Identificació i comparació sistemàtica dels perfils expressats de MiRNAs exosomals en porcs infectats amb NADC30-com la soca PRRSV

Resum simple:Els exosomes tenen un paper únic en la infecció per virus, la presentació d'antigens i la supressió/promoció de la immunitat corporal. El virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina (PRRSV) és un dels patògens més nocius de la indústria porcina. Aquí, hem utilitzat la soca PRRSV NADC30-com CHsx1401 per infectar artificialment 42-porcs d'un dia d'edat, aïllar exosomes sèrics i identificar 33 miRNAs exosomals expressats de manera significativa (DE) entre els grups d'infecció i control, i Es van examinar 18 miRNAs DE associats a la infecció i immunitat per PRRSV com a molècules funcionals potencials implicades en la regulació de la infecció per virus PRRSV per part dels exosomes.

Resum:Els exosomes són vesícules biològiques secretades i alliberades per cèl·lules que actuen com a mediadores de la comunicació intercel·lular i tenen un paper únic en la infecció per virus, la presentació d'antigens i la supressió/promoció de la immunitat corporal. El virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina (PRRSV) és un dels patògens més nocius de la indústria porcina i pot causar trastorns reproductius en truges, malalties respiratòries en porcs, reducció del rendiment del creixement i altres malalties que provoquen la mortalitat porcina. En aquest estudi, hem utilitzat la soca PRRSV NADC30-com CHsx1401 per infectar artificialment 42-porcs d'un dia i aïllar els exosomes sèrics. A partir de la tecnologia de seqüenciació d'alt rendiment, es van identificar 305 miRNAs en exosomes sèrics abans i després de la infecció, entre els quals 33 miRNAs es van expressar de manera significativament diferent entre grups (13 relativament regulats i 20 relativament baixats). L'anàlisi de conservació de la seqüència del genoma CHsx1401 va identificar 8 regions conservades, de les quals es va predir que un total de 16 miRNAs expressats de manera diferent (DE) s'uneixen a la regió conservada més propera a les 3.0 UTR del genoma CHsx1401, inclosos 5 miRNA DE capaços d'unir-se al CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Una anàlisi addicional va revelar que els gens objectiu dels miRNAs expressats de manera diferencial estaven àmpliament implicats en vies de senyalització relacionades amb la funció exosomal i la immunitat innata, i 18 miRNAs DE (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, etc.) associats amb la infecció i la immunitat del PRRSV com a molècules funcionals potencials implicades en la regulació de la infecció pel virus PRRSV per exosomes.

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

Paraules clau:PRRSV; exosoma sèric; miRNAs

1. Introducció

El virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina (PRRSV) és un virus d'ARN de cadena positiva monocatenària amb una estructura d'embolcall que pertany a l'ordre Nidovirales, família Arteriviridae, gènere Betaarterivirus [1,2]. És esfèric o el·lipsoïdal amb un diàmetre de 50-65 nm sota un microscopi electrònic de congelació [3,4]. El genoma del PRRSV té una longitud d'uns 15 kb amb una tapa de 50 i una cua de 30 poliA i conté almenys 10 marcs de lectura oberts (ORF) flanquejats per regions no traduïdes (UTR) tant als extrems 50 com als 30 [5, 6] i està embolicat per proteïna nucleocàpsida, amb un recobriment de doble capa lipídica per formar partícules de virus. Els exosomes pertanyen a vesícules amb estructures de membrana monocapa i tenen la mateixa estructura topològica que les cèl·lules [7]. La forma és "en forma de copa" o "en forma de disc" sota un microscopi electrònic [8, 9]. Els exosomes poden existir al sistema circulatori durant molt de temps, i les substàncies dels exosomes poden ser absorbides per cèl·lules adjacents o cèl·lules receptores distants i després regular les cèl·lules receptores per participar en l'intercanvi de materials genètics entre cèl·lules [10,11]. Es componen principalment de substàncies superficials de membrana i continguts transportats, inclosos receptors de la superfície cel·lular, proteïnes de membrana, proteïnes solubles, lípids, ARN (ARNm, miRNA, lncRNA i ARN viral, etc.), ADN genòmic, ADN mitocondrial [12–14] ]. Els microARN (miRNAs) són una classe de 18-25 nucleòtids (nt) conservats evolutivament d'ARNm petits no codificants endògens, que inhibeixen el procés de traducció induint la degradació de l'ARNm objectiu o unint-se amb 30 UTR d'ARNm objectiu, el que porta al silenciament gènic post-transcripcional, i després regulant l'expressió gènica a nivell post-transcripcional [15–17]. S'estima que els miRNA regulen més del 60% dels gens de mamífers post-transcripcional [18,19]. Els miRNA tenen un paper important en la comunicació intercel·lular i també es poden utilitzar com a molècula funcional potencial per a la infecció, la transmissió i la defensa de malalties i virus [20]. Un nombre creixent d'estudis han demostrat que els miRNA poden estar presents en fluids corporals, com la saliva, l'orina, la llet materna i la sang, i actuar a través del sistema circulatori de fluids corporals [21,22]. Els miRNA exosomals es consideren reguladors endògens de l'expressió gènica i el metabolisme i poden indicar diverses condicions patològiques [23,24].

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Durant les últimes dues dècades, s'ha demostrat que els miRNA tenen un paper crucial en la regulació del desenvolupament de les cèl·lules immunitàries, les respostes immunes innates i les respostes immunes adquirides. S'ha informat que alguns altres miRNAs perjudiquen la infecció per PRRSV de les maneres següents, dirigeixen directament el genoma de PRRSV o el receptor de PRRSV, o juguen un paper regulant la resposta immune innata de l'hoste. La família miR-26 pot danyar significativament la replicació del virus, i miR-26a pot inhibir la replicació de les soques de PRRSV tipus 1 i tipus 2 en macròfags alveolars porcins (PAM) mitjançant la regulació de l'interferó tipus I (IFN) via, que és més eficient que miR-26b [25,26]. S'identifiquen miR-30c i miR{-125b per modular la resposta immune innata de l'hoste dirigint-se a la via IFN tipus I i a la via NF-κB, respectivament [27–29]. MiR-23, miR{-378 i miR-505 són factors hostes antivirals dirigits a PRRSV i tenen llocs objectiu conservadors a les soques de PRRSV tipus 2 [30]. Al mateix temps, s'ha identificat miR-506 hoste per inhibir la replicació de PRRSV dirigint-se directament al receptor CD151 de PRRSV a les cèl·lules MARC-145 [31]. miR-181 també pot inhibir indirectament la replicació de PRRSV regulant a la baixa el receptor CD163 de PRRSV en monòcits sanguinis i PAM [32]. A més, els miRNA poden promoure la replicació del PRRSV interferint amb la fisiologia cel·lular bàsica. MiR-24-3p i miR-22 s'orienten directament a 30 UTR de HO-1 durant la infecció per PRRSV per escapar de la inhibició de l'hemoxigenasa-1 (HO-1), una proteïna de xoc tèrmic (també coneguda com HSP32) a PRRSV [33,34]. Se sap que els porcs són més susceptibles al PRRSV i menys capaços de defensar-se contra l'entrada d'aquest patogen a l'organisme [35]. En el present estudi, la immunitat innata i la immunitat adquirida dels porcs infectats amb aquest virus es van estudiar a nivell molecular utilitzant una soca predominant al camp. Es va utilitzar un kit d'aïllament d'exosomes sèrics, microscòpia electrònica de transmissió (TEM), anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA) i Western blot (WB) per aïllar i identificar exosomes sèrics abans i després de la infecció amb PRRSV, seguit d'una petita anàlisi de seqüenciació d'ARN, identificació, i anàlisi dels resultats d'expressió diferencial mitjançant mètodes bioinformàtics per obtenir diversos miRNAs d'exosomes sèrics associats a PRRSV, seguit de la identificació dels resultats de les dades mitjançant PCR quantitativa en temps real (qRT-PCR).

2. Materials i Mètodes

2.1. Experiments amb animals

Es van col·locar sis porcs blancs grans d'un dia d'edat i d'antigen PRRSV i anticossos doble negatius 42-al sistema d'alimentació neta dels porcs per aïllar-los, assistència sanitària i adaptació ambiental. Tots els porcs eren lliures de menjar i beure sense restriccions. Quan estaven familiaritzats amb les condicions de l'aïllador, els porcs van ser inoculats per via nasal amb 2 ml 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-com CHsx1401, que es va esmentar pels predecessors [36,37]. La sang dels porcs abans (grup control, n=6) i 7 dies després (grup de tractament, n=6) de la inoculació del virus es va recollir de la vena cava anterior per aïllar el sèrum. Les restes cel·lulars del sèrum es van eliminar mitjançant centrifugació a 3000 g durant 15 min. Tots els experiments amb animals del nostre estudi van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal de l'Institut de Ciències Animals, Acadèmia Xinesa de Ciències Agràries (CAAS) (Beijing, Xina), IAS2022-130.

2.2. Aïllament i purificació d'exosomes sèrics

L'aïllament i la purificació d'exosomes es van dur a terme mitjançant el kit exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, Alemanya, núm. cat. 76064) segons el protocol del fabricant.

2.3. Microscòpia electrònica de transmissió (TEM)

Les suspensions d'exosomes extretes es van detectar a la malla de coure recoberta de carboformvar i es van esbandir els exosomes amb PBS i es van sotmetre a una tinció estàndard d'acetat d'uranil durant 3 minuts a temperatura ambient. Després d'assecar-se durant uns quants minuts a temperatura ambient, la graella es va visualitzar i fotografiar a 100 kV per microscopi electrònic de transmissió (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tòquio, Japó).

2.4. Anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA)

Els exosomes extrets es van diluir amb 1 × PBS canviant el volum de 10 a 30 µL. Després de provar la mostra, la concentració i la mida dels exosomes sèrics es van analitzar mitjançant un nanoanalitzador de flux N30E seguint les instruccions del fabricant (NanoFCM, Xiamen, Xina).

2.5. Western Blot

Les mostres d'exosoma extretes es van afegir al lisat RIPA barrejat amb inhibidor de proteasa (Invitrogen, Waltham, MA, EUA) i fluorur de fenilmetilsulfonil (PMSF) per extreure la proteïna de l'exosoma, que es va lisar en gel durant 30 min. Després, segons les instruccions del kit de Bradford, vam quantificar la concentració de proteïna sèrica exosoma. Les proteïnes exosomes van patir una desnaturalització tèrmica. La mateixa quantitat de proteïna es va separar en gel SDS-PAGE al 12% i després es va transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, EUA). Es va remullar amb TBST que contenia un 5% de llet desnatada en pols i es va segellar durant 1 h a temperatura ambient. Vam remullar la membrana a l'anticòs primari diluït (anticòs anti-CD9, Abcam, Boston, MA, EUA, #ab92726; anticòs anti-CD81, Abcam, Boston, MA, EUA, #ab109201) durant la nit a 4 ◦C i ens vam recuperar. l'anticòs primari. Vam remullar la membrana amb l'anticòs secundari diluït, la vam incubar a temperatura ambient durant 1 h i vam recuperar l'anticòs secundari. Vam col·locar la pel·lícula rentada de PBST a la pel·lícula de conservació fresca, vam afegir una solució cromogènica ECL a/b mixta de volum igual i la vam col·locar a la imatge de quimioluminescència.

Beneficis de cistanche per a homes enforteixen el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Seqüenciació d'ARN petit exosomal i anàlisi de dades

L'ARN total dels exosomes es va extreure amb Trizol segons les instruccions del fabricant. A continuació, vam detectar la concentració d'ARN i el valor de densitat òptica (OD) i vam detectar la degradació i la puresa de l'ARN amb electroforesi en gel d'agarosa a l'1%. Mentrestant, es va utilitzar Agilent Bioanalyzer 2100 per detectar la integritat de l'ARN. Hem utilitzat l'ARN total dels exosomes després de la inspecció de qualitat. D'acord amb les instruccions del fabricant, vam utilitzar el conjunt de preparació de biblioteques d'ARN petits multiplex NEB NEXT per Illumina® (Illumina, San Diego, CA, EUA). El kit va preparar una petita biblioteca d'ADNc d'ARN i la va seqüenciar per produir 50 nt lectures d'un sol extrem mitjançant la plataforma Illumina Novaseq 6000. Tots els procediments per a la preparació de petites biblioteques d'ARN van ser realitzats per Novogene (Beijing, Xina). Les dades després del control de qualitat es van alinear amb el genoma de referència porcí (Sus scrofa 11.1) mitjançant corbata. Els miRNAs coneguts van ser identificats per la base de dades miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, consultat el 14 de gener de 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] i miRevo (v1.1). ) [40] i es van utilitzar per predir nous miRNAs. Al mateix temps, DESeq (v1.24.0) [41] va realitzar l'anàlisi d'expressió diferencial dels miRNAs, requerint |canvi de plecs| > 1,6 i p < 0,05. L'alineació es va realitzar mitjançant MEGA (V11) [42] seguit d'una puntuació de base única mitjançant PHAST (v1.6.9) [43] i l'avaluació de les regions més conservades de 10 gens del virus, incloent WUH3 (núm. d'accés GenBank HM853973), VR2332 ( GenBank núm. d'accés U87392), JXA1 (GenBank núm. d'adhesió EF112445), CH-1a (GenBank núm. d'adhesió AY032626), NADC30 (GenBank núm. d'adhesió HN654459), HUN4 (GenBank núm. d'adhesió EF6350D6), HLJZ06 22-1812 (núm. d'adhesió de GenBank MN648450), SC/DJY (núm. d'adhesió de GenBank, MT075480) i Lelystad (núm. d'adhesió de GenBank M96262.2). Es va utilitzar RNAhybrid (V2.0) [44] per predir la unió de la seqüència de miRNA identificada a la 3 0 UTR del genoma del virus CHsx1401. Miranda (v3.3a) i RNAhybrid es van utilitzar per orientar la predicció de gens. El paquet de perfil de clúster [45] R es va utilitzar per a l'anàlisi d'enriquiment funcional GO (Gene Ontology) dels gens diana i l'anàlisi d'enriquiment de la via KEGG (Enciclopèdia de Kyoto de gens i genomes).

2.7. Validació de l'expressió de miRNA per RT-qPCR

L'ARN total es va aïllar dels exosomes sèrics mitjançant Trizol (Invitrogen, Xangai, Xina) segons el protocol del fabricant. L'ARN aïllat es va verificar mitjançant RT-qPCR en mostres (n=6 per grup). L'ADNc es va sintetitzar d'acord amb les instruccions del kit de síntesi d'ADNc de la primera cadena de miRNA (per llaç de tija) (Vazyme, Nanjing, Xina) i la quantificació de fluorescència es va realitzar mitjançant ABI 7500 segons el instruccions de la mescla mestra de miRNA universal SYBR qPCR (Vazyme, Nanjing, Xina). Els paràmetres del cicle tèrmic utilitzats van ser els següents: la primera etapa: 95 ◦C durant 30 s; Etapa 2: 95 ◦C durant 5 s, 60 ◦C durant 34 s i 40 cicles; Etapa 3: 95 ◦C durant 15 s, 60 ◦C durant 1 min i 95 ◦C durant 15 s. Les seqüències de primers de miRNAs, el gen U6, es van utilitzar com a referència [46] i es van enumerar a la taula complementària S1. Totes les verificacions qRT-PCR es van realitzar mitjançant tres rèpliques biològiques i amb tres rèpliques per a cada mostra. L'abundància relativa de transcripcions es va calcular mitjançant el mètode 2-Ct, i es van utilitzar SPSS (v22.0) i GraphPad Prism (v8.0) per a l'anàlisi de dades i el mapeig, respectivament. p < 0,05 significa que la diferència és estadísticament significativa.

3. Resultats

3.1. Valor relatiu de l'antigen i anticossos després de la inoculació del virus

Els resultats de les proves d'antigen i anticossos del PRRSV abans (dia 0) i després del repte (dia 7) es mostren a la taula 1. La detecció serològica de l'antigen i anticossos del PRRSV abans del desafiament va ser negativa i l'antigen va ser positiu després del repte, cosa que indica que els porcs es van infectar amb èxit amb CHsx1401.

3.2. Aïllament i identificació d'exosomes sèrics

Les vesícules aïllades del sèrum van ser descobertes per TEM. La majoria de les vesícules poden veure els exosomes còncaus en forma de plat o disc al mig. La vora de la membrana dels exosomes és visible i la morfologia és relativament completa (figura 1A, B). L'anàlisi de seguiment de nanopartícules va mostrar que el 95, 73% dels exosomes tenien un diàmetre de 30-150 nm, principalment al voltant de 72, 25 nm, amb un diàmetre mitjà de 76, 22 nm, que era coherent amb les característiques de mida dels exosomes (figura 1C). Aquest rang de mida era similar al detectat per TEM i va confirmar encara més la identitat d'aquestes vesícules com a exosomes. L'anàlisi de Western blot va mostrar que les vesícules aïllades de les mostres de sèrum eren positives per a les proteïnes CD9 i CD81 (figura 1D). Les característiques anteriors s'ajusten als estàndards d'identificació d'exosomes formulats per la International Society for Extrace Vesicles (ISEV) a MISEV2018 [47].

Taula 1. Antigen i anticossos de (dia 0) i (dia 7) amb virus de desafiament.

Figura 1. Característiques principals dels exosomes sèrics. (A, B) mostren les característiques morfològiques de les vesícules per TEM. Les barres d'escala són de 500 nm i 100 nm, respectivament. (C) NTA mostra el diàmetre i la concentració de la majoria de vesícules. (D) Western blot va mostrar la presència de marcadors exosomes CD81 i CD9 als exosomes sèrics. Nota: La barreja dels resultats de WB és la suspensió mixta de mostra aïllada pel kit exoEasy Maxi

3.3. Seqüenciació d'ARN petit d'exosomes sèrics

Per a cada mostra, les dades netes van assolir 0,5 Gb i el percentatge de base Q30 era superior al 96,20%. Les lectures netes de cada mostra es van alinear amb el genoma de referència del porc. Entre les 12 mostres, el grup control va obtenir 10.920.887, 10.248.696, 10.109.117, 10.655.494, 9.217.285 i 9.782.523 lectures, respectivament. El grup de tractament va obtenir 11.889.518, 10.593.504, 10.593.504, 12.846.080, 10.105.325, 11.729.451 i 9.789.542 lectures, respectivament. De mitjana, el 77, 96% del total de lectures netes comprenien entre 19 i 22 nucleòtids (nt) de longitud (figura 2A). Les lectures després del control de qualitat van representar més del 92,59% del total de lectures. Les lectures netes processades es van alinear amb el genoma de referència porcí i la taxa de mapeig de 12 biblioteques del genoma era superior al 92, 30% i la taxa de mapeig era del 94, 98% (figura 2B). Va indicar que la biblioteca de miRNA exosomal sèric construïda era d'alta qualitat i adequada per a una anàlisi posterior. Els detalls es mostren a la taula complementària S2.

Figura 2. Visió general de les dades del transcriptoma d'ARN petit. (A) Distribució de longitud dels recomptes de lectura de mostres d'exosomes sèrics (nucleòtids nt =); (B) taxa de 12 mostres assignades al genoma de referència

3.4. Anàlisi d'expressió diferencial de miRNAs

Després de l'anàlisi quantitativa de l'expressió de miRNA identificada, es van examinar els miRNA segons els llindars descrits anteriorment a la secció 2.6. Es van obtenir un total de 305 miRNA abans i després de la inoculació de la soca CHsx1401 (control, n=6; tractament, n=6). Es van identificar un total de 33 miRNAs expressats de manera diferent (DE) entre els dos grups, 13 miRNAs DE es van regular a l'alça i 20 miRNAs DE es van regular a la baixa al grup de tractament (figura 3 i taula suplementària S3).

3.5. Anàlisi d'enriquiment funcional dels gens diana de miRNA

Un total de 7283 gens objectiu van ser predits per 33 DE miRNAs, i les funcions dels gens objectiu es van concentrar principalment en la regulació positiva de la cascada MAPK, el procés de metabolisme dels lípids, la regulació de la transducció del senyal intracel·lular, la cascada ERK1 i ERK2, etc. (Figura 4A). ). Pel que fa a les funcions moleculars, els gens diana de miRNA expressats de manera diferent se centren principalment en l'activitat reguladora de l'enzim GTP, l'activitat de la cinasa, l'activitat reguladora de la nucleòsid trifosfatasa i altres funcions relacionades amb la transducció del senyal i el metabolisme energètic (figura 4B). A més, entre els components cel·lulars, els gens diana participen principalment en les funcions biològiques dels polímers supramoleculars, Golgi, autofagosomes, superfície cel·lular, endosomes primerencs, etc. (Figura 4C). Les funcions d'aquests components estan estretament relacionades amb la formació d'exosomes, la qual cosa també explica la precisió de la seqüenciació. L'anàlisi d'enriquiment de la via KEGG va demostrar que els gens objectiu es van enriquir significativament en endocitosi, la via de senyalització MAPK, la via de senyalització Rap1, la via de senyalització d'esfingolípids i la via de senyalització PI3K Akt (p <0.05) (Figura 5A) ). Al mateix temps, es van classificar i analitzar les vies enriquides. Els resultats van mostrar que la via KEGG del gen objectiu es va enriquir principalment en processament d'informació ambiental, malalties humanes i sistemes biològics (figura 5B).

Figura 3. Expressió diferencial de miRNAs en exosomes. (A) Trama volcànica de miRNAs entre grups de control i tractament; (B) mapa de calor de agrupació jeràrquica de miRNAs DE entre grups de control i tractament.

Figura 4. Anàlisi d'enriquiment de la funció GO dels gens objectiu dels miRNAs DE. (A) Procés biològic dels gens objectiu dels miRNAs DE; (B) funcions moleculars dels gens objectiu dels miRNA DE; (C) components cel·lulars dels gens objectiu dels miRNA DE

Figura 5. Anàlisi d'enriquiment de la via KEGG dels gens diana. (A) Via KEGG significativament enriquida amb gens diana de miRNAs DE; (B) classificació de vies KEGG significativament enriquides.

3.6. Predicció d'orientació del genoma sèric de miRNA exosomal i PRRSV CHsx1401

Segons la puntuació de phastCons d'una sola base després de l'alineació per PHAST, es van obtenir un total de vuit segments més conservats (bandes negres per sobre del mapa del pic) entre els genomes virals (figura 6). Es va trobar que un total de 31 miRNA DE s'uneixen al segment conservat predint els miRNAs units al segment conservat. Entre ells, a la regió conservada (14.644–15.020 nt) més propera als 30 UTR (14.870–15.020) del genoma CHsx1401, es preveu que s'hi uneixin 16 miRNA DE, inclosos 5 miRNAs (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 i ssc-miR-6529) que es poden unir al 30 UTR de CHsx1401. Entre aquests miRNAs, només ssc-miR-223 es va regular a l'alça després de la infecció, i altres miRNAs es van reduir després de la infecció. Vegeu la taula complementària S4 per obtenir més informació.

Figura 6. Segments conservats en el genoma de la soca CHsx1401 predits per PHAST

3.7. Detecció de miRNAs DE relacionats amb la funció exosoma i el PRRSV

Es van trobar una varietat de miRNAs expressats de manera diferencial relacionats amb la funció dels exosomes i el PRRSV mitjançant l'anàlisi d'enriquiment funcional dels gens diana. Entre ells, 11 DE miRNAs com ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 i ssc-miR{-320 estan implicats en l'absorció d'exosomes, i els seus gens objectiu es concentren principalment en la família del gen Ras, la família de les annexines i la família del gen de la ribosilació de l'ADP. Divuit miRNA DE, inclosos sscmiR-10b, ssc-miR-124a i ssc-miR{-128, participen en vies relacionades amb el sistema immunitari i els seus gens objectiu es concentren principalment al MAPK família de gens, família de gens PIK3 i família de gens de proteïna fosfatasa. Tot i que 11 miRNA DE estan implicats en la invasió del virus, els gens objectiu relacionats es concentren principalment a la família de gens MAPK i a la família de gens de la proteïna fosfatasa. A més, diversos miRNA expressats de manera diferent, com ara el nou_102. Sis DE miRNA, inclosos ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-7137-3p i ssc-miR{{ 25}}, s'expressen conjuntament en la funció exosoma, la invasió del virus del PRRSV i les vies relacionades amb el sistema immunitari, tal com es mostra a la figura 7. Els detalls es mostren a la taula complementària S5.

Figura 7. MiRNAs DE relacionats amb la captació d'exosomes, la invasió del PRRSV i la immunitat

3.8. Assaig QRT-PCR de miRNAs DE entre els dos grups

Cinc DE miRNAs es van seleccionar aleatòriament per a la verificació. Segons els resultats de qRT-PCR, l'expressió de ssc-miR-19a i ssc-miR-32 va augmentar en el grup de tractament, mentre que ssc-miR-124a, ssc-miR{{ {8}} i ssc-miR-34c van mostrar una expressió més alta al grup control, d'acord amb les dades de seqüenciació (figura 8).

Figura 8. Cinc DE miRNAs validats per qRT-PCR

4. Discussió

El PRRSV encara és un patogen tossut a la indústria mundial del porc, causant grans pèrdues econòmiques al món. Actualment, la vacunació s'utilitza principalment per prevenir i controlar el PRRSV, entre les quals la vacuna del virus viu modificat (MLV) és la més utilitzada [48]. Tot i que aquesta vacuna va ser eficaç per reduir els brots i la incidència de PRRS, també va augmentar molt la variació genètica i la diversitat del virus i va provocar una recombinació viral entre virus salvatges i vius de la vacuna al camp [49,50]. En els darrers anys, la propagació i la prevalença del virus recombinant NADC30-com la soca PRRSV han provocat múltiples brots de síndrome reproductiva i respiratòria porcina a la Xina. La similitud entre CHsx1401 i NADC30 utilitzat en aquest estudi es va mantenir entre el 92,2 i el 99,1%. Des de llavors, s'ha convertit en una soca epidèmica a la Xina. Els exosomes, com a mediadors de la comunicació cel·lular, es troben àmpliament en diversos fluids corporals i tenen avantatges únics en el diagnòstic i el tractament de la malaltia [51,52]. Segons informes anteriors, els exosomes tenen un paper important en la comunicació en la presentació d'antigen [53], resposta immune [53,54], replicació del virus [54], càncer [55], malalties neurodegeneratives [56], angiogènesi [57], cèl·lules tumorals migració [58] i invasió [59], i tenen un alt valor de recerca.

En aquest estudi, es va utilitzar la tecnologia de seqüenciació d'alt rendiment per construir el perfil d'expressió de miRNA dels exosomes sèrics i es van identificar 33 miRNAs DE. Com tots sabem, el miRNA codificat per l'hoste pot unir-se amb el genoma viral i després regular la replicació, la síntesi i l'alliberament del virus per limitar la infecció i afectar el procés patològic [15]. També s'han informat repetidament estudis de miRNA dirigits al genoma viral en animals. gga-miR-454 i gga-miR{-130b a la malaltia de la bursa infecciosa del pollastre poden dirigir-se al genoma viral per inhibir la replicació viral, mentre que gga-miR-21 s'adreça directament a la proteïna viral VP1 per inhibir traducció de proteïnes virals [60, 61]. En estudis de PRRSV, ssc-miR-181 s'uneix específicament a una regió altament conservada aigües avall del genoma viral ORF4 i inhibeix fortament la replicació de PRRSV [62]. En aquest estudi, la diferència d'expressió de ssc-miR-181 entre els dos grups no va assolir un nivell significatiu. En el nostre estudi, es van comparar els genomes de nou virus PRRSV diferents amb els de la soca CHsx1401 i es van identificar els vuit segments més conservats. Es va predir que 31 miRNAs DE podrien unir-se als 8 segments més conservats de CHsx1401 i 16 miRNAs DE podrien unir-se a les seqüències conservades properes als 30 UTR de CHsx1401. Entre ells, 5 miRNA DE (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 i ssc-miR{{{ 36}}) es pot unir simultàniament al CHsx1401 30 UTR. A més, es va predir que l'expressió augmentada de ssc-miR-223 s'unís a l'objectiu 30 UTR del genoma del PRRSV. Els resultats van mostrar que les seqüències conservades del genoma del virus podrien tenir un paper clau en la seva patogenicitat, i els miRNAs que es poden unir a les seqüències conservades entre els genomes de diferents soques de PRRSV poden tenir una importància important per controlar la patogenicitat del virus. S'ha demostrat que alguns miRNAs expressats de manera diferent estan relacionats amb PRRSV mitjançant estudis anteriors i fins i tot directament implicats en la regulació de PRRSV, incloent ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], det-7f{-5p [65], ssc-miR{-744 [66] i ssc-miR{{57 }}a [67].

El PRRSV pot evadir la defensa de l'hoste interferint amb la resposta immune innata. Aquest procés està regulat per moltes vies de senyalització, inclosa la via de senyalització MAPK, la via de senyalització PI3K Akt, l'autofàgia, la quimiocina i la via de senyalització TNF. Actualment, la via de senyalització MAPK inclou tres vies principals: via ERK1/2, JNK i p38. L'activació de la cascada MAPK pot promoure l'apoptosi de la cèl·lula hoste, ajudar el virus a escapar de la resposta de defensa immune de l'hoste i promoure la replicació del PRRSV [68]. A més, l'activació de les cinases N-terminals c-Jun (JNKs) i p38 també pot promoure l'alliberament del factor inflamatori IL-10 [68–70] i millorar l'efecte inflamatori. A més d'induir l'apoptosi, el PRRSV també pot induir l'autofàgia, que pot promoure la replicació del PRRSV. L'activació de PI3K/Akt és necessària per a l'entrada del virus i la promoció de la replicació del virus, i l'Akt activat per PRRSV inhibeix l'apoptosi de la cèl·lula hoste regulant negativament la via JNK [71]. TNF Pot tenir un paper important en la inducció i regulació de la resposta inflamatòria juntament amb altres factors inflamatoris, però l'expressió de TNF es veu afectada per la regulació negativa de la replicació del PRRSV [72]. En el present estudi, els miRNAs (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR-124 {24}}a-5p, etc.) enriquits en aquestes vies estan implicats en l'apoptosi, l'autofàgia i la inflamació induïdes pel PRRSV i estan estretament associats amb la resposta immune viral, l'evasió immune i la replicació.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

La membrana plasmàtica cel·lular és rica en una varietat de basses lipídiques, i els esfingolípids rics en colesterol i esfingolípids (esfingomielina i glicoesfingolípids) són molècules clau de les basses lipídiques. El reconeixement de lípids per part d'algunes proteïnes del virus pot ser una condició necessària per a l'entrada del virus [73]. Els virus de l'embolcall insereixen glicoproteïnes de l'embolcall viral a les basses lipídiques en l'etapa d'entrada del virus, interaccionen amb receptors situats a les basses lipídiques o canvien del seu estat natural a la forma activada per iniciar o promoure la internalització/fusió viral, com ara el VHS, el coronavirus SARS i virus de la diarrea epidèmica del garrin [73,74]. Estudis anteriors van trobar que l'eliminació del colesterol de la superfície de les cèl·lules MARC-145 va reduir significativament la infecció per PRRSV, demostrant que la inhibició de la infecció per PRRSV estava mediada específicament per l'eliminació del colesterol cel·lular. L'esgotament del colesterol de la membrana cel·lular va inhibir significativament l'entrada del virus, especialment la fixació i l'alliberament del virus [75]. El metabolisme dels esfingolípids pot regular l'estructura i l'adhesió de la membrana, la qual cosa és de gran importància en la invasió del virus PRRSV. L'endocitosi va ser l'enriquiment més significatiu d'aquest estudi. L'endocitosi és un mecanisme important de captació d'exosomes per les cèl·lules diana. Estudis anteriors han demostrat que la captació d'exosomes és un procés que exigeix ​​energia i que depèn del citoesquelet, cosa que posa de manifest el paper potencial de l'endocitosi en aquest procés [76]. S'ha demostrat que diverses vies poden mediar en aquest procés, com ara fagocitosi, macropinocitosi, clatrina, etc. [77,78], la qual cosa va donar lloc a diferents classificacions i rols de les substàncies endocitades. L'enriquiment dels miRNAs exosomals expressats de manera diferencial en aquesta via indica que els exosomes tenen un paper important en la infecció per PRRSV, i la regulació del transport i l'absorció de contingut en els exosomes pot provocar canvis fisiopatològics en cèl·lules i òrgans diana.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

5. Conclusions

Mitjançant la identificació i l'anàlisi bioinformàtica de miRNAs exosomals sèrics de porcs infectats amb PRRSV, en aquest estudi es van obtenir una varietat de vies relacionades amb PRRSV i miRNA expressats de manera diferent, com ara ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, etc., que tenen papers funcionals potencials en PRRSV - Resposta immune induïda, invasió i captació d'exosomes. A més, com que un únic miRNA pot orientar diversos gens i un sol gen també està regulat per múltiples miRNAs, diversos miRNA realitzen múltiples funcions en les vies anteriors. S'ha verificat que alguns miRNAs regulen la infecció per PRRSV actuant sobre receptors clau o dirigint-se directament al genoma del virus, com ara ssc-miR-10b, ssc-miR{-378, miR-124a, deixem -7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a, etc. Mentrestant, el present estudi també va predir una varietat de miRNAs que es poden unir a el fragment més conservat del 30 UTR del genoma del virus CHX1401, incloent ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } i ssc-miR-6529, que poden ser importants per regular la patogenicitat viral.

Referències

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Biologia molecular i patogènesi de l'arterivirus. J. Gen. Virol. 2013, 94 Pt 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; et al. La senyalització Notch contribueix a l'expressió de citocines inflamatòries induïdes per la infecció pel virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina altament patògena (HP-PRRSV) en macròfags alveolars porcins. Dev. Comp. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassious, R. Característiques ultraestructurals i morfogènesi del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina propagat en el clon de cèl·lules MARC-145 altament permissiu. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. La biologia estructural del PRRSV. Res del virus. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Noves proteïnes estructurals en virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina codificada per un ORF5 alternatiu present en tots els arterivirus. J. Gen. Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Jo, GW; Choi, HW; No, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Anàlisis fenotípiques i genotípiques d'una soca viral atenuada de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina després de passatges en sèrie en macròfags alveolars porcins cultivats. J. Vet. Ciència. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Metaboloma dels exosomes: Centrat en les vesícules alliberades per les cèl·lules cancerígenes i presents en els fluids corporals humans. Int. J. Mol. Ciència. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. Bebelman, diputat; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Biogènesi i funció de les vesícules extracel·lulars en càncer. Pharmacol. Allà. 2018, 188, 1–11. [Ref creuat]

9. Zaborowski, diputat; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Vesícules extracel·lulars: composició, rellevància biològica i mètodes d'estudi. Bioscience 2015, 65, 783–797. [Ref creuat]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holanda, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. Els exosomes circulants poden identificar biomarcadors per a vaques amb risc de disfunció metabòlica. Ciència. Rep. 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Tractament de cèl·lules mare mesenquimals per a lesions nervioses perifèriques: una revisió narrativa. Regeneració Neural. Res. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvortsova, TE; Lekchnov, EA; Grigor'eva, AE; Zaporozhchenko, IA; Morozkin, ES; Ryabchikova, EI; Yurchenko, YB; Voitsitskiy, VE; et al. Estudi comparatiu de vesícules extracel·lulars de l'orina d'individus sans i pacients amb càncer de pròstata. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Reprogramació epigenètica de cèl·lules mediada per exosomes/microvesícules. Am. J. Càncer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. Tamkovich, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Exosomes: generació, estructura, transport, activitat biològica i aplicació diagnòstica. Bioquímica. Mosc. Supl. Ser. Un membre. Biol cel·lular. 2016, 10, 163–173. [Ref creuat]

15. Bartel, DP MicroRNAs: Genòmica, biogènesi, mecanisme i funció. Cèl·lula 2004, 116, 281–297. [Ref creuat]

16. Gordino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; Ribot, JC MicroRNA-181a restringeix la diferenciació de cèl·lules T δ humanes dirigint-se a Map3k2 i Notch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [Ref creuat]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sol, Y.; Yang, X. L'ARN llarg no codificant AFAP1-AS1 facilita la progressió del càncer d'ovari regulant l'eix miR-107/PDK4. J. Res ovàrica. 2021, 14, 60. [CrossRef]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH La interacció de microRNAs i factors de transcripció en la regulació de l'autofàgia en la malaltia del fetge gras no alcohòlic. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [Ref creuat]

19. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Rucinski, M.; Januchowski, R. El perfil de l'expressió de microRNA i el paper potencial en la regulació de gens resistents als fàrmacs en línies cel·lulars de càncer d'ovari resistents al cisplatí i al paclitaxel. Int. J. Mol. Ciència. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sol, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Exosomal miR-224 contribueix a l'homeòstasi de la microbiota de l'hemolinfa durant la infecció bacteriana en crustacis. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [Ref creuat]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. Orientacions futures en el diagnòstic, el pronòstic i el seguiment de la malaltia del carcinoma adrenocortical: nous biomarcadors no invasius. Davant. Endocrinol. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG La majoria dels microARN detectables en sèrum i saliva es concentren en exosomes. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fan, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS Funcions emergents dels microRNAs com a biomarcadors i dianes terapèutiques per a la neuropatia diabètica. Davant. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Li, T.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; et al. Regulació de la producció d'exosomes i classificació de càrrega. Int. J. Biol. Ciència. 2021, 17, 163–177. [Ref creuat]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. Cellular microRNA miR-26a suprimeix la replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina activant la immunitat antiviral innata. Ciència. Rep 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; et al. L'amfitrió miR-26a suprimeix la replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina mitjançant la regulació positiva dels interferons de tipus I. Res del virus. 2015, 195, 86–94. [Ref creuat]

27. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c s'adreça a la cadena beta del receptor interferó-alfa/beta per promoure la infecció per PRRSV tipus 2. J. Gen. Virol. 2018, 99, 1671–1680. [Ref creuat]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; Feng, WH MicroRNA-30c modula les respostes d'IFN tipus I per facilitar la infecció pel virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina dirigint-se a JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [Ref creuat]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b redueix la replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina mitjançant la regulació negativa de la via NF-κB. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [Ref creuat]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 inhibeix la replicació del PRRSV dirigint-se directament a l'ARN del PRRSV i possiblement mitjançant la regulació positiva dels interferons de tipus I. Virologia 2014, 450–451, 182–195. [Ref creuat]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. MiR-506 inhibeix la replicació del PRRSV a les cèl·lules MARC-145 mitjançant CD151. Mol. Cèl·lula. Bioquímica. 2014, 394, 275–281. [Ref creuat]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 suprimeix la infecció pel virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina (PRRSV) dirigint-se al receptor CD163 de PRRSV. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [Ref creuat]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; NIH.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; et al. MiR-22 promou la replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina dirigint-se al factor hoste HO-1. Veterinària. Microbiol. 2016, 192, 226–230. [Ref creuat]

34. Xiao, S.; Wang, X.; NIH.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; et al. El microARN miR-24-3p promou la replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina mitjançant la supressió de l'expressió de l'hemoxigenasa-1. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [Ref creuat]

35. Majordom, JE; Sinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. La perturbació del desenvolupament dels timòcits és la base de la pandèmia del PRRS: una hipòtesi comprovable. Davant. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. Soca similar al NADC30-del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina, Xina. Emerg. Infectar. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [Ref creuat]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Avaluació de l'eficàcia de tres vacunes de virus vius modificats contra una soca del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina com el NADC30-. Veterinària. Microbiol. 2017, 207, 108–116. [Ref creuat]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: un recurs en línia per a la predicció d'objectius de microRNA i anotacions funcionals. Àcids nucleics Res. 2015, 43, D146–D152. [Ref creuat]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 identifica amb precisió centenars de gens de microRNA coneguts i nous en set clades animals. Àcids nucleics Res. 2012, 40, 37–52. [Ref creuat]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: una plataforma d'anàlisi evolutiva de microRNA integradora per a experiments de seqüenciació de nova generació. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [Ref. creuada]

41. Anders, S.; Huber, W. Anàlisi d'expressió diferencial per a dades de recompte de seqüències. Genoma Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Anàlisi de genètica evolutiva molecular versió 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST i RPHAST: Anàlisi filogenètica amb models espai/temps. Breu. Bioinformar. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: predicció d'objectius de microRNA fàcil, ràpida i flexible. Àcids nucleics Res. 2006, 34, W451–W454. [Ref creuat]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; He, QY clusterProfiler: un paquet R per comparar temes biològics entre grups de gens. OMICS 2012, 16, 284–287. [Ref creuat]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. Anàlisi de microRNAs exosomals sèrics i característiques clinicopatològiques de pacients amb adenocarcinoma pancreàtic. Món J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; àrab, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; et al. Informació mínima per als estudis de vesícules extracel·lulars 2018 (MISEV2018): una declaració de posició de la Societat Internacional de Vesícules Extracel·lulars i una actualització de les directrius MISEV2014. J. Extracell. Vesicules 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Efecte de la vacunació amb una vacuna modificada del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina viva sobre el rendiment del creixement en porcs d'engreix en condicions de camp. J. Vet. Med. Ciència. 2016, 78, 1533–1536. [Ref creuat]

49. Bian, T.; Sol, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Un virus recombinant de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina de tipus 2 entre NADC30-like i MLV-like: Genetic characterization and pathogenicity for garrins. Infectar. Genet. Evol. 2017, 54, 279–286. [Ref creuat]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. Seqüència completa del genoma d'un NADC30-Com el virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina caracteritzat per la recombinació amb altres soques. Anunci del genoma. 2016, 4, e00330-16. [Ref creuat]

51. Kalluri, R.; Lebleu, VS La biologia, la funció i les aplicacions biomèdiques dels exosomes. Science 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY Avenços recents en la comprensió del paper dels miRNA en els exosomes i el seu potencial terapèutic. J. Integr. Agrícola. 2017, 16, 753–761. [Ref creuat]

53. Shenoda, BB; Ajit, SK Modulació de les respostes immunes per exosomes derivats de cèl·lules presentadores d'antigen. Clin. Med. Insights Pathol. 2016, 9 (Suppl. S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Els exosomes modulen la replicació viral i les respostes immunes de l'hoste en la infecció per VHB. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Greening, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Exosomes i els seus papers en la regulació immune i el càncer. En seminaris de biologia cel·lular i del desenvolupament; Academic Press: Cambridge, MA, EUA, 2015; Volum 40, pàgs. 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Exosomes en la patologia de les malalties neurodegeneratives. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [Ref creuat]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Els exosomes funcionen en pro-i anti-angiogènesi. Curr. Angiogenesis 2013, 2, 54–59. [Ref creuat]

58. Lan, J.; Sol, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Cançó, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; et al. Els exosomes derivats de macròfags M2 promouen la migració cel·lular i la invasió en el càncer de còlon. Càncer Res. 2019, 79, 146–158. [Ref creuat]

59. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 admet el potencial invasiu dels exosomes positius LMP1-associats al carcinoma nasofarínge. Oncogen 2014, 33, 4613–4622. [Ref creuat]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Ell, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 suprimeix la replicació del virus de la malaltia de la bursa infecciosa (IBDV) mitjançant l'orientació directa del segment B genòmic d'IBDV i els supressors cel·lulars de la senyalització de citocines 6 (SOCS6). Res del virus. 2018, 252, 29–40. [Ref creuat]

61. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Ell, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b suprimeix la replicació del virus de la malaltia de la bursa infecciosa mitjançant l'orientació del genoma viral i els supressors cel·lulars de la senyalització de citocines 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [Ref creuat]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH L'augment de l'expressió de microRNA 181 inhibeix la replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina i té implicacions per controlar la infecció per virus. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; Ell, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; et al. Els transcriptomes integrats de miRNA i mRNA de macròfags alveolars porcins (cèl·lules PAM) identifiquen signatures moleculars de miRNA específiques de soca associades a la infecció per H-PRRSV i N-PRRSV. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a mostra activitat antiviral contra el virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina mitjançant la supressió dels gens hoste CD163. Veterinària. Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f{-5p inhibeix el virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina dirigint-se a MYH9. Ciència. Rep 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. Identificació d'ARN no codificant expressat de manera diferencial en macròfags alveolars porcins de Tongcheng i grans porcs blancs van respondre al PRRSV. Ciència. Rep 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. Perfil d'expressió de microRNA en macròfags alveolars de porcs Tongcheng xinesos indígenes infectats amb PRRSV in vivo. J. Appl. Genet. 2017, 58, 539–544. [Ref creuat]

68. Lee, YJ; Lee, C. La replicació del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina es suprimeix mitjançant la inhibició de la via de senyalització de la cinasa regulada per senyal extracel·lular (ERK). Res del virus. 2010, 152, 50–58. [Ref creuat]

69. Cançó, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. La infecció pel virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina activa la producció d'IL-10 mitjançant les vies NF-κB i p38 MAPK als macròfags alveolars porcins. Dev. Comp. Immunol. 2013, 39, 265–272. [Ref creuat]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. L'activació de la quinasa terminal c-Jun NH (2) és necessària per a l'apoptosi induïda pel virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina, però no per a la replicació del virus. Res del virus. 2012, 166, 103–108. [Ref creuat]

71. Fan, L. Vies de senyalització implicades en la regulació de la inducció de l'apoptosi a les cèl·lules hoste després de la infecció per PRRSV. Gens de virus 2019, 55, 433–439. [Ref creuat]

72. López-Fuertes, L.; Campos, E.; Domènech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Domínguez, J.; Alonso, F. El virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina (PRRS) disminueix la producció de TNF en macròfags infectats. Res del virus. 2000, 69, 41–46. [Ref creuat]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI Els lípids com a moduladors de la fusió de membrana mediats per proteïnes de fusió viral. Eur. Biofísica. J. 2007, 36, 887–899. [Ref creuat]

74. Jeon, JH; Lee, C. El colesterol cel·lular és necessari per a la infecció per nidovirus porcí. Arc. Virol. 2017, 162, 3753–3767. [Ref creuat]

75. Sol, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. El colesterol de la membrana cel·lular és necessari per a l'entrada i l'alliberament del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina a les cèl·lules MARC-145. Ciència. Xina Life Science. 2011, 54, 1011–1018. [Ref creuat]

76. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Absorció d'exosomes mitjançant endocitosi i macropinocitosi mediades per clatrina i mediació del lliurament de miR-21. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [Ref creuat]

77. Mulcahy, LA; Rosa, RC; Carter, DRF Rutes i mecanismes de captació de vesícules extracel·lulars. J. Extracell. Vesicules 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Hu, H.; Chen, D. Nanoportadors basats en exosomes com a vehicles bio-inspirats i versàtils per al lliurament de fàrmacs: avenços i reptes recents. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [Ref creuat]