Cre va revelar que la supressió de JAK1 va provocar una deficiència de cèl·lules NK encara més pronunciada a la melsa i la sang que la supressió de STAT5 (figures S1A, B). Els limfòcits innats del fetge NKp46+ comprenen dos grups de llinatges diferents (23). Les cèl·lules NK convencionals (cNK) es caracteritzen per l'expressió de CD49b i circulen lliurement, mentre que els limfòcits innats tipus 1 residents en el fetge (ILC1) es caracteritzen per l'expressió de CD49a i es restringeixen al fetge (24). De manera similar a la melsa i la sang, els cNK hepàtics i els ILC1 residents en teixits es van eliminar gairebé completament després de la pèrdua de JAK1 (figura 1F). De nou, la supressió d'un al·lel de Jak1 va donar lloc a una abundància intermèdia de limfòcits innats del fetge (figura 1F). En resum, aquestes troballes ens van portar a concloure que l'expressió JAK1 a les cèl·lules NKp46+ és indispensable per al desenvolupament i manteniment de cèl·lules NK en òrgans perifèrics de manera dependent de la dosi.

JAK1 és crucial per a la maduració de cèl·lules NK

A la perifèria, les cèl·lules NK experimenten passos de maduració que es caracteritzen per l'expressió seqüencial de marcadors de superfície CD27 i CD11b (22). Un al·lel de Jak1 va ser suficient per impulsar la maduració de les cèl·lules NK, ja que no vam detectar cap diferència en el percentatge de cèl·lules en cada etapa de maduració entre les cèl·lules Jak1WT i Jak1fl/+Ncr1Cre (figures 2A, B). Les cèl·lules NK Jak1fl/flNcr1Cre restants van mostrar un augment de la població immadura (CD27+CD11b−) i una disminució de la població madura CD27−CD11b+ (figures 2A, B i figura S1C). Aquest resultat suggereix que les cèl·lules restants podrien haver perdut JAK1 i no haver rebut prou senyalització IL-15 per madurar completament. De fet, les cèl·lules NK Jak1fl/flNcr1Cre restants van mostrar una fosforilació reduïda de STAT5 ex vivo després d'una estimulació a curt termini amb IL -15 (figura 2C). L'activitat de les cèl·lules NK està controlada per un equilibri entre els receptors activadors i inhibidors. La supressió de ni un ni els dos al·lels de Jak1 va tenir un efecte sobre el percentatge de cèl·lules NK que expressaven els següents receptors activadors i inhibidors: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E i Ly49A (figura 2D). La diferència més destacada va ser una lleugera disminució de les cèl·lules NK Ly49G2+ i un augment de les cèl·lules NK DNAM-1+ als ratolins Jak1fl/flNcr1Cre (figura 2D). De la mateixa manera, no es van detectar diferències brutes en el nivell d'expressió (MFI) de cada receptor, a més d'un augment en el MFI de DNAM1 i Ly49G2 (figura S1D). A més del seu paper com a receptor activador, l'expressió DNAM- 1 marca un pas de desenvolupament; Les cèl·lules DNAM-1+ donen lloc a cèl·lules DNAM{-1- (25). Vam raonar que els canvis en DNAM-1+ reflecteixen el bloc de maduració de les cèl·lules NK Jak1fl/flNcr1Cre.

FIGURA 3|JAK2 és prescindible per a la supervivència i la maduració de les cèl·lules NK. (A) Es va avaluar la freqüència (tauler esquerre) i el nombre total (tauler dret) de cèl·lules CD3 -NKp46+ NK a la melsa de ratolins Jak2WT i Jak2fl/flNcr1Cre mitjançant citometria de flux. ( B ) Les cèl·lules NK esplèniques CD3-NKp46+ es van analitzar per a l'expressió de CD27 i CD11b mitjançant citometria de flux. Es mostra la freqüència de les cèl·lules en cada etapa de maduració: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD{27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (C) L'expressió de JAK2 i -actina es va analitzar mitjançant Western blot en cèl·lules NK després de 6 dies d'expansió a IL{26}}. Les exploracions de taques completes estan disponibles al material suplementari. (A, B) Els gràfics de barres representen la mitjana ± SEM de 2-3 experiments independents; n=5–12.

FIGURA 4|La pèrdua d'un al·lel de Jak1 perjudica l'activitat de les cèl·lules NK. (A) Les cèl·lules NK es van purificar amb MACS de la melsa i es van cultivar a IL-2 durant 7 dies. El nombre de cèl·lules vives CD3−NK1.1+NKp{46+ es va avaluar cada 2-3 dies. Els símbols i les barres d'error presents signifiquen ± SEM de 2-4 rèpliques biològiques. (B) L'expressió de JAK1, Perforin i -actina es va analitzar en cèl·lules NK expandides a partir de dos experiments independents mitjançant Western blot. Les exploracions de taques completes estan disponibles al material suplementari. (C) Les cèl·lules NK expandides de ratolins Jak1WT i Jak1fl/+Ncr1Cr es van barrejar amb cèl·lules objectiu YAC{{20}} (tauler esquerre) o RMA-Rae1 (plafó dret) tenyides de CFSE a les proporcions objectiu efectors indicades . La lisi específica es va avaluar mitjançant citometria de flux. Per a YAC-1 es mostra un gràfic representatiu d'un dels dos experiments independents. Els símbols i les barres d'error presenten la mitjana ± SEM de 2 rèpliques tècniques. Per a RMA-Rae1 es mostra una mitjana de dos experiments independents. Els símbols i les barres d'error presents signifiquen ± SEM de 2-3 rèpliques biològiques. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 és prescindible per a la supervivència i la maduració de les cèl·lules NK

Fins ara hem demostrat que la supressió de JAK1 intrínseca a les cèl·lules NK condueix a una deficiència de cèl·lules NK. Per dilucidar si JAK2 afecta la supervivència i la maduració de les cèl·lules NK, vam analitzar les cèl·lules NK esplèniques en ratolins Jak2fl/flNcr1Cre i els seus companys de tipus salvatge. No vam poder detectar cap impacte de la supressió de JAK2 en la freqüència o el nombre total de cèl·lules CD3-NKp 46+ a la melsa (figura 3A). A més, els ratolins Jak2fl/flNcr1Cre van mostrar una maduració normal de cèl·lules NK, ja que es van detectar percentatges similars de cèl·lules CD27-CD11b+ en ambdós genotips (figura 3B). Com que la supressió de la proteïna JAK2 a les cèl·lules NK va ser molt eficient (figura 3C), aquestes dades defineixen de manera inequívoca que, a diferència de JAK1, la JAK2 intrínseca de les cèl·lules NK és prescindible per a la supervivència i la maduració de les cèl·lules NK.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

La pèrdua d'un al·lel de Jak1 perjudica la funcionalitat de les cèl·lules NK

Per obtenir més informació sobre com JAK1 regula la funcionalitat de les cèl·lules NK, vam analitzar el creixement de cèl·lules NK esplèniques purificades amb MACS de Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre i Jak1fl/flNcr1Cre. Les cèl·lules NK deficients de JAK1- no es van expandir, cosa que demostra que fins i tot amb una dosi molt alta d'IL-2 altres JAK no poden compensar la pèrdua de JAK1 (figura 4A). La pèrdua d'un al·lel de Jak1 va donar lloc a una deficiència de creixement menor (figura 4A). L'anàlisi de Western blot va confirmar la reducció de l'expressió de proteïna JAK1 a les cèl·lules expandides Jak1fl / + Ncr1Cre NK, que es va acompanyar de nivells reduïts de perforina (figura 4B). En línia, les cèl·lules NK Jak1fl / + Ncr1Cre van mostrar una activitat citotòxica deteriorada contra les línies cel·lulars diana YAC -1 i RMA-Rae1 (figura 4C). Aquests resultats demostren que JAK1 no només és indispensable per mantenir les cèl·lules NK a la perifèria sinó que també contribueix a la seva activitat citotòxica.

L'esgotament de cèl·lules NK induït per la pèrdua d'un al·lel de Jak1 perjudica la vigilància del tumor

Les cèl·lules NK són crucials per al reconeixement i eliminació precoç de cèl·lules transformades. Per investigar si la reducció de cèl·lules NK i la seva funcionalitat deteriorada en els ratolins Jak1fl / + Ncr1Cre produeixen una major susceptibilitat al creixement del tumor i no es compensa per altres mitjans, vam fer ús de cèl·lules de limfoma RMA-Rae1. Aquesta línia cel·lular és una eina per estudiar la vigilància de tumors dependents de cèl·lules NK d'una manera robusta i eficient (20). Hem trasplantat subcutàniament cèl·lules de limfoma RMA-Rae1 als dos flancs dels ratolins Jak1fl/+ i Jak1fl/+Ncr1Cre. La manca d'un al·lel de Jak1 va deteriorar la capacitat de les cèl·lules NK per controlar el creixement del tumor, tal com es mostra amb l'augment de la mida del tumor (figura 5A) i el pes del tumor a Jak1fl / + Ncr1Cre (figura 5B). En línia, aquests tumors van mostrar una infiltració de cèl·lules NK significativament reduïda (figures 5C, D). No vam poder detectar cap diferència en la freqüència de cèl·lules NK infiltrades amb tumors NKG2D + (figura 5E), que són crucials per al reconeixement dels tumors RMA-Rae1. En resum, els nostres resultats mostren que el nombre reduït de cèl·lules NK combinat amb una funcionalitat deteriorada de cèl·lules NK en ratolins Jak1fl / + Ncr1Cre són suficients per afectar significativament el control del creixement del tumor in vivo.

FIGURA 5|La pèrdua d'un al·lel de Jak1 perjudica la vigilància del tumor. (A, B) Els ratolins Jak1fl/+ i Jak1fl/+Ncr1Cre es van injectar sc amb 106 cèl·lules RMA-Rae1 i després de 10 dies es va avaluar el pes del tumor. Es mostren (A) imatges representatives del tumor i (B) gràfics de punts amb línies horitzontals que representen els pesos mitjans del tumor ± SEM de 2 experiments independents; n=6–8 (C, D) Les cèl·lules NK infiltrades en tumors es van analitzar mitjançant citometria de flux. (C) Es mostren gràfics representatius de cèl·lules CD3-NKp46+ infiltrades en tumors i el seu percentatge entre les cèl·lules Rae1-. (D) El nombre total de cèl·lules CD3−NKp46+ infiltrades en tumors per gram de tumor i (E) els percentatges de cèl·lules NKG2D + NK es presenten com a gràfics de barres que mostren la mitjana ± SEM d'un experiment n=4- 5. ***p <0,001.

DISCUSSIÓ

La desregulació de la via de senyalització JAK-STAT està estretament associada amb el desenvolupament del càncer, així com amb els trastorns immunològics (7). La primera malaltia lligada a JAK descoberta va ser la deficiència immune combinada severa (SCID) que es va caracteritzar per anomalies de cèl·lules NK causades per mutacions LOF JAK3 (26, 27). Aquí mostrem que la supressió de JAK1 a les cèl·lules NKp46+ condueix a una deficiència immune innata amb la pèrdua de cèl·lules NK i ILC1 als òrgans perifèrics, mentre que JAK2 és redundant per a la supervivència i la maduració de les cèl·lules NK. El nostre treball anterior va descobrir que la pèrdua de STAT5 a les cèl·lules NK condueix a una reducció severa del nombre de cèl·lules NK als òrgans perifèrics (18). La pèrdua de cèl·lules NK en ratolins Stat5fl/flNcr1Cre es va rescatar mitjançant l'expressió forçada de la molècula pro-supervivència BCL2 (28). Aquest estudi va definir STAT5 com un factor de supervivència crucial per a les cèl·lules NK. Els ratolins amb deficiència de STAT5B manquen en gran mesura de cèl·lules NK (29), d'acord amb el fet que STAT5 senyala aigües avall de les citocines que són vitals per a la biologia de les cèl·lules NK, com IL-2 o IL-15 (30). IL-15 és crucial per al desenvolupament i la supervivència de les cèl·lules NK, ja que els ratolins Il15-/- estan en gran part desproveïts de cèl·lules NK perifèriques (31). IL-15 senyala mitjançant un complex receptor de la cadena del receptor c, IL-2R i IL-15r (32). Els ratolins knockout de cada cadena de receptors demostren un paper absolutament crític per als senyals enviats aigües avall de IL-15 per al desenvolupament de cèl·lules NK (33, 34). Fins ara, la contribució de JAK3 associada a c al desenvolupament de cèl·lules NK ha estat ben establerta. Els ratolins amb deficiència de JAK3 mostren un fenotip SCID similar a l'observat en pacients humans i el desenvolupament de cèl·lules NK es bloqueja en l'etapa pre-NK progenitora (35, 36). Ara col·loquem el JAK1 menys apreciat anteriorment com a part crucial de l'eix IL-15/STAT5 a les cèl·lules NK. Les cèl·lules NK Jak1fl/flNcr1Cre mostren un bloc de desenvolupament a l'etapa de cèl·lules iNK i una pèrdua gairebé completa de cèl·lules NK als òrgans perifèrics.

Curiosament, les conseqüències de la supressió de JAK1 per a les cèl·lules NK superen els efectes de la deficiència de STAT5-. El deteriorament de l'activació combinada de STAT3 i STAT5 pot ser la base de la pèrdua més pronunciada de cèl·lules NK, ja que s'ha demostrat que STAT3 indueix l'expressió del gen crucial de supervivència de les cèl·lules NK Mcl1 (37, 38). Alternativament, JAK1 i STAT5 poden tenir vides mitjanes diferents que expliquen diferents freqüències de "només deletors": cèl·lules NK que acaben de perdre el gen però que encara porten la proteïna, cosa que pot explicar les diferències. L'efecte de dosificació gènica de la deficiència de JAK1-es reflecteix en el nombre de cèl·lules NK, mentre que la pèrdua d'un al·lel de JAK1 és prescindible per a la maduració de cèl·lules NK. Això suggereix que STAT5 activat limita la velocitat per a la supervivència de les cèl·lules NK, però no la maduració. La supressió d'un al·lel de Jak1 també és suficient per deteriorar significativament la vigilància del tumor basada en un nombre reduït de cèl·lules NK combinada amb una funcionalitat disminuïda de les cèl·lules NK restants. D'acord amb les nostres dades, la supressió específica de cèl·lules NK del gen objectiu STAT5 Mcl1 condueix a una deficiència greu de cèl·lules NK que provoca un augment significatiu de la càrrega metastàtica (38).

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Els JAK poden presentar funcions redundants i compensar-se entre ells. Avall del receptor d'interferó JAK1 pot compensar parcialment la pèrdua de l'activitat de la cinasa JAK2 (39). També s'ha demostrat que JAK2 fosforila STAT5 aigües avall d'IL-15 durant la diferenciació in vitro de cèl·lules NK (16). D'altra banda, JAK2 constitutivament actiu només pot compensar modestament la pèrdua de JAK1 a les cèl·lules mare, cosa que suggereix un paper no redundant de JAK1 i 2 en HSC. En línia, observem que en absència de JAK1, JAK2 no compensa en l'activació de STAT5, fins i tot sota una alta dosi d'IL-2 in vitro, per permetre la supervivència de les cèl·lules NK. Queda per dilucidar si es poden aconseguir efectes compensatoris expressant una forma constitutivament activa de JAK2. Més important encara, mostrem que la pèrdua de JAK2 a les cèl·lules NKp46+ és prescindible per a la supervivència de les cèl·lules NK. Les cèl·lules NK2-deficients de JAK estan completament madures, cosa que demostra que la JAK2 intrínseca de les cèl·lules NK no està impulsant la maduració de les cèl·lules NK. Això també indica que la maduració deteriorada de les cèl·lules NK en els ratolins Jak2fl/flMx1Cre (14) és probablement causada per les funcions extrínseques de les cèl·lules NK de JAK2. Es podria especular que la supressió constitutiva de JAK2 altera el medi de citocines.

REFERÈNCIES

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Cèl·lules assassines naturals: desenvolupament, maduració i utilització clínica. Front Immunol. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Taronja JS. Deficiència de cèl·lules assassines naturals. J Allergy Clin Immunol. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK i molècules de senyalització STAT en immunoregulació i malaltia immune mediada. Immunity (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Stark GR, Darnell JE. La via JAK-STAT als vint. Immunity (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Shuai K, Liu B. Regulació de la senyalització JAK-STAT al sistema immunitari. Nat Rev Immunol. (2003) 3:900–11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAK i STAT en immunitat, immunodeficiència i càncer. N Engl J Med. (2013) 368:161–70. doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Citocina (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [Epub abans de la impressió].

8. Lorenzini T, Dotta L, Giacomelli M, Vairo D, Badolato R. Mutacions STAT com a commutadors de programes: convertir les immunodeficiència primàries en malalties autoimmunes. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G, et al. Jak1 té un paper dominant sobre Jak3 en la transducció del senyal mitjançant receptors de citocines que contenen c. Chem Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Eletto D, Burns SO, Angulo I, Plagnol V, Gilmour KC, Henriquez F, et al. Mutacions bial·lèliques de JAK1 en pacients immunodeficients amb infecció per micobacteris. Nat Commun. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, et al. La interrupció del gen Jak1 demostra els papers obligatoris i no redundants dels Jaks en les respostes biològiques induïdes per citocines. Cell (1998) 93:373–83.

12. Kleppe M, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi E, et al. Jak1 Integra la detecció de citocines per regular la funció de les cèl·lules mare hematopoètiques i l'hematopoiesi d'estrès. Cell Stem Cell (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Schwartz DM, Kanno Y, Villarino A, Ward M, Gadina M, O'Shea JJ. La inhibició de JAK com a estratègia terapèutica per a malalties immunològiques i inflamatòries. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos A, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli A, Frei A, Tzankov A, et al. La disminució de la immunovigilància del tumor de cèl·lules NK com a conseqüència de la inhibició de JAK millora la metàstasi en models de càncer de mama. Nat Commun. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Schönberg K, Rudolph J, Vonnahme M, Parampalli Yajnanarayana S, Cornez I, Hejazi M, et al. La inhibició de JAK perjudica la funció de les cèl·lules NK en les neoplàsies mieloproliferatives. Càncer Res. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Kim WS, Kim MJ, Kim DO, Byun JE, Huy H, Song HY, et al. El supressor de la senyalització de citocines 2 regula negativament la diferenciació de cèl·lules NK mitjançant la inhibició de l'activitat JAK2. Ciència Rep. (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Krempler A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Generació d'un al·lel knockout condicional per al gen Janus kinase 2 (Jak2) en ratolins. Gènesi (2004) 40:52–7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart E, Warsch W, Zebedin E, Simma O, Stoiber D, Kolbe T, et al. Un nou ratolí Ncr1 -Cre revela el paper essencial de STAT5 per a la supervivència i el desenvolupament de les cèl·lules NK. Blood (2011) 117:1565–74. doi: 10.1182/sang-2010-06-291633

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C, et al. La inactivació de Stat5 a l'epiteli mamari del ratolí durant l'embaràs revela diferents funcions en la proliferació, supervivència i diferenciació cel·lular. Mol Cell Biol. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.8037-8047.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. L'expressió ectòpica del gen -1 d'inducció precoç de l'àcid retinoic (RAE-1) permet el rebuig mediat per cèl·lules assassines naturals d'un tumor de classe I de MHC in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. (2001) 98:11521–6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz E, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar A, Wirth S, Berger A, et al. La fosforilació STAT1-S727 mediada per CDK8-restringeix la citotoxicitat de les cèl·lules NK i la vigilància del tumor. Cell Rep. (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Geiger TL, Sun JC. Desenvolupament i maduració de cèl·lules assassines naturals. Curr Opin Immunol. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel M, Artyomov MN, Ivanova Y, et al. Les cèl·lules assassines naturals (NK) residents en teixits són llinatges cel·lulars diferents de les cèl·lules NK esplèniques tímiques i convencionals. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng H, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei H, Gao X, et al. Les cèl·lules NK residents al fetge confereixen immunitat adaptativa en la inflamació de contacte amb la pell. J Clin Invest. (2013) 123:1444–56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Martinet L, Ferrari De Andrade L, Guillerey C, Lee JS, Liu J, Souza-Fonseca Guimaraes F, et al. L'expressió DNAM-1 marca un programa alternatiu de maduració de cèl·lules NK. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F, et al. Mutacions del gen Jak-3 en pacients amb deficiència immune combinada severa autosòmica (SCID). Nature (1995) 377(6544):65–8.

27. Russell SM, Tayebi N, Nakajima H, Riedy MC, Roberts JL, Aman MJ, et al. Mutació de Jak3 en un pacient amb SCID: paper essencial de Jak3 en el desenvolupament limfoide. Science (1995) 270:797–800.

28. Gotthardt D, Putz EM, Grundschober E, Prchal-Murphy M, Straka E, Kudweis P, et al. STAT5 és un regulador clau de les cèl·lules NK i actua com a canvi molecular de la vigilància del tumor a la promoció del tumor. Càncer Discov. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino A V., Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti B, Robinson GW, et al. Els llindars STAT5 definits per subconjunts i teixits controlen l'homeòstasi i la funció de les cèl·lules limfoides innates. J Exp Med. (2017) 214:2999–3014. doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais A, Viel S, Grau M, Henry T, Marvel J, Walzer T. Regulació del desenvolupament i funció de les cèl·lules NK del ratolí per citocines. Front Immunol. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M, et al. Defectes reversibles en llinatges de cèl·lules T CD8 d'assassins naturals i de memòria en ratolins amb deficiència d'interleucina 15-. J Exp Med. (2000) 191:771–80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ikemizu S, Chirifu M, Davis SJ. Complexos de senyalització IL-2 i IL-15: diferents però iguals. Nat Immunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett M, et al. Diferenciació de cèl·lules assassines naturals: coneixements a partir de models de ratolins transgènics i knockout i sistemes in vitro. Immunol Rev. (1998) 165:47–61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, et al. El receptor IL-15 manté l'homeòstasi limfoide donant suport a l'home i la proliferació dels limfòcits. Immunity (1998) 9:669–76.

35. Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, et al. Defectes de desenvolupament de cèl·lules limfoides en ratolins amb deficiència de cinasa Jak3. Immunity (1995) 3:771–82.

36. Robinette ML, Cella M, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder K, et al. La deficiència de Jak3 bloqueja el desenvolupament innat de cèl·lules limfoides. Immunol de la mucosa. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD, et al. El sorafenib sensibilitza els tumors sòlids als anticossos agonistes del receptor Apo2L/TRAIL i Apo2L/TRAIL mitjançant l'eix Jak2-Stat3-Mcl1. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ, et al. Immunodeficiència innata després de l'ablació genètica de Mcl1 en cèl·lules assassines naturals. Nat Commun. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil E, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling M, Liebfried P, Strobl B, et al. Important funció de bastida de la Janus quinasa 2 descoberta per un nou model de ratolí que alberga una mutació de bucle d'activació Jak2. Blood (2014) 123:520–9. doi: 10.1182/sang-2013-03-492157