Detecció fitoquímica i activitat estrogènica dels glucòsids totals de Cistanche Deserticola

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Resum

Al llarg de les dècades, hi ha hagut esforços continus per millorar la qualitat de vida humana. La síndrome de la postmenopausa és una preocupació seriosa per al benestar de la salut de la dona. La teràpia hormonal és actualment el pilar del tractament d'aquesta malaltia. No obstant això, aquesta teràpia podria provocar un abús d'estrògens, provocant reaccions adverses i efectes secundaris. Com a resultat, la teràpia hormonal no ha tingut èxit en la millora de la síndrome postmenopausa.Cistanche deserticolaés una herba tònica clàssica de la medicina tradicional xinesa. Presenta una important activitat estrogènica. Els principals components actius d'aquesta herba són els glucòsids. En un experiment anterior, es van identificar tres factors importants que contribueixen al rendiment total de glucòsids, el rendiment d'acteòsids i l'activitat estrogènica, és a dir, la concentració de l'eluent, el pH i el volum de l'eluent. En aquest experiment, es va determinar un procés de purificació òptim mitjançant una metodologia de superfície de resposta de disseny compost central per obtenir glucòsids d'aquesta herba. Es va trobar que una concentració d'eluent (etanol) del 85 per cent i un volum de 25 BV a un pH d'11 era òptim. Es van identificar vint-i-un compostos actius mitjançant un assaig d'espectrometria de masses en temps de vol de cromatografia líquida d'alt rendiment/quadrupol. Aquest estudi proporciona informació valuosa per a investigacions posteriors en profunditat que avaluen les activitats estrogèniques dels glucòsids totals deCistanche deserticola.

Paraules clau: Disseny central compost; glucòsids totals de Cistanche deserticola; LC/Q-TOF-MS; tecnologia de purificació; prova de creixement uterí.

Introducció

Cistanche deserticolaés una herba tònica clàssica comestible. Va ser esmentat per primera vegada al clàssic d'herbes de Shen Nong i es va inscriure al grau superior. És una herba càlida i dolça. Té nombroses propietats medicinals, com ara l'alimentació del fetge i els ronyons, l'enfortiment dels músculs i els ossos i la millora de la regulació immune juntament amb activitats antienvelliment i antitumorals [1-4]. Alguns compostos naturals s'han aïllat i identificats dels extractes d'aquesta herba, els principals són glicòsids feniletanoides, lignanoides, iridoides, polisacàrids i alcaloides [5-8].

Els fàrmacs obtinguts a partir de plantes medicinals contenen diversos compostos actius, que són els principals responsables de les seves accions terapèutiques. L'eficàcia d'un mateix fàrmac obtingut de diferents fonts vegetals pot variar a causa de les diferències en el tipus i la quantitat de compostos actius presents en ell. Per tant, és important identificar i quantificar tots els compostos actius presents en els fàrmacs obtinguts a partir de plantes medicinals. El mateix passa amb C. deserticola. La metodologia de la superfície de resposta és un mètode experimental per investigar la interacció entre diferents factors simultàniament [9-10]. Es pot utilitzar per a l'optimització dels paràmetres d'extracció de fitofarmacèutics i l'estimació quantitativa de compostos actius en fàrmacs. El disseny central compost (CCD) és un dels dissenys experimentals útils en la metodologia de la superfície de resposta. En comparació amb els dissenys ortogonals i uniformes, el CCD té una precisió més alta i una millor predictibilitat [11].

La síndrome de la postmenopausa pot reduir substancialment la qualitat de vida de les dones. Normalment, els estrògens s'utilitzen per tractar aquesta condició. No obstant això, l'ús a llarg termini d'estrògens pot provocar abús, provocant així diverses reaccions adverses i efectes secundaris. Per tant, és imprescindible triar una teràpia alternativa, preferiblement un fàrmac a base d'herbes que contingui estrògens com a ingredient actiu per al tractament de la síndrome postmenopausa [12-13].

En un experiment preliminar, es van identificar les estructures de diversos compostos naturals obtinguts a partir de C. deserticola mitjançant espectrometria de masses (MS) [14]. Es va confirmar que els glucòsids són els principals compostos actius que tenen una activitat estrogènica significativa [14-15]. Per desenvolupar un ingredient actiu estrogènic segur i eficaç en un fàrmac nou, es necessita una investigació en profunditat sobre el TGCD després de la purificació. En aquest estudi, el CCD es va utilitzar per primera vegada per optimitzar la purificació dels glucòsids totals de C. deserticola (TGCD). Posteriorment, es va utilitzar la prova de creixement de l'úter per avaluar les activitats estrogèniques del mateix glucòsid. Es va utilitzar cromatografia líquida d'alt rendiment/espectrometria de masses en temps de vol quadrupol (HPLC/Q-TOF-MS) per a l'anàlisi qualitativa dels compostos de TGCD després de la purificació. Aquest procés es va aplicar per demostrar explícitament la presència de diversos compostos actius amb activitat estrogènica en TGCD. Això pot proporcionar simultàniament la base per al seu ús clínic en la síndrome postmenopausa substituint els estrògens.

Procediment experimental

Instruments

Sistema HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA), sistema LC/MS (Q-TOF) de temps de vol quadripol Agilent sèrie 6530 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) i HPLC química{ {5}}Les estacions de treball D es van utilitzar com a instruments cromatogràfics per al processament de dades. Es va utilitzar aigua ultrapura Milli-Q per a tot l'estudi. Balança analítica electrònica AR1140 (Ohaus International Ltd.); Lector de microplaques 680 (Bio-Rad Corporation); i es van utilitzar una centrífuga d'alta velocitat 64R (Beckman Coulter Allegra) per a la preparació de mostres.

Drogues i productes químics

C. deserticola va ser comprat al mercat de drogues i identificat pel professor Zhang Delian (Harbin University of Commerce, Xina). El dietilstilbestrol estàndard (99% pur, lot núm. 60518) es va comprar al Dr. Ehrenstorfer (Alemanya). Altres estàndards d'acteòsid (111530-200505) i equinacòsid (111670-200503) es van obtenir de l'Institut Nacional per al Control de Productes Farmacèutics i Biològics, Beijing, Xina. La puresa de cada estàndard era > 98 per cent. L'acetonitril (ACN), el metanol i l'àcid fòrmic (grau MS) es van comprar a Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, EUA). L'aigua ultrapura es va obtenir de Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Hangzhou, Xina). Tots els reactius disponibles comercialment eren de grau analític.

Preparació dels glucòsids totals de la solució de purificació de C. deserticola

Després d'immersió en etanol al 75 per cent durant 12 h, es va extreure la pols bruta de C. deserticola (100 g) amb 800 ml d'etanol al 75 per cent (v/v) a 80 graus durant 150 min sota reflux. Després es va filtrar a través d'un filtre de dos pisos i posteriorment es va extreure amb 800 ml d'etanol al 75 per cent dues vegades durant 150 min addicionals. Posteriorment, els filtrats es van combinar i es van concentrar al buit a 45 graus. L'extracte es va obtenir eliminant el dissolvent. Es va afegir una certa quantitat d'aigua destil·lada a l'extracte per obtenir una concentració de 0,5 g/mL, que es va utilitzar per filtrar el procés de purificació.

Per a l'adsorció amb resina macroporosa AB-8, el pH de la solució de la mostra de prova es va ajustar a 11. Primer, es va utilitzar aigua destil·lada 2 BV per rentar les impureses. A continuació, es va eluir i es va recollir l'eluent a una concentració de 25 BV 85 per cent d'etanol. Finalment, es va fusionar l'eluent purificat recollit. Es va afegir una certa quantitat d'aigua destil·lada a l'extracte per obtenir una concentració d'1,5 g/mL, que es va utilitzar per a l'administració intragàstrica. Per a un control positiu, es va preparar una solució de dietilstilbestrol (20 ug/mL) amb pols de dietilstilbestrol.

Segons la proporció de purificació ({{0}},6), una certa quantitat de l'extracte (equivalent a 1 g de C. deserticola) es va transferir a un matràs aforat d'1{0 mL, dissolt en una solució de metanol al 50 per cent (v/v) en un bany d'ultrasons durant 5 min i diluït a 10 ml. La solució medicinal es va obtenir després de filtrar el sobrenedant a través d'una membrana de filtre de 0,45 μm. L'acteòsid i l'equinacòsid (1 mg cadascun) es van barrejar i es van dissoldre completament en una solució de metanol al 50 per cent (v/v) de 10 ml. Finalment, la solució estàndard es va filtrar a través d'un filtre Millipore de 0, 45 μm abans de l'anàlisi.

Condicions LC-MS

La separació per cromatografia es va dur a terme en un sistema HPLC (Agilent 129{{10}}), equipat amb un sistema de lliurament de dissolvent quaternari, desgasificador al buit i detector de matriu de fotodíodes. L'anàlisi MS/MS es va realitzar en un instrument Agilent-1290 HPLC/6530 Q-TOF-MS sistema, equipat amb una font d'ionització electrospray en modes d'ions positius i negatius. Per a la separació es va utilitzar una columna Waters Symmetry Shield RP C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, EUA). La fase mòbil comprenia una solució aquosa d'àcid fòrmic al 0,2% (v/v) (A) i ACN (B), i es va bombejar a un cabal de 0,5 ml/min. El volum d'injecció de cada mostra era de 10 μL. El programa d'elució del gradient va ser el següent: 5-23 per cent de B durant 0-35 min, 23-25 ​​per cent de B durant 35-65 min i 25-5 per cent de B durant 65-70 min. La temperatura de la columna es va mantenir a 30 graus. Els cromatogrames es van controlar i es van registrar a 330 nm. La pressió del gas d'atomització es va establir a 30 Psi i la tensió capil·lar era de 3,5 kV. El cabal de gas sec era de 8 L/min a una temperatura de 30 graus. La temperatura del gas de la funda es va establir a 400 graus a un cabal de 12 L/min. L'energia de col·lisió es va establir en 10-20 eV per a exploracions de baixa energia i 30-50 eV per a exploracions d'alta energia. Les dades dels espectres de masses es van registrar dins del rang d'exploració de 50-1000 Da en modes d'exploració d'ions positius i negatius. En aquest estudi, es va realitzar una comparació ràpida i eficient entre el TGCD i els estàndards sota la mateixa condició LC-MS.

Prova de creixement de l'úter

Això es va dur a terme d'acord estrictament amb les recomanacions de la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori dels Instituts Nacionals de Salut. Tots els procediments experimentals van ser revisats i aprovats pel Comitè Ètic Animal de la Universitat de Comerç de Harbin, Xina.

Els ratolins Kunming femelles immadurs (uns 21 d de naixement, deslletats) amb un pes de 12 ± 2 g, es van comprar al Centre d'Animals del Laboratori de la Base Nacional de la Indústria Biològica de Changchun (Changchun, Xina). Els ratolins es van allotjar en una habitació amb temperatura regulada (22 ± 2 graus) amb menjar i aigua ad libitum. L'experimentació amb animals es va iniciar després de cinc dies d'aclimatació. Els ratolins van dejunar durant la nit amb aigua ad libitum abans de l'administració intragàstrica de la solució de prova.

Els ratolins es van dividir aleatòriament en 22 grups, amb 10 animals a cada grup. Se'ls va administrar medicaments experimentals del mateix volum dues vegades al dia (matí i vespre) durant quatre dies de la següent manera:

Grup 1: glucòsids totals intragàstrics de solució de purificació de C. deserticola (20 ml/kg), (volum de la solució/pes del ratolí),

Grup II: Aigua destil·lada intragàstrica (grup control negatiu), i

Grup III: dietilstilbestrol intragàstric (20 ug/ml) (grup control positiu).

El cinquè dia es van sacrificar tots els ratolins. Els úters es van retirar immediatament i es van pesar i es van calcular els coeficients de l'úter.

Anàlisi estadística

Es va utilitzar una prova t de mostres aparellades de dues cues per identificar diferències estadísticament significatives en els diferents paràmetres en els diferents grups experimentals. L'anàlisi es va realitzar mitjançant el programari estadístic SPSS (SPSS per a Windows v21.0, SPSS Inc., EUA). Les diferències es van considerar estadísticament significatives a un nivell de confiança del 95 per cent (p <>

Resultats i discussió

Linealitat i correlació dels rendiments d'acteòsid i glucòsids totals

L'equació de regressió lineal del rendiment de l'acteòsid va ser y {{0}}x – 14,75 (on x és la concentració d'acteòsid i y és la seva àrea màxima corresponent) amb un coeficient de correlació de r=1 en el rang de concentració de 0,12−{{10}},72 mg/mL. Això indicava una corba de calibratge lineal. L'equació de regressió lineal del rendiment total de glicòsids va ser y=26.074x més 0,0866 (on x és la concentració de glucòsids totals i y és la seva àrea màxima corresponent) amb un coeficient de correlació de r { {12}}.9982 en el rang de concentració de 0,013−0,065 mg/mL. Això també indicava una corba de calibratge lineal.

Investigació metodològica

La precisió, la reproductibilitat, l'estabilitat i la recuperació de les mostres es van investigar en la investigació metodològica. A l'experiment de precisió, la desviació estàndard relativa (RSD) de l'acteòsid i dels glucòsids totals va ser de l'1,43 per cent i 0.05 per cent respectivament. A l'experiment de reproductibilitat, la RSD de l'acteòsid i dels glucòsids totals va ser del 0,10 per cent i de l'1,44 per cent respectivament. A l'experiment d'estabilitat de 24 hores, la RSD de l'acteòsid i dels glucòsids totals va ser del 0,14% i del 0,90% respectivament. En l'experiment de recuperació, la recuperació de l'acteòsid va ser del 100,50 per cent amb un RSD del 2,08 per cent, mentre que la recuperació dels glucòsids totals va ser del 99,12 per cent amb un RSD de l'1,65 per cent. Tots els valors de RSD eren inferiors al 3 per cent. Aquests resultats van demostrar una bona precisió i reproductibilitat. A més, la mostra va ser estable durant 24 h. Els resultats de la recuperació també es troben dins del rang admissible (95-105 per cent). Per tant, aquest mètode es pot utilitzar per a la determinació del rendiment d'acteòsid i de glucòsids totals després de la purificació.

Investigació d'un sol factor de TGCD

La purificació de TGCD mitjançant resina macroporosa es pot veure afectada per molts factors, com ara el tipus de resina, els factors d'adsorció estàtica (temps d'adsorció, concentració de fuites i pH de la solució de la mostra) i les condicions d'elució (velocitat de flux, volum i concentració). Utilitzant la capacitat d'adsorció i les taxes de desorció i elució de TGCD com a índexs, es va determinar la condició experimental a partir dels resultats d'experiments d'un sol factor. Utilitzant resina d'adsorció macroporosa de tipus AB-8, es van determinar les condicions òptimes següents: solució de mostra 0,5 mg/mL, pH d'10, temps d'adsorció estàtica de 8 h, 2 BV aigua destil·lada per rentar impureses, 20 BV 80% etanol com a eluent i una velocitat de flux de 0,5 BV/min. Els resultats específics es mostren a les figures 1−7.

CCD per a l'optimització de la tecnologia de purificació TGCD

A partir dels resultats de la investigació d'un sol factor, es van seleccionar tres factors que influeixen significativament en el mètode de purificació com a índexs, a saber, el pH de la solució de la mostra (x1), la concentració de l'eluent (x2) i el volum de l'eluent (x3). Segons el principi de CCD, cada factor té cinc nivells. Els nivells màxim i mínim d'aquests diferents factors es van establir segons els resultats de l'experiment preliminar. Els nivells de factors es mostren a la taula 1 i els resultats experimentals es mostren a la taula 2.

Es van determinar els rendiments totals de glicòsids i acteòsids per optimitzar el mètode de purificació de TGCD. En primer lloc, els rendiments totals de glicòsids i acteòsids es van establir segons els criteris numèrics de desitjabilitat (d) entre {{0}}-1. Aleshores, es va calcular la desitjabilitat global (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n, on n és el nombre índex]. SPSS21. El programari {{10}} i el programari expert en disseny es van utilitzar per a la regressió lineal múltiple i l'ajust binomial de variables independents i DO, amb p < 0.05="" es="" va="" considerar.="" un="" estàndard="" estadísticament="" significatiu="" de="" l'equació.="" l'equació="" amb="" un="" valor="" r="" més="" gran="" (coeficient="" de="" correlació="" múltiple)="" es="" va="" seleccionar="" com="" el="" model="" més="" adequat.="" l'equació="" lineal="" multivariant="" es="" representa="" com="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" més="" 0.{034x2="" més="" 0.012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" pàg="0.004)." l'equació="" binomial="" és="" y="–" 21,92173="" –="" 0,74079x1="" més="" 0,62914x2="" més="" 0,041161x3="" més="" 0,014972x1x2="" més="" 2,06050*10-4x1x3="" més="" 8}2}{56}x="" 8}2}{56}{0,041161x3="" més="" 0,014972x1x2="" més="" 2,06050*10-4x1x3="" més="" 8}2}{56}{56}="" x="" 1}x9.="" {56}},78730="" ×="" 10-3x{22="" -="" 2,89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0,91," p="0,012)." a="" partir="" de="" les="" equacions="" anteriors="" es="" pot="" veure="" que="" el="" coeficient="" de="" correlació="" de="" l'equació="" de="" regressió="" lineal="" multivariant="" és="" menor.="" la="" correlació="" entre="" les="" variables="" independents="" i="" dependents="" és="" molt="" baixa,="" i="" es="" va="" considerar="" desfavorable="" la="" seva="" utilització="" en="" el="" model="">

Però, el coeficient de correlació de l'equació binomial era alt i va resultar en un bon ajust. Per tant, es va seleccionar el model binomial. A partir d'una anàlisi exhaustiva de la figura de la superfície i el mapa de contorns combinats amb les dades experimentals (valor de DO prop de {{0}}.6), es va obtenir el rang òptim del mètode de purificació. A la figura 8, es pot veure que el valor màxim de DO es va generar quan el pH de la solució de mostra (A) estava en el rang de 9-10 i la concentració de l'eluent (B) estava en el rang del 79-85 per cent. . La figura 9 mostra que el valor màxim de DO es va obtenir quan el valor de pH de la solució de mostra (A) estava en el rang de 9-10 i el volum d'eluint (C) estava en el rang de 20-25 BV. La figura 10 mostra que el valor màxim de DO es va obtenir quan la concentració de l'eluent (B) estava en el rang del 80-85 per cent, i el volum de l'eluent (C) estava en el rang de 20-25 BV. A partir d'una anàlisi exhaustiva d'aquestes dades, es va determinar que el pH de la solució de mostra, la concentració de l'eluent i el volum de l'eluent estaven en el rang de 9-10, 80-85 per cent i 20-25 BV, respectivament. A partir de l'equació binomial multivariant per a resultats de derivades variables i esquema òptim, es va trobar que el millor mètode de purificació de TGCD era a una concentració d'eluent (etanol) del 85 per cent i un volum de 25 BV a un pH de 11. El valor de DO corresponent era de 0,8332. , i el rendiment total de glucòsids va ser del 73,0339 per cent. La impressió visual de les xifres 8-10 identifica que el millor mètode és aquell en què es van considerar les interaccions entre els dos factors, tot i que el millor mètode deduït de la fórmula reconeix aquell en què s'han inclòs les interaccions entre els tres factors. Els dos resultats van ser diferents i es va considerar que el mètode de purificació òptim era amb una concentració d'eluent (etanol) del 85 per cent i un volum de 25 BV a un pH d'11.

Mesura del creixement de l'úter

El coeficient de l'úter de cada grup es mostra a la taula 3. En comparació amb el grup control negatiu, els resultats dels altres grups van ser significativament diferents. Es va trobar que el TGCD obtingut a partir de 20 mètodes de purificació diferents exercien accions estrogèniques.

Experiment de confirmació

Els resultats exhaustius de la prova de creixement de l'úter i del CCD van mostrar que el mètode de purificació òptim es va considerar amb una concentració d'eluent (etanol) del 85 per cent i un volum de 25 BV a un pH d'11.

procés de validació, el rendiment mitjà dels glucòsids totals va ser del 70,9150 per cent. La desviació mitjana entre els valors previstos i reals va ser del 2,1180 per cent. Per tant, es pot suggerir que la predictibilitat i la credibilitat experimental d'aquest model són bones.

Identificació de TGCD després de la purificació

Basant-se en el temps de retenció i les dades de MS, es van especular 21 components naturals, incloent campneòsid 1, 2′-acetilacteòsid, cistanòsid A, cistànósida B, siringalida A 3'- - L-ramnopiranòsid, tubulòsid A, tubulòsid B, salidrosid, cistàsid G, àcid tenipòsid, decafeoilacteòsid, 8-àcid epilogànic, equinacòsid, cistànosida F, cistantubulòsid B1, isoacteòsid, acteòsid, cis-acteòsid, kankanòsid E, osmantuside B i cistàsid C. El temps de retenció, MS i MS/ La informació de MS, la fórmula i els compostos especulats es mostren a la taula 4.

Q-TOF-MS és especialment adequat per a la identificació estructural de components moleculars complexos de fàrmacs i aliments, ja que pot proporcionar possibles composicions elementals mitjançant la massa molecular exacta i les característiques estructurals dels ions del fragment. Per establir una caracterització estructural sistemàtica, també es van utilitzar Q-TOF-MS, dades de MS, cerca de bases de dades i literatura de referència publicada per a la identificació. La fórmula molecular de cada component objectiu es va deduir de l'ió progenitor i es va relacionar amb els compostos coneguts. Aquesta fórmula es podria determinar més a partir dels seus ions de fragments relacionats. Per exemple, el pic 5 va mostrar un ió desprotonat predominant a m/z 654 (C30H38O16), que era idèntic a la composició elemental del campneòsid 1. La pèrdua de cafeoil es va formar a partir d'un fragment d'ió a m/z 493, i la pèrdua de La part rha es va formar a partir d'un ió fragment a m/z 347.

Conclusió

Mitjançant una tecnologia LC-Q-TOF-MS, s'ha desenvolupat i validat completament un mètode d'anàlisi qualitatiu senzill i robust per a TGCD. Les dades de validació per a la selecció i identificació de compostos naturals de TGCD van ser satisfactòries. S'han especulat vint-i-un compostos bioactius del TGCD de la següent manera: salidroside, cistanòsid G, àcid genipòdic, decafeoilacteòsid, campneòsid 1, 8-àcid epilogànic, 2'-acetilacteòsid, cistàsid A, cistàsid B, siringalida A3′{99 }}L-ramnopiranòsid, echinacòsid, cistàsid F, cistantubulòside B1, isoacteòside, acteòside, tubulósida A, cis-acteòside, kankanòside E, osmanthuside B, cistànosida C i tubulòsid B. La caracterització estructural d'aquests compostos pot proporcionar una base experimental per a el seu control de qualitat i aplicació clínica posterior a causa de la seva activitat estrogènica. Això pot oferir una opció terapèutica nova i millorada per al tractament de la síndrome postmenopausa, evitant així els efectes secundaris i les reaccions adverses de la teràpia amb estrògens.

Abreviatures

TGCDCistanche deserticolaglicòsids totals LC/Q-TOF-MS cromatografia líquida/espectrometria de masses en temps de vol quadrupol

Metodologia de superfície de resposta RSM

Disseny compost central de CCD

Espectrometria de masses MS HPLC/Q-TOF-MS Cromatografia líquida d'alt rendiment/espectrometria de masses en temps de vol de quadrupol

ACN Acetonitril

Volum del llit BV

OD desitjabilitat general

Cromatografia líquida LC-MS-espectrometria de masses

Espectrometria de masses en temps de vol Q-TOF-MS quadrupol

Medicina tradicional xinesa MTC

Desviació estàndard relativa RSD

Agraïments

Aquest projecte va comptar amb el suport de la National Natural Science Foundation of China (núm. 81073015), Nature Scientific Foundation of Heilongjiang Province (ZD2017014), Young innovador talent training plan of the College in Heilongjiang Province (UNPYSCT- 2017209). Els autors declaren que no hi ha conflicte d'interessos pel que fa a la publicació d'aquest article.

Conflicte d'interessos

Els autors no afirmen cap conflicte d'interessos.

Referències

[1] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, glucòsids feniletanoides amb activitats antiinflamatòries de les tiges de Cistanche deserticola cultivades al desert de Tarim, Fitoterapia, 2013, 89, {{4} }.

[2] Guo Y., Cao L., Zhao Q., Zhang L., Chen J., Liu B., Zhao B., Caracteritzacions preliminars, l'activitat antioxidant i hepatoprotectora del polisacàrid de Cistanche deserticola, International Journal of Biological Macromolecules , 2016, 293, 678-685.

[3] Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y., Tu PF, iridoides antiinflamatoris de les tiges de Cistanche deserticola cultivades al desert de Tarim, Chinese Journal of Natural Medicines, 2016, 14, 61-65.

[4] Peng F., Chen J., Wang X., Xu C., Liu T., Xu R., Canvis en els nivells de glicòsids feniletanoides, activitat antioxidant i altres trets de qualitat en rodanxes de Cistanche deserticola per processament de vapor, productes químics i Pharmaceutical Bulletin (Tòquio), 2016, 64, 1024-1030.

[5] Wang T., Zhang X., Xie W., Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": a review, The American Journal of Chinese Medicine, 2012, 40, 1123-1141.

[6] Song Y., Song Q., Li J., Zhang N., Zhao Y., Liu X., Jiang Y., Tu P., Una estratègia integrada per diferenciar quantitativament la camamilla entreCistanche deserticolai C. tubulosa mitjançant espectrometria de masses de trampa lineal d'ions triple quadripol híbrid de cromatografia líquida d'alt rendiment, Journal of Chromatography A, 2016, 1429, 238-247.

[7] Li Y., Peng Y., Wang M., Zhou G., Zhang Y., Li X., Detecció ràpida i identificació de les diferències entre metabòlits deCistanche deserticolai extracte d'aigua de C. tubulosa en rates mitjançant anàlisi de reconeixement de patrons combinat UPLC-Q-TOF-MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 131, 364-372.

[8] Li WL, Sun XM, Song H., Ding JX, Bai J., Chen Q., Identificació basada en HPLC/Q-TOF-MS dels constituents absorbits i els seus metabòlits en sèrum i orina de rata després de l'administració oral de Cistanche deserticola Extract, Journal of Food Science, 2015, 80, H2079-2087.

[9] Almasi A., Dargahi A., Mohamadi M., Biglari H., Amirian F., Raei M., Eliminació de la penicil·lina G mitjançant la combinació de sonolisi i procés fotocatalític (sono-fotocatalític) a partir d'una solució aquosa: optimització del procés utilitzant RSM (Response Surface Methodology), Electron Physician, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Hou W., Zhang W., Chen G., Luo Y., Optimització de les condicions d'extracció per a l'activitat màxima fenòlica, flavonoide i antioxidant de les fulles de dades de bràctees de Melaleuca utilitzant la metodologia de la superfície de resposta, PloS One, 2016, 11,

[11] e0162139. Pooralhossini J., Ghaedi M., Zanjanchi MA, Asfaram A., L'elecció de l'extracció assistida per ultrasons juntament amb l'espectrofotometria per a la determinació ràpida d'àcid gàl·lic en mostres d'aigua: Disseny central compost per a l'optimització de les variables del procés, Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 34 , 692- 699.

[12] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Caracterització estructural i identificació de glucòsids feniletanoides deCistanches deserticola YC Maper UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochemical Analysis, 2012, 23, 668-676.

[13] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Anàlisi quantitativa de Cistanches Herba mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment juntament amb detecció de matrius de díodes i d'alt rendiment. espectrometria de masses de resolució combinada amb mètodes quimiomètrics. Journal of Separation Science, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Li WL, Chen Q., Yang B., Gao S., Zhang JJ, Screening of phyto-estrogenic effects effects and dosi ofCistanche deserticola, Herbes medicinals xineses, 2013, 5, 292-296.

[15] Li YP, Huang FR, Dong J., Xiao C., Xian RY, Ma ZG, Zhao J., Identificació ràpida de Cistanche mitjançant tecnologia d'imatge d'espectre de fluorescència combinada amb l'anàlisi de components principals i la distinció de Fisher, Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi, 2015, 35, 689-694.