Les baixes concentracions de paraquat indueixen l'activació precoç de la cinasa 1/2 regulada per senyal extracel·lular, la proteïna quinasa B i les vies de la cinasa N-terminal C-Jun 1/2: paper de la cinasa N-terminal C-Jun en la mort cel·lular induïda per paraquat

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes García-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo,German´n Soler,§ and Jose´ M. Fuentes

Resum:

El paraquat és un herbicida amb un risc potencial d'induir parkinsonisme a causa de la seva neurotoxicitat demostrada i la seva forta similitud estructural amb el 1-metil-4-fenilpiridini (MPP plus ), una neurotoxina coneguda que provoca una síndrome clínica similar. amalaltia de Parkinson(PD). Tanmateix, actualment se sap molt poc sobre les vies de senyalització activades pel paraquat en qualsevol sistema cel·lular. En aquest estudi, hem investigat l'efecte del paraquat sobre l'activació de les cinases 1 i 2 regulades per senyal extracel·lular (ERK1/2), la cinasa N-terminal c-Jun (JNK) i l'activació de la proteïna cinasa B (PKB) a les cèl·lules E18. Les baixes concentracions de paraquat van estimular augments molt primerencs de la fosforilació d'ERK1/2, JNK1/2 i PKB. Els inhibidors de la 3-fosfatidilinositol 3-quinasa (PI{{-3K) wortmanina i LY 294002 (2-({4-morfolinil)-8-fenil-4H{{ 19}}benzopiran-4-un) va inhibir els primers augments induïts pel paraquat en la fosforilació de PKB. A més, els augments precoços de l'activació d'ERK1/2 mediats pel paraquat van ser sensibles a l'inhibidor de la proteïna quinasa cinasa 1 (MEK1) activada per mitogens PD 98059 (2#-amino-3#-methoxyflflavone), mentre que les respostes de JNK1/2 eren bloquejat per l'inhibidor de JNK1/2 SP 600125 (antra[1-9-cd]pirazol-6(2H)-ona). El pretractament amb wortmannina, LY 294002 o PD 98059 no va afectar la mort de cèl·lules de paraquat a les cèl·lules E18. En canvi, SP 600125 va disminuir significativament la mort cel·lular induïda per paraquat a les cèl·lules E18. En conclusió, hem demostrat que les baixes concentracions de paraquat estimulen augments molt primerencs de la fosforilació ERK1/2, JNK1/2 i PKB a les cèl·lules E18. A més, les dades presentades suggereixen que la inhibició de la via JNK1/2 protegeix les cèl·lules E18 de la mort cel·lular induïda per paraquat i recolza el fet que la inhibició de l'activació precoç de JNK1/2 pot constituir una estratègia potencial en el tractament de la PD. Paraules clau: paraquat; concentracions baixes; JNK; mort cel·lular; Parkinson.

Herba contra la malaltia de Parkinson:cistanche

INTRODUCCIÓ

malaltia de Parkinson (PD)és un trastorn neurodegeneratiu caracteritzat per la mort de neurones dopaminèrgiques a la sub-Constantia nigra en conjunció amb inclusions intracitoplasmàtiques conegudes com a cossos de Lewy (Olanow i Tatton, 1999). Només el 5-10% dels pacients amb PD tenen una forma familiar d'aquesta malaltia amb un mode d'herència autosòmica dominant (Gasser, 2001). Els factors genètics són importants en pacients d'inici jove, però és probable que no tinguin un paper important en la PD esporàdica més comuna. En canvi, els estudis epidemiològics indiquen diversos factors ambientals que augmenten el risc de desenvolupar EP (malaltia de Parkinson). Aquests inclouen pesticides, herbicides, productes químics industrials, agricultura i viure en un entorn rural (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner i BenShlomo, 1999). L'argument més convincent a favor d'un factor ambiental en la DP es relaciona amb el descobriment dels efectes biològics de MPTP (1-metil-4-fenil{-1,2,3,6- tetrarquia-dropiridina). Aquesta toxina del sistema nerviós central produeix una síndrome que és clínicament i anatòmicament similar a la PD (Kopin i Markey, 1988; Langston et al., 1983). En aquest sentit, l'herbicida paraquat molt utilitzat (1,1#-dimetil-4,4#-bipiridini) s'ha suggerit com un putatiu factor de risc tant per la seva homologia estructural amb MPPþ, el metabòlit actiu de MPTP ( Tanner i Langston, 1990), i sobre informes de parkinsonisme correlacionats amb l'exposició a l'agent (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al., 1997; al., 1992). Tanmateix, tot i que les vies de senyalització implicades en la mort cel·lular MPP+ són ben conegudes (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), se sap molt poc sobre les vies de senyalització activades. per paraquat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) De totes maneres, no hi ha estudis sobre esdeveniments primerencs observats després de l'exposició a baixes concentracions de paraquat.

Diversos estímuls, inclosos MPPþ i paraquat, poden activar una sèrie de cascades de senyalització intracel·lulars que estan estretament associades tant amb la mort cel·lular com amb les vies de supervivència cel·lular. Per exemple, MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) activa els membres de la família de la proteïna cinasa activada per mitògens (MAPK) i la proteïna cinasa B (PKB). Els membres de la família TheMAPK són activats per MPPþ o paraquat inclouen les cinases regulades per senyal extracel·lular 1 i 2 (ERK1/2), les quinases N-terminals c-Jun (JNK1 i JNK2) i les MAPK p38. En general s'accepta que ERK1/2 i l'activació de PKB afavoreix la supervivència cel·lular mitjançant l'activació de vies de senyalització anti-apoptòtiques, mentre que l'activació de JNK1/2 i p38 MAPK s'associa amb la mort de cèl·lules neuronals (Harper i LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . L'activació de la via de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI{-3K)/PKB està implicada en la supervivència neuronal (Shin et al., 2001). En particular, l'activació de la via JNK1/2 pot tenir un paper crític en la toxicitat de MPP i paraquat (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) i, en conseqüència, en els processos cel·lulars que es veuen afectats en PD(malaltia de Parkinson).

Cistanche d'herbes: malaltia anti-Parkinson

MATERIALS I MÈTODES

Línia cel·lular i cultiu.

En aquest estudi es van utilitzar neuroblasts de cervell de rata immortalitzats espontàniament, cèl·lules E18. La línia cel·lular E18 s'ha obtingut per immortalització espontània a partir de cultius d'escorça cerebral de rata fetal d'un dia d'edat i la va proporcionar amablement el Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Espanya) . Les cèl·lules E18 representen neuroblasts primitius que expressen NF 68 i el marcador neuronal primitiu nestina, però no tenen el marcador d'astròcits, la proteïna àcida fibril·lar glial. Després de la inducció de diferenciació parcial amb dibutyryl-cAMP, les cèl·lules expressen marcadors neuronals addicionals com ara NF 145, NF 220 i l'enolasa específica de la neurona (Mun˜oz, comunicació personal). Les cèl·lules es van cultivar a F-12 de Hanks (Hyclone, Brevieres, França) i es van complementar amb un 10% de FCS (Hyclone), estreptomicina (100 mg/ml) i penicil·lina (100 U/ml). Les cèl·lules es van sembrar a 5 3 10 5 en un matràs de cultiu de teixits de 75-cm2 (TPP, Trasadingen, Suïssa) i es van incubar a 37 C sota una atmosfera d'aire del 5% de CO2/95% d'aire. Els cultius es van passar una vegada a la setmana per tripsinització mitjançant una solució de tripsina-EDTA (Hyclone).

Tractaments cel·lulars.

Les cèl·lules confluents (~ 80 per cent) en matràs de cultiu de teixits de 75-cm2 es van tripsinitzar i sembrar en plats de cultiu de teixits a una concentració de 5 3104 cèl·lules/cm2. Vint-i-quatre hores més tard, es va aspirar el medi i es va substituir per un medi fresc sol o un medi que contingués les concentracions indicades de paraquat. En experiments posteriors, diferents concentracions d'inhibidors de la cinasa (LY 294002, wortmannina, SP 600125 i PD).(malaltia de Parkinson)98059, tots de Tocris, Bristol, Regne Unit) es van afegir 30 minuts abans de l'exposició al paraquat. Com que els inhibidors de la cinasa es van dissoldre en sulfòxid de dimetil, es van fer controls amb la concentració més alta utilitzada (0,2 per cent vol/vol). L'addició de dimetil sulfòxid no va afectar els valors de viabilitat de les plaques de control.

Assaig de viabilitat cel·lular.

La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant l'assaig colorimètric MTT (Mosmann, 1983). A les cèl·lules viables, l'enzim mitocondrial succinat deshidrogenasa pot metabolitzar MTT en un colorant de formazà que absorbeix la llum a 570 nm. Per a aquests experiments, es van utilitzar 24-plaques de prova de pous. Al final de cada tractament, es va afegir 100 ll de MTT preparat a una concentració de 5 mg/ml en PBS a cada placa. Després de 3 h d'incubació, el medi es va decantar i els precipitats de formazan es van solubilitzar amb isopropanol àcid (0,04-0,1 N HCl en isopropanol absolut). L'absorbància del colorant convertit es va mesurar a una longitud d'ona de 570 nm amb una resta de fons a 630-690 nm. L'absorbància dels cultius no tractats es va establir al 100 per cent.

Per confirmar els resultats obtinguts amb l'assaig MTT, també es va avaluar la mort cel·lular mesurant l'alliberament de l'enzim citosòlic lactat deshidrogenasa (LDH) al medi de cultiu mitjançant un kit d'assaig LDH colorimètric (Roche, Indianapolis, IN) segons les instruccions del fabricant. . La fuita de LDH es va definir com la relació entre l'activitat de LDH al medi de cultiu i l'activitat total per pou (3100). Es van obtenir dades comparables mitjançant els dos mètodes.

Preparació d'extractes cel·lulars i anàlisi Western blot.

Després dels tractaments experimentals, les cèl·lules (cultivades en plats de 60-mm) es van esbandir dues vegades amb PBS fred i es van eliminar per desballestament i després es van centrifugar a 900 3 g durant 5 min a 4ºC. Les cèl·lules es van lisar en un tampó. que conté 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mMNaCl, 1 per cent de Triton X-100, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMNa3VO4 i còctel inhibidor de la proteasa (Sigma, St Louis, MO). Les cèl·lules es van centrifugar a 13,000 3 g durant 5 min a 4 °C. Els sobrenedants es van emmagatzemar a 80 °C fins a l'anàlisi per Western blot. La concentració de proteïnes es va mesurar segons Bradford (1976) utilitzant BSA com a estàndard.

Es van resoldre quantitats iguals de proteïnes (10 LG per condició) en un 12% d'electroforesi en gel SDS i es van transferir a membranes de PVDF segons mètodes convencionals parcialment modificats (Fuentes et al., 2000). Breument, les proteïnes es van transferir (250 mA durant 60 min) a membranes PVDF mitjançant un aparell Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). El procediment per a la immunodetecció inclou la transferència i el bloqueig de la membrana (60 min a temperatura ambient) amb TTBS (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,2 per cent de Tween-20) que conté un 10 per cent de llet deshidratada. A continuació, es van incubar les membranes durant 60 min a temperatura ambient amb anticossos primaris policlonals de conill (tots de Cell Signalling, Beverly, MA, diluïts 1:1000) en TTBS + 10 per cent de llet deshidratada o 5 per cent de BSA. Després del rentat (durant dos períodes de 5-min amb TTBS), les membranes es van incubar (60 min a temperatura ambient) amb anticossos secundaris anti-conill conjugats amb peroxidasa (1:5000 en TTBS amb un 10 per cent de llet deshidratada). Després del rentat (durant dos períodes de 5-min i un període de 10-min), la detecció d'anticossos units es va visualitzar per quimioluminescència mitjançant el reactiu ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, França) i es va analitzar per Quantitat. Un programari (Bio-Rad). El contingut d'actina es va analitzar com a control mitjançant un anticòs policlonal de conill (de Sigma) diluït 1:2500 en TTBS amb un 10 per cent de llet deshidratada).

Anàlisi estadística.

Cada experiment es va repetir almenys tres vegades amb una correlació satisfactòria entre els resultats dels experiments individuals. Les dades mostrades són les d'un experiment representatiu; cada grup tenia una mitjana de tres o quatre plats de cultiu. Totes les dades s'expressen com a mitjana ± SEM. Els resultats es van analitzar mitjançant ANOVA. Els valors p inferiors a 0,05 es van considerar significatius.

Malaltia anti-Parkinson:Extracte de Cistanche

RESULTATS

Efectes citotòxics del paraquat a les cèl·lules E18

Com es va informar anteriorment (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), diverses línies cel·lulars són sensibles a les propietats tòxiques del paraquat. L'exposició al paraquat va provocar una reducció de la viabilitat cel·lular depenent de la dosi. (Fig. 1.) En aquest estudi, les cèl·lules E18 tractades amb paraquat 25lM durant 24 h van mostrar una pèrdua del 50% de la viabilitat cel·lular. La viabilitat cel·lular es va avaluar mesurant la transformació a MTT en un colorant formazà que absorbeix la llum a 570 nm. Aquest assaig s'utilitza àmpliament per controlar la mort cel·lular en diverses línies cel·lulars, incloses les cèl·lules E18 (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001) i diferents insults, inclòs el paraquat (Chun et al., 2001; Gonzalez). -Polo et al., 2004).

Activació induïda per paraquat d'ERK1/2 a les cèl·lules E18

Els augments de l'activació d'ERK1/2 a les cèl·lules E18 tractades amb paraquat es van controlar mitjançant Western blotting mitjançant un anticòs fosfoespecífic ERK1/2 (Thr202/Tyr204). L'exposició de cèl·lules de neuroblasts E18 amb paraquat 25lM va produir un augment marcat de l'estat de fosforilació (Thr202/Tyr204) d'ERK1/2 (44/42 kDa) (Fig. 2A). Els augments màxims de la fosforilació es van produir després de 5 min, després dels quals els nivells de fosforilació disminueixen lentament fins a nivells propers a la basal. A més, els augments de la fosforilació d'ERK1/2 induïts pel paraquat no depenien de la concentració (Fig. 2B). Pretractament amb l'inhibidor theMEK1, PD(malaltia de Parkinson)98059 (50lM; Dudley et al., 1995) va inhibir completament els augments de la fosforilació d'ERK1/2 induïts pel paraquat (Fig. 3).

Activació de PKB induïda per paraquat a les cèl·lules E18

L'activació de PKB a les cèl·lules E18 es va detectar mitjançant Western blotting mitjançant un anticòs fosfoespecífic (Ser473). L'estimulació de cèl·lules E18 amb paraquat 25lM va produir un augment marcat de la fosforilació de PKB (Fig. 4A). Aquest augment es produeix després de 20 min, comparable a la de la fosforilació ERK1/2 després que els nivells de fosforilació van disminuir lentament fins als nivells basals (Fig. 4A). A més, els augments mediats per paraquat en la fosforilació de PKB depenien de la concentració amb un màxim de 25 lM de paraquat (Fig. 4A). Com que es requereix PI-3K per a l'activació de PKB, es va explorar el paper de PI{-3K en l'activació de PKB induïda per paraquat a les cèl·lules E18 mitjançant els inhibidors de PI{-3K wortmannina i LY 294002.

Els augments mediats per paraquat en la fosforilació de PKB es van bloquejar completament després del pretractament (30 min) de cèl·lules E18 amb wortmannina 100 nM i LY 294002 30 lM (Fig. 5). Aquestes observacions demostren que una via dependent de PI-3K media els augments induïts pel paraquat en la fosforilació de PKB a les cèl·lules E18.

Activació induïda per paraquat de JNK1/2 a les cèl·lules E18

Estudis anteriors han demostrat que el paraquat activa JNK1/2 en neurones (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) i cèl·lules no neuronals (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). No obstant això, les concentracions utilitzades són en gran mesura superiors a les emprades en aquest treball. A més, els temps seleccionats per visualitzar l'activació de JNK1/2 també són més llargs. L'activació de JNK1/2 a les cèl·lules E18 es va detectar mitjançant Western blotting mitjançant un anticòs JNK fosfoespecífic (Thr183/Tyr185). L'estimulació de cèl·lules E18 amb paraquat 25lM va produir un augment marcat i precoç de la fosforilació de JNK (46/54 kDa) (Fig. 6A). Aquests augments van ser màxims després de 5 minuts després dels quals els nivells de fosforilació van disminuir cap als nivells basals (Fig. 6A). Tanmateix, els augments mediats per paraquat en la fosforilació de JNK1/2 no depenien de la concentració (Fig. 6B). Els augments mediats per paraquat en la fosforilació de JNK1/2 van ser sensibles a l'inhibidor de JNK1/2 SP 600125 (10lM; Fig. 7; Bennett et al., 2001). Finalment, el paraquat (25lM) no va estimular augments mesurables de la fosforilació de p38 MAPK a les cèl·lules E18 en els mateixos experiments del curs temporal (dades no mostrades). Aquests experiments es van realitzar mitjançant un anticossos fosfoespecífic p38 MAPK (Thr180/Tyr182).

Mesura de la viabilitat cel·lular després del tractament de cèl·lules E18 amb inhibidors de paraquat i cinasa

Després d'haver demostrat que el paraquat produeix en tots els casos una activació precoç d'ERK1/2, PKB i JNK1/2 a les cèl·lules E18, posteriorment vam determinar el paper de l'activació ràpida d'aquestes vies de la cinasa en la mort cel·lular induïda per baixes concentracions de paraquat utilitzant medicaments específics. inhibidors. Com es mostra a la figura 1, l'exposició de cèl·lules E18 a 25lM de paraquat va provocar una reducció significativa de la viabilitat cel·lular (al voltant del 50 per cent). Per investigar el paper d'ERK1/2, PKB i JNK1/2 en la mort cel·lular induïda per paraquat, les cèl·lules E18 es van preincubar durant 30 min amb els inhibidors de la cinasa següents: PD(malaltia de Parkinson)98059 (50 lM; inhibidor de MEK1/2), LY 294002 (30 lM; inhibidor de PI-3K), wortmannina (100 nM; inhibidor de PI{{{-3K) i SP 600125 (10lM; inhibidor de JNK1/2). Com es mostra a la figura 8 (i es resumeix a la taula 1), la wortmannina, LY 294002 i PD 98059 no van tenir cap efecte significatiu en la pèrdua de viabilitat cel·lular induïda per 25lM de paraquat.

DISCUSSIÓ

Recentment, diversos estudis han augmentat l'interès en la possibilitat que les neurotoxines ambientals com els pesticides puguin estar relacionades amb el desenvolupament de la MP no genètica.(malaltia de Parkinson)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz i Yu, 2000; Sherer et al., 2001). El PQ és un dels possibles herbicides implicats en la PD, a causa d'una estructura química similar amb MPPþ i la forta correlació entre la incidència de la malaltia i la quantitat de PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz i Yu, 2000). No obstant això, no s'ha determinat el mecanisme de la toxicitat neuronal que es produeix amb una subexposició a nivells baixos de paraquat. En qualsevol cas, els treballs anteriors no estan interessats en el procés primerenc evidenciat després de l'exposició al paraquat. El principal descobriment del present estudi és que hem demostrat que les cèl·lules neuroblastes E18 exposades a baixes concentracions de paraquat van augmentar ràpidament la fosforilació activada de les vies de senyalització generalment antiapoptòtiques PI-3K/PKB i MEK ERK i també la generalment proapoptòtica JNK1/ 2 MAPK. En canvi, el paraquat no va estimular augments mesurables depenent del temps o de la concentració en la fosforilació de p38 MAPK. Com s'ha indicat anteriorment, hem utilitzat una concentració baixa de paraquat. S'ha debatut la rellevància del fet de si el paraquat pot entrar al cervell o no perquè és una molècula carregada. Tanmateix, troballes recents (Shimizu et al., 2001) van revelar que el paraquat pot utilitzar la bomba d'aminoàcids neutres per entrar al cervell. Les troballes presentades en aquest treball indiquen que només es necessita una baixa concentració de paraquat a la cèl·lula per estimular ràpidament diverses vies de senyal, inclosa la NK, implicada en els processos de mort cel·lular. Aquestes activacions primerenques a causa de la baixa concentració de paraquat es proposen, per primera vegada, en el present treball.

S'ha dedicat poca atenció a estudiar els canvis en els nivells de fosforilació de PKB o ERK1/2 induïts pel paraquat (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). En qualsevol cas, informes anteriors (Peng et al., 2004) utilitzen concentracions relativament altes de paraquat (400 lM), mesurant el grau de fosforilació d'ERK després de 12-18 h d'exposició. En aquests moments, no van observar canvis en els nivells de p-ERK. En el nostre treball, vam detectar una activació precoç (5-10 min) i important d'ERK1/2 (Fig. 2A). Aquesta activació disminueix lentament fins als nivells basals. En les nostres condicions, els nivells d'ERK1/2 fosforilat (després de 12-18 h) són els mateixos que al control, cosa que indica que aquesta via no està activa en aquests moments (dades no mostrades) tal com descriuen Peng et al. (2004). Aquesta activació no depèn de la concentració, la qual cosa indica el resultat que l'estimulació robusta d'ERK s'obté i es manté amb concentracions molt baixes de paraquat. Els canvis en els nivells de PKB fosforilats encara no s'han descrit després de l'exposició al paraquat. Mostrem a la figura 4 que els resultats depenen del temps i de la concentració, mostrant un efecte màxim després d'una exposició 20-min amb paraquat 25lM. És a dir, els augments precoços de la fosforilació de PKB mediats pel paraquat són comparables als observats per a ERK1/2. Aquestes dades revelen un augment precoç en l'activació de la fosforilació de les vies de supervivència de PKB i ERK. No hi ha dades sobre l'activació precoç de PKB o ERK en la mort cel·lular induïda per paraquat. No obstant això, estudis anteriors (Halvorsen et al., 2002) descriuen un augment precoç similar en ambdues vies en cèl·lules de neuroblastoma SH-SY5Y exposades a MPPþ. En aquest cas, els nivells de fosforilació no disminueixen cap al nivell basal. Aquestes dades són especialment interessants a causa de l'estructura similar anteriorment relacionada entre el paraquat i el MPPþ, que indica un inici diferent de la maquinària cel·lular implicada en l'efecte d'ambdues molècules.

S'ha dedicat més atenció al paper de la via JNK1/2 en la mediació de senyals que contribueixen a la mort cel·lular induïda pel paraquat. En aquest estudi, hem demostrat que les baixes concentracions (25lM) de paraquat desencadenen augments significatius de JNK1/2 fosforilada (Fig. 6). Com passa en PKOr ERK1/2, aquesta activació depèn del temps amb un inici molt primerenc (5 min) i amb un lent retorn als nivells basals. Treballs anteriors (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) mostren activacions tardanes (12-18 h) de la via JNK1/2 produïdes en tot cas per concentracions relativament altes de paraquat (a partir de 400 lM). [Peng et al., 2004] a 800lM [Chunet al., 2001]). En les nostres condicions, el grau de fosforilació de JNK1/2 en els moments indicats és comparable al control. En general, aquests resultats indiquen per primera vegada que l'exposició cel·lular a una concentració molt baixa de paraquat produeix una activació primerenca de les vies PKB, ERK1/2 i JNK1/2.

Després d'haver establert que el paraquat desencadena l'activació precoç de PKB, ERK1/2 i JNK1/2 a les cèl·lules E18, després vam investigar el paper d'aquestes vies de proteïna cinasa en la mort cel·lular induïda pel paraquat mitjançant diversos inhibidors farmacològics. La viabilitat cel·lular es va controlar mesurant la transformació a MTT en un colorant de formazà que absorbeix la llum a 570 nm. El test MTT s'ha utilitzat per mesurar amb precisió la lesió neuronal després d'una varietat d'insults, com ara MPPþ o paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004; ), i és el mètode més utilitzat per determinar la mort cel·lular. Com es mostra a la figura 8, el pretractament amb l'inhibidor selectiu de JNK1/2 SP 600125 va reduir significativament la mort cel·lular induïda per paraquat. Aquesta concentració de SP 600125 va bloquejar completament l'activació de JNK1/2 induïda pel paraquat (Fig. 7). Aquestes dades suggereixen que la inhibició de l'activació primerenca de la via JNK1/2 protegeix les cèl·lules de la mort cel·lular induïda pel paraquat. Aquestes dades coincideixen amb estudis anteriors (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), que han demostrat que JNK1/2 està implicat en la mort de cèl·lules neuronals provocada pel paraquat. Tanmateix, aquests estudis utilitzen entre 15 i 30 vegades més concentració de paraquat que la utilitzada en aquest estudi. També demostrem que les baixes concentracions de paraquat poden produir no només l'activació, sinó també una activació primerenca d'aquesta via. La protecció observada amb SP600125 també indica que la via JNK1/2 està implicada en la mort cel·lular induïda pel paraquat. A més, la inhibició de JNK1/2 s'ha dissenyat com una estratègia potencial en el tractament de la MP(malaltia de Parkinson)en diversos models tant in vivo com in vitro (Wang et al., 2004).

efecte neuroprotector del cistanche

Estudis anteriors han demostrat que tant les vies PKB com ERK estan implicades en la supervivència neuronal (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). En aquest estudi, hem demostrat que les baixes concentracions de paraquat produeixen i estimulen primerencament les vies PKB i ERK. Aquestes observacions suggereixen que l'activació de PKB i ERK induïda per paraquat pot estar implicada en la protecció de les cèl·lules contra la mort cel·lular induïda per paraquat. Per investigar aquesta possibilitat, hem utilitzat els inhibidors PI-3K no relacionats estructuralment, wortmannina i LY 294002 i l'inhibidor ERK1/2 PD.(malaltia de Parkinson)98059. Curiosament, la inhibició de PKB i ERK no va alterar la viabilitat cel·lular en presència de paraquat, cosa que suggereix que, en les nostres condicions, l'augment de PKB i ERKactivació no és essencial per a la supervivència en la mort cel·lular induïda per paraquat a les cèl·lules E18.

És ben sabut que el mecanisme de neurotoxicitat del paraquat està, entre altres factors, mediat per l'estrès oxidatiu (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). En aquest sentit, recentment s'ha descrit un estrès oxidatiu citosòlic molt ràpid en esdeveniments apoptòtics primerencs implicats en la mort cel·lular induïda pel paraquat (Gonzalez-Polo et al., 2004). Com que l'estrès oxidatiu activa els membres de la família MAPK (com ara ERK1/2 i JNK1/2) i PKB (Kamata i Hirata, 1999), aquesta activació primerenca d'ERK1/2, JNK1/2 i PKB es pot atribuir a l'oxidació ràpida. induït per l'estrès després de l'exposició al paraquat.

En resum, els nostres resultats mostren per primera vegada que les baixes concentracions de paraquat estimulen augments molt primerencs i robusts de la fosforilació de PKB, ERK1/2 i JNK1/2 a les cèl·lules E18. A més, hem demostrat que la inhibició de l'activació primerenca de la via JNK1/2 protegeix les cèl·lules E18 de la mort cel·lular induïda pel paraquat. Aquest resultat apunta cap a l'existència d'alguns esdeveniments primerencs (com la ràpida activació de JNK1/2) que tenen un paper essencial en la mort cel·lular induïda per baixes concentracions de paraquat. Aquest resultat també obre una línia nova i apassionant en l'estudi de la toxicitat del paraquat i la seva possible implicació en el desenvolupament de la MP.(malaltia de Parkinson).

NOTA: Cistancheés una herba tradicional xinesa que té efectes sobre les neurones i les cèl·lules cerebrals. El cistanche també es coneix com el ginseng del desert, és un tractament potencial per a malalties neurològiques com aramalaltia de Parkinsonbasat en l'estudi farmacològic modern