La peroxidació lipídica lisosomal regula la immunitat del tumor
Sep 19, 2023
La inhibició lisosomal provocada pels inhibidors de la palmitoil-proteïna tioesterasa 1 (PPT1) com ara DC661 pot produir la mort cel·lular, però el mecanisme d'això no s'entén completament. No es van requerir vies de mort cel·lular programades (autofàgia, apoptosi, necroptosi, ferroptosi i piroptosi) per aconseguir l'efecte citotòxic de DC661. La inhibició de les catepsines, o la quelació de ferro o calci, no va rescatar la citotoxicitat induïda per DC661-. La inhibició de PPT1 va induir la peroxidació lipídica lisosomal (LLP), que va provocar la permeabilització de la membrana lisosomal i la mort cel·lular que es podria revertir amb l'antioxidant N-acetilcisteïna (NAC), però no per altres antioxidants de la peroxidació lipídica. Es necessitava el transportador de cisteïna lisosomal MFSD12 per al transport intralisosomal de NAC i el rescat de LLP. La inhibició de PPT1 va produir immunogenicitat intrínseca a la cèl·lula amb expressió superficial de calreticulina que només es va poder revertir amb NAC. Les cèl·lules tractades amb DC661-ceben cèl·lules T ingènues i van augmentar la toxicitat mediada per cèl·lules T. Els ratolins vacunats amb cèl·lules tractades amb DC661-va generar immunitat adaptativa i rebuig del tumor en tumors "immunes calents", però no en tumors "immunes freds". Aquestes troballes demostren que el LLP impulsa la mort de cèl·lules lisosomals, una forma immunogènica única de mort cel·lular, indicant el camí cap a combinacions racionals d'immunoteràpia i inhibició lisosomal que es poden provar en assaigs clínics.
Beneficis de cistanche tubulosa-Antitumor
Introducció
Amb una activitat encoratjadora en assaigs clínics que involucren l'inhibidor lisosomal hidroxicloroquina (HCQ) (1), la identificació de la palmitoil-proteïna tioesterasa 1 (PPT1) com a diana molecular dels derivats de la cloroquina (2) i el llançament de nous inhibidors de PPT1 a la clínica. assaigs (3, 4), cal entendre el mecanisme pel qual els inhibidors lisosomals indueixen la mort cel·lular i l'efecte de la inhibició lisosomal sobre la immunitat del tumor. El mecanisme canònic de mort de cèl·lules lisosomals descrit per a HCQ implica la permeabilització de la membrana lisosomal (LMP), la fuita de catepsines i l'activació de l'apoptosi mediada per la caspasa (5, 6). Prèviament hem demostrat que l'inhibidor lisosomal DC661 penetra les cèl·lules en el microambient del tumor àcid i es localitza al lisosoma de manera més eficient que HCQ (2, 7). DC661 produeix una mort cel·lular potent en moltes línies de cèl·lules canceroses (2). DC661 s'uneix i inhibeix PPT1, desacidifica el lisosoma i inhibeix l'autofàgia. DC661 també indueix LMP i augmenta els nivells de caspasa 3 escindida (2, 7). En els darrers anys, s'han definit nous mecanismes de mort cel·lular que tenen conseqüències immunogèniques i inclouen necroptosi, ferroptosi i piroptosi (8). S'ha demostrat que l'autofàgia depenent del lisosoma degrada el MHC de classe I (9), així com els components de l'immunoproteasoma (10), cosa que suggereix que la inhibició de l'autofàgia pot millorar el processament de l'antigen. Tanmateix, els efectes immunogènics de la inhibició lisosomal i la mort cel·lular consegüent no s'han caracteritzat completament. Per abordar aquest buit de coneixement, vam investigar els efectes de DC661 sobre els mecanismes de mort cel·lular canònica per determinar si la mort cel·lular lisosomal és la seva forma de mort cel·lular o simplement un precursor d'un dels altres mecanismes establerts. Vam trobar que HCQ i DC661 van induir un augment significatiu en només un petit nombre de proteïnes al proteoma del melanoma i la majoria d'aquestes eren proteïnes relacionades amb l'autofàgia i l'apoptosi. Els inhibidors de la mort cel·lular programada (apoptosi, necroptosi, ferroptosi i piroptosi) no van mitigar els efectes citotòxics després del deteriorament lisosomal per DC661. La peroxidació lipídica lisosomal (LLP) és un dels principals motors de la mort cel·lular induïda per LMP associada a l'expressió de calreticulina (CALR) a la superfície cel·lular. Aquesta forma de mort cel·lular només es pot revertir mitjançant l'ús de l'antioxidant N-acetilcisteïna (NAC). L'activitat del NAC es va veure afectada per la inhibició de l'importador de cisteïna lisosomal MFSD12. LLP va provocar fenotips immunogènics que promouen la matança mediada per cèl·lules T. Aquestes troballes demostren que la mort de cèl·lules lisosomals és una forma potencialment única de mort cel·lular immunogènica.
planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari
Resultats
La inhibició lisosomal indueix canvis significatius en el proteoma associat a l'autofàgia i l'apoptosi. Per establir els efectes citotòxics dels inhibidors lisosomals, es va avaluar la viabilitat del melanoma A375P, el carcinoma de còlon RKO i les línies cel·lulars de càncer de pàncrees MIA PaCa-2 tractades amb l'inhibidor vacuolar de la H+-ATPasa bafilomicina-A1 (1 00 nM); Inhibidors de PPT1 DC661 (3 μM) o HCQ (10 μM o 30 μM); palmitat mimètic fluorur d'hexadecil sulfonil (HDSF; 60 μM); inhibidors de la catepsina pepstatina A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) o PepA+E64; i bromhidrat d'èster metílic de Leu-Leu disruptor de la membrana lisosomal (20 μM) durant 48 hores. Només la bafilomicina-A1 i DC661 van provocar una disminució significativa de la viabilitat cel·lular a través de les línies cel·lulars de càncer (figura 1A i figura suplementària 1A; material suplementari disponible en línia amb aquest article; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), amb DC661 produint una reducció més profunda de la viabilitat cel·lular que la bafilomicina-A1. A partir d'aquestes dades i de les propietats farmacològiques dels derivats de la cloroquina, vam centrar el nostre estudi en els derivats de la cloroquina com a eines per entendre la mort de les cèl·lules lisosòmiques. Es va aplicar una anàlisi global del proteoma imparcial a les cèl·lules de melanoma A375P tractades amb DC661 (3 μM) o l'HCQ menys potent (10 μM o 30 μM) durant 24 hores. De les 4.264 proteïnes quantificades d'alta confiança, només 87 i 55 proteïnes van augmentar significativament amb DC661 (3 μM) i HCQ (30 μM), respectivament; a més, 14 i 15 proteïnes es van reduir significativament amb DC661 (3 μM) i HCQ (30 μM), respectivament (canvi absolut de vegades superior a 2; q <0, 05) amb DC661 (3 μM) o HCQ (30 μM), respectivament , en comparació amb el control del vehicle. La dosi més baixa d'HCQ (10 μM) no va mostrar canvis significatius de proteïnes en comparació amb el control del vehicle. Les 50 proteïnes principals que van augmentar significativament després del tractament amb DC661 es van associar principalment amb l'autofàgia i l'apoptosi, i es van observar canvis similars per a la dosi més alta d'HCQ (figura 1B). Per aquests motius, vam optar per centrar més estudis en el DC661 més potent. Exemples d'alguns dels canvis proteics més grans associats amb l'autofàgia i l'apoptosi van ser la proteïna 1 d'unió a l'impost1-(TAX1BP1; augmentat 15-); BCL2-proteïna 3 que interacciona (BNIP3; augment 6-plegada); veí de la proteïna del gen 1 de BRCA1 (NBR1; augment 12- vegades); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; augmentat 5-plegada); coactivador del receptor nuclear 4 (NCOA4; augmentat 3-pleg); i LC3B (MAP1LC3B; augmentat 3-plegada). L'apolipoproteïna B-100 (APOB; augmentat 66-plegada) es va derivar del sèrum fetal de vedella i no es va estudiar més. L'immunoblotting va confirmar que el tractament amb DC661 o concentracions més altes d'HCQ va produir augments marcats en l'expressió dels receptors de càrrega d'autofàgia NBR1, TAX1BP1, SQSTM1 / p62 i NCOA4 de manera dependent de la dosi i del temps (figura suplementària 1, B i C). CRISPR / Cas9 KO de PPT1 a les cèl·lules A375P van fenocopiar els efectes de DC661 sobre aquestes proteïnes en comparació amb els seus homòlegs WT (figura suplementària 1D). Tanmateix, l'expressió dels receptors de càrrega d'autofàgia i els augments relatius induïts pel tractament amb DC661 van ser variables a través del càncer de còlon, càncer de pàncrees i altres línies cel·lulars de melanoma en les quals DC661 demostra citotoxicitat (figura suplementària 1E). Això va suggerir que els propis receptors de càrrega d'autofàgia, encara que augmentats a nivell de proteïnes, és poc probable que siguin responsables de la mort cel·lular després del tractament amb DC661. Per confirmar-ho, ens vam centrar en els receptors de càrrega d'autofàgia TAX1BP1 i BNIP3 perquè tenen efectes proapoptòtics coneguts a les cèl·lules canceroses (figura 1C). TAX1BP1 és un adaptador de càrrega d'autofàgia (11) i també regula l'apoptosi induïda per inhibidors de la síntesi de proteïnes o agents perjudicials per a l'ADN a les cèl·lules canceroses (12). La derrota de TAX1BP1 per siRNA (figura 1D) no va afectar la citotoxicitat induïda per DC661-en assajos de viabilitat a curt termini (figura 1E) i a llarg termini (figura 1F). Aquests resultats van demostrar que TAX1BP1 no té un paper essencial en la citotoxicitat mediada per DC{126}. BNIP3 és una proteïna proapoptòtica que perjudica la bioenergètica mitocondrial i regula la mitofagia (13). La derrota efectiva de BNIP3 (figura 1G) no va afectar la citotoxicitat induïda per DC661-(figures 1, H i I). Aquests resultats van mostrar que els efectes citotòxics de DC661 són independents de l'expressió de BNIP3. A continuació, vam estudiar els efectes de l'esgotament de les cèl·lules dels gens d'autofàgia canònics necessaris per a la producció d'autofagosoma sobre l'eficàcia de DC661 enderrocar unc-51 com la cinasa activadora de l'autofàgia 1 (ULK1) i el gen 7 relacionat amb l'autofàgia (ATG7). La derrota efectiva d'ULK1 o ATG7 (figura suplementària 2, A i B) va inhibir el flux autofàgic (figura suplementària 2C), però no va afectar la citotoxicitat induïda per DC 661- (figura 1, J-M). Aquests resultats van mostrar que l'absència de la maquinària bàsica d'autofàgia bàsica no anul·la els efectes citotòxics de DC661. La inhibició lisosomal per DC661 indueix múltiples vies programades de mort cel·lular. El punt de vista canònic és que la mort de cèl·lules lisosòmiques es deu a l'apoptosi (5). L'immunoblotting va revelar que el tractament amb DC661 va provocar l'activació de la caspasa-3, -7 i -9 i la divisió de PARP-1, confirmant que DC661 va activar l'apoptosi (figura 2A). L'inhibidor de la pan-caspasa Z-VAD-FMK va impedir l'activació de la caspasa per DC661, però no va inhibir l'acumulació de LC3B i p62, demostrant que l'activació de l'apoptosi i el bloqueig de l'autofàgia són separables després de la inhibició lisosomal (figura 2B). El bloqueig de l'apoptosi amb ZVAD-FMK no va millorar ni limitar la citotoxicitat de DC661, cosa que suggereix que l'apoptosi és prescindible per a la mort de cèl·lules lisosòmiques (figura 2, C i D). Els efectes citotòxics de DC661 eren similars a les cèl·lules de medul·la òssia primària Bax/Bak doble-KO incapaces de patir apoptosi i cèl·lules WT (figura 2E). El bloqueig de l'apoptosi tampoc va afectar la citotoxicitat induïda per DC661-en el càncer de còlon i les cèl·lules de càncer de pàncrees (figura suplementària 2, D-F). Com que vam trobar que l'apoptosi era prescindible per a la mort cel·lular induïda per DC661-, vam investigar si DC661 indueix la necroptosi, una altra forma de mort cel·lular programada regulada per la proteïna quinasa que interacciona amb el receptor (RIPK) i la proteïna semblant al domini de llinatge cinasa mixta ( MLKL). Els nivells de les formes fosforilades i activades de RIPK i MLKL van augmentar després del tractament amb DC661 de 0, 1 a 1 μM (figura 2F). A 3 μM DC661 hi havia una absència de RIPK1 fosforilada però MLKL fosforilada persistent, cosa que suggereix que, a aquesta concentració més alta, es podrien implicar formes addicionals de mort cel·lular. El pretractament amb els inhibidors de RIPK1 necrostatina-1 o necrostatina-1s o l'inhibidor de MLKL necrosulfonamida va impedir la fosforilació de RIPK1 després del tractament amb DC661 (1 μM) a les cèl·lules de melanoma (figura 2G), però no va poder rescatar DC{{192 }} citotoxicitat induïda a cèl·lules de melanoma (figura 2H) o càncer de còlon o cèl·lules de càncer de pàncrees (figura suplementària 2G). Aquestes troballes suggereixen que la necroptosi està activada però prescindible per a la mort cel·lular mediada per DC{195}}.
Figura 1. La inhibició de l'autofàgia lisosomal indueix canvis significatius en les proteïnes de l'apoptosi i l'autofàgia. (A)
Els lisosomes són un dels principals llocs d'emmagatzematge del ferro. El metabolisme intracel·lular del ferro desregulat juntament amb una capacitat reductora disminuïda pot desencadenar una mort cel·lular no apoptòtica coneguda com ferroptosi. Un segell distintiu de la ferroptosi és la regulació positiva de la prostaglandina-endoperòxid sintasa 2 (PTGS2), l'homòleg 1 del regulador de transport de cations (CHAC1) i la cisteinil-ARNt sintetasa (CARS) (14). Tots 3 d'aquests marcadors de ferroptosi van ser regulats transcripcionalment pel tractament amb DC661 (figura 3A), cosa que suggereix que la inhibició lisosomal indueix ferroptosi. DC661 va induir un canvi de fluorescència a les cèl·lules A375P tractades amb C11-BODIPY, cosa que indica una peroxidació lipídica, característica de la ferroptosi. Aquest canvi induït per DC661-es va invertir significativament en presència d'inhibidors de ferroptosi ferrostatina-1 o roxstatina-1 de llavi administrats a una concentració efectiva (figura 3B i figura suplementària 3A), cosa que indica a més que DC661 ferroptosi induïda. Tanmateix, la inhibició de la ferroptosi no va rescatar la citotoxicitat associada a DC661 (figura 3, C i D). El cotractament de cèl·lules canceroses amb el quelant de ferro deferoxamina (DFO) i DC661 no va rescatar la citotoxicitat de DC661 (figura 3E). El tractament amb ferrostatina-1, roxstatina de llavis-1 o DFO no va rescatar la inhibició del DC661 de la viabilitat a curt termini o el creixement clonogènic a llarg termini en cèl·lules de melanoma, còlon i càncer de pàncrees (figura suplementària 3, B). –E, i figura suplementària 4, A–D). Aquestes dades demostren que la ferroptosi està activada però prescindible per a la mort cel·lular mediada per DC661-. Una piroptosi és una forma de mort cel·lular programada associada a una resposta inflamatòria que implica l'activació de caspases que processen la gastrina (GSDM), permetent la formació de porus a la membrana plasmàtica i l'alliberament posterior de patrons moleculars associats a danys, com ara l'alta mobilitat. quadre de grup 1 (HMGB1). El tractament amb DC661 en múltiples línies cel·lulars de melanoma (A375P, A375, WM35 i WM793) va donar lloc a l'activació de la caspasa iniciadora-8 i -9 i la caspasa botxí{-7, típica de la piroptosi, i va produir clivage de GSDME de longitud completa, similar en extensió al conegut inductor de piroptosi PLX4720 i PD0325901 (figura suplementària 5A). DC661 va produir un alliberament extracel·lular més fort de HMGB1 que el conegut inductor de piroptosi, BRAF i inhibició de MEK en un 1% de FBS (15), cosa que reflecteix la conseqüència funcional de la piroptosi activada. A continuació, vam provar si la inhibició de la piroptosi per GSDME KO milloraria els efectes citotòxics de DC661. El tractament amb DC661 va induir l'acumulació de LC3II i SQSTM1/p62 i l'activació de la caspasa, però l'alliberament de HMGB1 es va abolir gairebé completament a les cèl·lules humanes GSDME-KO WM35, demostrant que es va aconseguir la conseqüència funcional d'inhibir la piroptosi (figura 3F). Tanmateix, el tractament amb DC661 va produir una citotoxicitat igual a YUMM1.7 WT, vector buit (EV) i cèl·lules Gsdme KO1 i KO2 tant en condicions de FBS del 10% com de l'1% (figura 3G i figura suplementària 5B). Un resultat comú de múltiples formes de mort cel·lular és l'alliberament de LDH. DC661 va produir un augment significatiu de l'alliberament de LDH, i això no es va poder revertir mitjançant la inhibició de l'apoptosi, la necroptosi o la ferroptosi (figura suplementària 5C). Aquests resultats van demostrar que DC661 indueix múltiples modes de mort cel·lular, incloses l'apoptosi i la piroptosi, així com la necroptosi i la ferroptosi, però cap d'aquests modes de mort cel·lular és necessari per a la mort cel·lular induïda per DC661-. La inhibició de la catepsina o la quelació del calci no impedeix la mort cel·lular per la permeabilització de la membrana lisosomal. Després d'haver demostrat que l'activació de la caspasa (que és necessària per a l'apoptosi i la piroptosi) és prescindible per a la mort cel·lular induïda per DC661-, vam plantejar la hipòtesi que l'alliberament de catepsina dels lisosomes podria causar la mort cel·lular depenent de la caspasa. La inhibició química (DC661) o genètica (PPT1 siRNA [siPPT1]) de PPT1 va produir permeabilització de la membrana lisosomal (LMP), mentre que HDSF, un inhibidor irreversible menys potent de PPT1 que s'esgota ràpidament en cultiu cel·lular, no va poder induir LMP, tal com es va mesurar. per galectina-3-punta positiva (figura 4A). LMP dóna lloc a l'alliberament de catepsines i altres continguts lisosomals al citoplasma i es creu que és una característica proximal clau de la mort cel·lular basada en lisosomes. La LMP induïda per DC661 es va associar amb un augment significatiu de l'activitat citoplasmàtica de la catepsina-L, que es va bloquejar significativament amb un inhibidor de la cisteïna proteasa E64 (figura 4B). Informes anteriors han suggerit que l'alliberament de catepsina dels lisosomes fracturats promou l'activació de la caspasa, donant lloc a la mort de cèl·lules apoptòtiques (16-18). La inhibició completa de la catepsina no va impedir la divisió de la caspasa (figura 4C) i no va rescatar la citotoxicitat induïda per DC661-en assajos de viabilitat a curt i llarg termini en melanoma (figura 4, D i E), càncer de còlon i pàncrees. cèl·lules canceroses (figura suplementària 6, A–C). Aquests resultats contraresten la visió canònica de la mort cel·lular lisosomal impulsada per la mort cel·lular mediada per la catepsina. A més de l'alliberament de catepsina dels lisosomes amb fuites, l'alliberament de calci dels lisosomes s'ha implicat en la disfunció cel·lular quan el PPT1 està deteriorat (19). El tractament amb DC661 va donar lloc a un alliberament extensiu de calci, que es va abrogar amb el pretractament del quelant permanent de calci (Ca2+), BAPTA-AM. (Figura 4F). En particular, BAPTA-AM no va impedir la LMP induïda per DC{105}(figura 4G) o la divisió de la caspasa (figura suplementària 6, D i E) i, el més important, no va rescatar la citotoxicitat induïda per DC{108} ( Figura 4H). Aquestes troballes també es van observar tant a les línies cel·lulars RKO com a MIA PaCa-2, en les quals no es van observar diferències significatives en els valors d'IC50 amb BAPTA-AM i DC661 (figura suplementària 6F), cosa que va suggerir que la mort cel·lular associada a LMP és no depèn del calci ni de les catepsines.
Figura 2. Apoptosi i necroptosi induïdes per DC661-. (A)
Figura 3. Ferroptosi i piroptosi induïdes per DC661-. (A)
LLP impulsa LMP. Havent establert que els inhibidors de les principals vies de mort cel·lular (apoptosi, necroptosi, ferroptosi i piroptosi), catepsines (PepA i E64) i quelants d'ions (BAPTA-AM [Ca2+] i DFO [Fe{{3}). }]) no va prevenir la mort cel·lular per DC661 i, trobant proves de peroxidació lipídica per C-11-BODIPY, vam realitzar una anàlisi global de lipidomes a les 2 i 4 hores després del tractament amb DC661. DC661 va induir precoçment i va mantenir augments de 3- a 10- vegades en totes les classes de lisofosfolípids (figura 5A). En canvi, es van observar canvis mínims o cap a les classes de fosfolípids, incloses la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol, el fosfatidilglicerol i l'àcid fosfatídic (figura suplementària 7A). Les espècies de lisofosfolípids poden ser generades per ROS, que oxida la cadena d'àcids grassos saturats que després és escindida per les fosfolipases (20). Per determinar si els antioxidants podrien prevenir el dany lipídic mediat per ROS, vam investigar la citotoxicitat induïda per DC661-en presència de l'eliminador de pan-ROS N-acetilcisteïna (NAC) (21, 22) i els putatius inhibidors de la peroxidació lipídica Trolox (23). ) i vitamina C (àcid ascòrbic) (24, 25). A diferència de qualsevol dels altres agents provats fins ara, el cotractament amb NAC va rescatar la citotoxicitat associada a DC661-a través de múltiples línies cel·lulars (figura 5B i figura suplementària 7B). Els assajos de CFU a llarg termini van demostrar que NAC, a diferència de tots els inhibidors de la mort cel·lular, els quelants iònics i els inhibidors de la catepsina provats aquí, va prevenir els efectes citotòxics de DC661 a les cèl·lules A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 i MC38 ( Figura 5C i figura suplementària 7C). Curiosament, Trolox i la vitamina C no van rescatar la citotoxicitat de DC661 en melanoma humà, càncer colorectal, cèl·lules de càncer de pàncrees i melanoma murí i cèl·lules de càncer colorectal (figura 5D i figura suplementària 7, D-H). Aquesta disparitat ens va portar a provar si NAC, Trolox i la vitamina C van afectar la LMP. Els nostres resultats van mostrar que el NAC era l'únic antioxidant que va reduir significativament la LMP induïda per DC661-(figura 5E). Vam plantejar la hipòtesi que LLP impulsa la producció de LMP per DC661, que pot ser revertida per NAC però no per Trolox i la vitamina C. Per estudiar el procés de LLP vam utilitzar la sonda fluorescent FOAM-LPO (26), que es localitza específicament al lisosoma i produeix un desplaçament espectral de 586 a 512 nm (vermell a verd) quan s'exposa a peròxids de lípids. Hem trobat que DC661 va induir LLP en comparació amb el control (figura 5F). NAC va reduir la peroxidació lipídica als lisosomes de les cèl·lules de melanoma tractades amb DC661-, mentre que Trolox i la vitamina C no van reduir la LLP (figura 5F). NAC, Trolox i vitamina C per si sols no van tenir cap efecte significatiu sobre la peroxidació lipídica. La derrota de PPT1 (figura suplementària 8A) o el tractament amb altes concentracions d'HCQ (figura suplementària 8B) també van induir LMP que es podria revertir per NAC, mentre que la inhibició química d'ULK1 no va induir LMP (figura suplementària 8C). És important destacar que la derrota de siPPT1 també va incloure LLP que es podria revertir amb NAC (figura suplementària 8D) Aquests resultats van mostrar que la inhibició de PPT1 indueix LLP que pot ser rescatada per NAC i és probable que sigui la causa de la LMP induïda per la inhibició de PPT 1-. A més, aquestes troballes van suggerir que la LLP és fonamental per a la mort de cèl·lules lisosòmiques.
Planta de cistanche herba xinesa-Antitumor
La importació de cisteïna als lisosomes per MFSD12 atenua la mort de les cèl·lules lisosòmiques. Dels 3 inhibidors de la peroxidació lipídica, només el NAC va prevenir el LLP. Un informe recent va demostrar que el domini de la superfamília facilitador principal que conté 12 (MFSD12) és un component essencial de l'importador de cisteïna per a lisosomes i melanosomes (27). Vam raonar que NAC, o el seu metabòlit cisteïna, es transporta al lisosoma a través de MFSD12, on la cisteïna s'oxida al seu disulfur, la cisteïna. Per provar aquesta hipòtesi, vam comparar la capacitat del NAC per rescatar la citotoxicitat de DC661 a les cèl·lules siNT i siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Els nostres resultats van mostrar que NAC va rescatar LMP induïda per DC661-a les cèl·lules siNT, però no va rescatar LMP a les cèl·lules siMFSD12 (figura 6A). NAC va reduir el LLP de cèl·lules siNT-A375P tractades amb DC661-, però no de cèl·lules siMFSD12. Les cèl·lules siMFSD12 tractades amb DMSO o NAC havien augmentat la LLP basal (figura 6B) en comparació amb les cèl·lules siNT. Mentre que NAC va rescatar la citotoxicitat DC661 a les cèl·lules siNT, la capacitat de NAC de rescatar la citotoxicitat DC661 es va abrogar completament a les cèl·lules siMSFD12 (figura 6C). Això va demostrar que la derrota de MFSD12 bloqueja els efectes citoprotectors de NAC contra DC661. NAC és desacetilat per acilasa al citosol (28). Per determinar si el tractament amb NAC produeix una acumulació de cisteïna o cistina dins dels lisosomes, hem utilitzat la tècnica d'immunoprecipitació lisosomal (Lyso-IP) (29) per purificar els lisosomes de cèl·lules A375P tractades amb DMSO i NAC (figura 6D i figura suplementària 9A) i hem realitzat metabolòmica dirigida per quantificar NAC i metabòlits relacionats. Com era d'esperar, es va detectar NAC en el lisat de cèl·lules senceres tractat amb NAC i les fraccions no lligades associades. Els nivells de L-cisteïna van augmentar substancialment als lisosomes tractats amb NAC. La L-cistina només es va detectar dins dels lisosomes tractats amb NAC. Sorprenentment, no vam trobar un augment significatiu del glutatió (reduït) en els grups tractats amb NAC (figura 6E); això va ser sorprenent perquè es creu comunament que el tractament amb NAC indueix una major producció de glutatió, corregint l'equilibri redox. Aquests resultats suggereixen que la cisteïna importada als lisosomes mitjançant l'importador MFSD12 és fonamental per rescatar LLP, LMP i la mort de cèl·lules lisosòmiques. LLP és immunogènic. Algunes formes de mort cel·lular regulada induïda per DC661 (piroptosi, necroptosi, ferroptosi) s'han identificat com a immunogèniques. Anteriorment, s'ha descrit la mort de cèl·lules immunogèniques per a fàrmacs de quimioteràpia basant-se en trets característics, que inclouen la visualització de patrons moleculars associats al dany, inclosa l'expressió de la superfície cel·lular de CALR i l'alliberament de la proteïna HMGB1 i el trifosfat d'adenosina (ATP) (30). CALR actua com un senyal de "menjar-me" quan s'exposa a les superfícies cel·lulars durant l'estrès cel·lular. L'alliberament extracel·lular de HMGB1 i ATP actua com un senyal de "troba'm" reconegut per les cèl·lules fagocítiques. Hem comparat dos models: les cèl·lules B16F10, que en models de tumors singènics estan gairebé completament desproveïdes de limfòcits infiltrants de tumors, i les cèl·lules MC38, que en models de tumors singènics tenen limfòcits infiltrants de tumors. En primer lloc, vam demostrar que el tractament amb DC661 o siPpt1 indueix significativament l'expressió CALR superficial que es pot abrogar completament amb el cotractament NAC a les cèl·lules MC38 (figures 7, A i B). Es van observar troballes similars a les cèl·lules B16F10 (figura 7C). Els inhibidors de les principals vies de mort cel·lular (apoptosi, necroptosi, ferroptosi i piroptosi) no van poder prevenir l'expressió superficial de CALR (figura 7D). Per determinar si la mort de cèl·lules immunogèniques induïda per DC661 es deu a la regulació de la classe I del MHC, les cèl·lules B16F10 i MC38 es van tractar amb DC661 (3 μM) o DMSO durant 24 hores. Vam trobar que el tractament amb DC661 no va augmentar l'expressió de la classe I del MHC i la regulació de l'immunoproteasoma (figura 7E i figura suplementària 9, B i C).
Figura 4. La inhibició de la catepsina o la quelació del calci no impedeix la mort cel·lular induïda per DC661-. (A)
Per entendre els efectes de la inhibició de l'autofàgia sobre l'encebació de cèl·lules T, vam realitzar un experiment d'encebació i cocultiu in vitro utilitzant esplenòcits C57BL6/J tal com es va descriure anteriorment (31). Per a la preparació, vam exposar els esplenòcits a cèl·lules B16F10 o MC38 tractades amb DC661- o DMSO. A continuació, es van cultivar aquests esplenòcits primers amb cèl·lules vives B16F10 o MC38 i es va mesurar la citotoxicitat (figura 8A). Els esplenòcits preparats amb cèl·lules B16F10 tractades amb DC661- van produir un augment significatiu d'IFN en comparació amb els esplenòcits exposats a cèl·lules B16F10 tractades amb DMSO. La matança mediada per cèl·lules T cebades de cèl·lules B16F10 en proliferació es va incrementar significativament en els esplenòcits cebats amb DC661-en comparació amb els esplenòcits cebats amb DMSO (figura 8, B i C). Les cèl·lules MC38 tractades amb DC661 van produir encara més citotoxicitat de cèl·lules T primeres i IFN en comparació amb les cèl·lules B16F10 (figura 8, D i E). El cotractament de NAC amb DC661 va ser capaç d'abrogar completament l'alliberament d'IFN dels esplenòcits i la citotoxicitat de les cèl·lules T primerades (figura 8, F i G). La derrota de calreticulina per siCalr a les cèl·lules MC38 (figura suplementària 9D) va abrogar l'eficàcia inicial del tractament amb DC661 i va reduir significativament la citotoxicitat de les cèl·lules T cebades (figura 8, H i I). En conjunt, aquestes dades donen suport a un paper mecanicista de la regulació CALR associada a LLP en la promoció de la immunitat de les cèl·lules T antitumorals. A continuació, vam ampliar aquestes troballes in vitro a un estudi de vacunació antitumoral in vivo en models de ratolins immunocompetents i immunodeficients. Per a aquest assaig, es van injectar cèl·lules B16F10 o MC38 in vitro congelades descongelades o tractades amb DC661-sc al flanc esquerre per protegir els ratolins immunocompetents C57BL/6 o NOD/SCID contra el repte amb cèl·lules tumorals vives del mateix tipus injectades. 7 dies després al flanc dret (figura 9A). Les cèl·lules B16F10 tractades amb DC661-no van poder prevenir el rebuig del tumor malgrat els assajos in vitro, cosa que suggereix que DC661 va induir la mort de cèl·lules immunogèniques (figura 9B i figura suplementària 9E). En canvi, la inoculació d'un flanc amb cèl·lules MC38 tractades amb DC661- va promoure el rebuig complet de les cèl·lules MC38 vives implantades al flanc oposat (figura 9C i figura suplementària 9F). Per determinar si la immunitat adaptativa era fonamental per a l'efecte de la vacuna que semblava tenir DC661 amb els tumors MC38, vam repetir l'experiment en ratolins NOD/SCID. Sorprenentment, vam trobar que les cèl·lules MC38 tractades amb DC661-no van induir el rebuig dels tumors de repte en ratolins NOD/SCID immunodeficients (figura 9D i figura suplementària 9G), cosa que indica que es necessitava immunitat adaptativa per a l'efecte de la vacuna observat. Per provar la robustesa d'aquesta troballa, vam seleccionar una altra línia cel·lular de càncer de ratolí immunogènica coneguda, CT26, i vam realitzar l'experiment de vacunació com a anterior. Com era d'esperar, la implantació de cèl·lules CT26 tractades amb DC661-en un flanc del ratolí va produir un efecte semblant a la vacuna i va evitar el creixement de cèl·lules CT26 vives implantades a l'altre costat (figura 9E i figura suplementària 9H). Els nostres resultats van suggerir que la LLP induïda per DC661- és fonamental per a la mort de cèl·lules immunogèniques mediada per LMP, que es reverteix per la importació de cisteïna al lisosoma mitjançant el transportador lisosomal MFSD12 (figura 9F).
Discussió
La inhibició lisosomal sembla ser un enfocament terapèutic prometedor en estudis preclínics, i els assaigs clínics amb HCQ han produït resultats encoratjadors però contradictoris (1, 32). PPT1 és l'objectiu molecular de l'HCQ, i els inhibidors de PPT1 més potents, com ara DC661 (2) i GNS561 (3), indueixen la mort cel·lular mediada per LMP in vitro. El mecanisme precís de la mort de les cèl·lules lisosòmiques i el seu paper en la immunogenicitat del tumor no s'ha dilucidat del tot. La immunitat antitumoral es millora quan la inhibició de l'autofàgia es combina amb la immunoteràpia (9, 10, 31). Els mecanismes proposats per a la immunogenicitat intrínseca de la cèl·lula després de la inhibició de l'autofàgia inclouen la classe I del MHC i la regulació de l'immunoproteasoma, que donen suport al processament i la presentació d'antigen millorats. A més, la pèrdua de proteïnes d'autofàgia o la inhibició de l'autofàgia per part de la cloroquina va augmentar la resposta de les cèl·lules T CD8+ augmentant els nivells superficials de MHC de classe I a les cèl·lules dendrítiques (33). Prèviament vam demostrar que la inhibició sistèmica de PPT1 pot repolaritzar els macròfags d'un fenotip M2 a M1. Els inhibidors de PPT1 poden millorar els nivells de STING, donant lloc a l'alliberament d'IFN i l'augment de la mort mediada per cèl·lules T en models de melanoma (31). Aquí, vam demostrar que el propi LLP produeix una forma immunogènica intrínseca de cèl·lules tumorals de mort cel·lular. Vam trobar que la inhibició lisosomal induïa molt pocs canvis de proteïnes a les cèl·lules canceroses i que les proteïnes més elevades significativament incloïen receptors de càrrega d'autofàgia i reguladors de l'apoptosi. El nostre enfocament dirigit a alguns d'aquests gens a través de funcions va demostrar que les proteïnes induïdes per fàrmacs no eren probablement els principals reguladors de la mort cel·lular. La inhibició genètica d'ULK1 o ATG7 tampoc va rescatar la citotoxicitat de DC661. Hem demostrat que la inhibició lisosomal activa múltiples formes de mort cel·lular programada, incloses l'apoptosi, la necroptosi, la ferroptosi i la piroptosi, però cadascuna d'elles era prescindible per a la citotoxicitat induïda per fàrmacs. Cal destacar que els mecanismes programats de mort cel·lular es poden solapar i l'orientació conjunta de múltiples mecanismes de mort cel·lular podria proporcionar citoprotecció contra la mort cel·lular després de la permeabilització de la membrana lisosomal. El nostre treball ha descartat els mecanismes dependents de la catepsina i del calci per a la mort de cèl·lules lisosòmiques i ha destacat la importància de la LLP com a determinant crític de la mort cel·lular. Vam trobar proves de LLP que era reversible per un antioxidant que es va transportar al lisosoma, NAC i era crític per a la permeabilització de la membrana lisosomal i la citotoxicitat. NAC va ser l'únic agent capaç de mitigar o revertir la mort cel·lular induïda per DC661-, i aquesta capacitat depenia de la presència del transportador de cisteïna lisosomal MFSD12. La manca de penetració lisosomal és probable que altres inhibidors de la peroxidació lipídica putatius, Trolox i vitamina C, no poguessin prevenir la citotoxicitat de DC661. El NAC es converteix en cisteïna, que s'importa als lisosomes i s'oxida a la seva forma disulfur, la cistina. La cistina s'exporta al citosol per un altre transportador lisosomal, la cistinosi, on es redueix a cisteïna que remobilitza les fonts internes de nutrients, reactiva l'objectiu del complex 1 de rapamicina i promou l'autofàgia (34). Aquest cicle d'oxidació-reducció de la cisteïna a la cistina (lisosomes) i la tornada a la cisteïna (citosol) podria ser un possible mecanisme de rescat de NAC contra la citotoxicitat de DC661 o una lesió lisosomal més general en altres contextos de malaltia on la NAC ha demostrat ser útil terapèuticament (35) . NAC no només va invertir LLP i LMP induïts per DC661-, sinó també una expressió superficial del marcador de mort cel·lular immunogènica calreticulina. L'expressió de la superfície cel·lular de la proteïna CALR era necessària per a la citotoxicitat millorada mediada per cèl·lules T induïda per esplenòcits cebats amb DC661-, demostrant que la inhibició lisosomal produeix una forma específica d'immunogenicitat intrínseca a la cèl·lula.
Tot i que estudis anteriors han demostrat que la inhibició lisosomal pot millorar l'activitat antitumoral de la inhibició del punt de control immune en tumors de flanc establerts (9, 31), el nostre estudi és el primer que sabem que demostra un efecte semblant a la vacuna per als tumors MC38 però no per als tumors B16 en cèl·lules tumorals pretractades amb DC661 abans de la implantació. Això demostra que la mort de cèl·lules lisosomals pot induir immunogenicitat intrínseca a la cèl·lula, però aquests canvis per si mateixos no són prou probables per revertir un microambient tumoral "immune fred" en un microambient tumoral "immune calent". Els nostres estudis anteriors en models de microambient tumoral "fred immune" B16 i BRafCA PtenloxP Tyr: models de ratolí modificats genèticament CreERT2 (31) van demostrar que la inhibició lisosomal sistèmica produïa efectes sobre els macròfags associats al tumor i les cèl·lules supressores derivades de cèl·lules mieloides que eren suficients per millorar. l'eficàcia de la immunoteràpia. Pot ser que la immunogenicitat intrínseca de les cèl·lules també tingui un paper en aquests tumors immunològics del fred que es tornen més sensibles a l'ICD després de la inhibició lisosomal. L'efecte similar a la vacuna de la inhibició lisosomal observat en un entorn de laboratori controlat es pot traduir o no a la clínica, però podria explicar per què alguns pacients tractats amb dabrafenib, trametinib i HCQ en melanoma mutant BRAF tractat prèviament tenien un melanoma mutant BRAF tan profund i durador. resposta a aquest règim (32). Es necessiten més estudis per entendre com la inhibició de PPT1 produeix ROS lisosomal i peroxidació lipídica. La regulació dependent de PPT1-de la V-ATPasa i l'acidificació lisosomal no és una explicació suficient perquè la bafilomicina inhibeix l'acidificació lisosomal però no produeix LMP (dades no mostrades). Les implicacions d'aquestes troballes suggereixen que els inhibidors lisosomals que milloren la immunogenicitat intrínseca de la cèl·lula tumoral es poden combinar de manera racional amb teràpies que milloren l'activació de les cèl·lules T o la infiltració al microentorn del tumor, donant possiblement efectes sinèrgics.
Figura 5. La N-acetil cisteïna prevé la mort cel·lular induïda per DC661-. (A)
Mètodes
Cultiu cel·lular. A375P humà (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL{- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), les línies cel·lulars A549 (CRM-CCL-185) i el ratolí B16F10 (CRL-6475) es van comprar a ATCC. Les línies humanes A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 i YUMM1.7 (WT, Gsdme EV i Gsdme KO1 i KO2) de ratolí es van obtenir a casa. Les cèl·lules del ratolí MC38 i CT26 van ser proporcionades per Andy Minn, de la Universitat de Pennsilvània. Les cèl·lules primàries de medul·la òssia FL5.12 i IL-3-dependents de Bax-/-Bak-/- (Bax/Bak DKO) es van obtenir de Kathryn E. Wellen, Universitat de Pennsilvània. La línia cel·lular humana Panc-1 (CRL-1469, ATCC) va ser proporcionada per Ben Z. Stanger, de la Universitat de Pennsilvània. La línia cel·lular YUMMER 1.7 del ratolí es va obtenir de Xiaowei (George) Xu, Universitat de Pennsilvània. Totes les línies cel·lulars van ser provades per Mycoplasma cada dos anys per les instal·lacions del nucli de la Universitat de Pennsilvània i es van autenticar mitjançant empremtes dactilars repetides en tàndem curt pel nucli de Wistar Institute Genomics. Les línies cel·lulars A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 i Bax/Bak DKO es van cultivar a RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Les línies cel·lulars A375, MIA PaCa-2, Panc{-1, B16F10 i MC38 es van cultivar en DMEM (Invitrogen, 11995); i les cèl·lules YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV i Gsdme KO1 i KO2) (15) es van cultivar en DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Els medis de cultiu es van complementar amb sèrum boví fetal al 10% (12306C, MilliporeSigma) i una solució antimicòtica antibiòtica 1 × (Gibco, 15140-122). Les línies cel·lulars FL5.12 i Bax/Bak DKO es van mantenir en un medi RPMI complet complementat amb 50 μM -mercaptoetanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) i 0,35 ng/ml i 3,5 ng /mL IL-3, respectivament. Les línies cel·lulars YUMMER1.7 i YUMM1.7 (WT, Gsdme EV i Gsdme KO) es van mantenir en mitjans complets complementats amb 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Les cèl·lules WM35 i WM793 es van cultivar en medi MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), que contenia un 10% de FBS en 1 × medi Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5% p/v de bicarbonat de sodi ( Corning, 25-035-CI), 1 × solució antimicòtica antibiòtica (Gibco, 15140-122) i 5 ug/ml d'insulina (MilliporeSigma, I0516). Les cèl·lules es van cultivar a 37 graus en presència d'un 5% de CO2. Productes químics i reactius. Els productes químics comprats incloïen HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) i DC661 (Selleckchem, S8808). Es va utilitzar Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) per tenyir les cèl·lules de calci segons les instruccions del fabricant. A la taula suplementària 1 i a la taula suplementària 2 es proporciona una llista d'anticossos i inhibidors.
Figura 6. NAC inverteix LLP d'una manera que depèn de MFSD12-. (AC)
Extracció i digestió de proteïnes per a cromatografia líquida-anàlisi d'espectrometria de masses en tàndem per a proteòmica. Es van cultivar {{0}},7 × 106 cèl·lules de melanoma A375P en plats de cultiu de 6{0 mm. Les cèl·lules es van tractar amb DMSO (control), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) o HCQ (3{{70}} μM) durant 24 hores a aproximadament 5{{ 112}}% de confluència. Els pellets de cèl·lules congelades es van lisar amb 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/mL de pepstatina, i 1 ug/ml de leupeptina. Els lisats clarificats (10 ug cadascun) es van electroforitzar 0,5 cm en un gel de bis-tris seguit de fixació i tinció amb Coomassie col·loïdal. Cada carril de gel de 0,5 cm es va eliminar, es va eliminar, es va reduir amb tris (2-carboxietil) fosfina, es va alquilar amb iodoacetamida i es va digerir amb tripsina tal com es va descriure anteriorment (36). Els digerits (1 ug) es van analitzar mitjançant cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) en un espectròmetre de masses Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) en línia amb un nanoAQUITY UPLC (Waters). La separació analítica es va realitzar en una columna de pèptid BEH C18 d'1,7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) utilitzant un gradient de 245-minuts amb àcid fòrmic al 0,1% en aigua (fase mòbil A) i acetonitril (fase mòbil B) de la següent manera : 5%–30% B durant 225 minuts, 30%–80% B durant 5 minuts, 15-minut de retenció al 80% B i torna a les condicions inicials. Es van adquirir espectres MS complets a una resolució de 70,000, amb un rang d'escaneig de 400–2,000 m/z, un objectiu de control automàtic de guany de 3 × 106 ions i un temps d'injecció màxim de 50 mil·lisegons. Es van adquirir espectres MS2 depenents de dades per als 20 ions més abundants a una resolució de 17.500, amb una amplada d'aïllament d'1, 5 m/z, objectiu de control automàtic de guany de 5 × 104 ions i temps màxim d'injecció de 50 mil·lisegons. La concordança de pèptids es va establir com a preferida i es van rebutjar ions no assignats i carregats individualment (37). Les dades de MS en brut es van analitzar mitjançant MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) amb una base de dades de seqüències humanes Uniprot (accedit el 10 d'octubre de 2019) i una base de dades de contaminants comuns, incloent tripsina, queratines, proteïnes bovines, i micoplasma (38). A la recerca es va utilitzar l'especificitat del pèptid tríptic amb un màxim de 2 clivages perduts, la modificació fixa de la cisteïna (carbamidometilació) i l'oxidació variable de la metionina o l'acetilació N-terminal (39). Es va utilitzar un tall de l'1% de FDR per a pèptids i proteïnes. S'ha habilitat la coincidència entre tirades; les proteïnes es van quantificar mitjançant la quantificació sense etiqueta (40). L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Les proteïnes havien de ser identificades per almenys 3 pèptids únics i tenir 3 valors vàlids (quantitat diferent de zero) dins d'un grup de mostra, i els contaminants i les proteïnes inverses es van filtrar del conjunt de dades. Els valors que falten es van imputar a partir d'una distribució normal. Es van realitzar comparacions per parelles entre condicions a nivell de proteïnes mitjançant una 2-prova t de Student amb cua amb FDR basat en permutació amb aleatoritzacions s{0=0.1 i 250. Els canvis significatius es van definir com a FDR inferior al 5% i un canvi de plec absolut superior a 1,5 o 2,0, tal com s'especifica. Liso-IP. Les cèl·lules A375P es van infectar amb lentivirus pLJC5-Tmem{192-3xHA i es van seleccionar amb 1 mg/ml de puromicina (MilliporeSigma, P4512). Aproximadament 3 × 106 cèl·lules A375P marcades amb HA es van tractar amb NAC 10 mM o amb control de vehicle aquàtic durant 24 hores en condicions de cultiu descrites anteriorment. Després del tractament, les cèl·lules es van rentar en PBS, es van collir en 0, 5 ml de KPBS fred i es van homogeneïtzar suaument amb 20 cops en un homogeneïtzador Dounce de 2 ml. Al voltant del 2,5% de l'homogeneïtat es va reservar per a l'anàlisi de lisat de cèl·lules senceres, i la resta es va centrifugar a 3,000g durant 2 minuts a 4 graus per eliminar les restes de la membrana cel·lular. El sobrenedant d'homogenat es va transferir a un tub net d'1, 5 ml i es va incubar amb 50 μL de perles anti-HA (Pierce, 88836) o perles anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) durant 15 minuts a 4 graus. A continuació, es van precipitar les mostres col·locant tubs a DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) i es van balancejar suaument durant 2 minuts a temperatura ambient. El sobrenedant es va reservar per a l'anàlisi de la fracció no lligada. L'IP es va rentar 3 vegades amb KPBS que contenia 8 mM de CaCl2. El Lyso-IP es va extreure en un 80% de MeOH per a l'anàlisi metabolòmica. Extracció i anàlisi de lípids mitjançant LC-MS/MS per al lipidoma global. Les cèl·lules de melanoma A375P es van sembrar en plats de 60 mm a 0, 7 × 106 cèl·lules per plat. Quan les cèl·lules es trobaven aproximadament al 50% de confluència, es van tractar amb DMSO (control), DC661 (3 μM) o HCQ (30 μM) durant 24 hores. Les cèl·lules es van rentar 2 vegades amb HBSS, es van raspar a metanol gelat i es van transferir a tubs de vidre per a l'extracció de lípids amb cloroform/metanol/0, 88% NaCl (2: 1: 1) que contenia un estàndard de lípids intern EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Les mostres es van vortexar i després es van sonicar al bany maria durant 5 minuts sobre gel. Després de la centrifugació a 500 g durant 15 minuts a 40 graus, la fase inferior es va transferir a un altre tub de vidre. La fase superior es va reextraure mitjançant una fase inferior sintètica. Després de la sonicació i la centrifugació, la fase inferior es va combinar amb la primera recollida de fase inferior. Les mostres es van assecar sota nitrogen, es van tornar a suspendre en un 10% de cloroform/90% de metanol i es van transferir a vials de vidre LTQ. Les mostres de lípids es van analitzar amb un espectròmetre de masses Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X i un sistema Vanquish Horizon UHPLC. La separació analítica va utilitzar una columna Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) amb 50:50 acetonitril/aigua i 88:10:2 isopropanol/acetonitril/aigua, cadascuna amb format d'amoni 5 mM i àcid fòrmic 0,1%. Les dades LC-MS/MS es van adquirir per separat en polaritats positives i negatives amb els paràmetres de l'instrument següents: exploració MS1 120, resolució000; MS2 depenent de les dades dels 20 ions més abundants a 15,{184}} resolució; 0,4 m/z d'amplada d'aïllament; i una energia de col·lisió normalitzada escalonada de 20:30:40 (43).
Figura 7. La N-acetil cisteïna impedeix l'expressió superficial de calreticulina induïda per DC661-. (A–D)
Els lípids es van identificar i quantificar mitjançant LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Les espècies de lípids identificades es van filtrar mitjançant els adductes esperats i el grau d'identificació en funció de la classe. Les àrees màximes es van normalitzar als estàndards EquiSPLASH per a les classes admeses i es van normalitzar encara més en funció de l'àrea total de cada mostra per corregir la variació del nombre de cèl·lules. L'anàlisi estadística es va realitzar amb dades transformades en registre mitjançant Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extracció i anàlisi de metabòlits mitjançant LC-MS/MS per a metabalona. Els metabòlits polars es van extreure de cèl·lules senceres, fraccions no lligades Lyso-IP i mostres lligades a Lyso-IP utilitzant un 80% de metanol i es van emmagatzemar a -8{{30}} grau abans de la cromatografia líquida. –Anàlisi d'espectrometria de masses (LC-MS). Els extractes es van analitzar mitjançant LC-MS mitjançant un espectròmetre de masses Thermo Scientific Q-Exactive HF-X amb una sonda HESI II en línia amb un sistema UHPLC Thermo Vanquish Horizon. La separació LC es va realitzar mitjançant una columna ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, mida de partícula de 5 μm, EMD Millipore) amb una columna de protecció ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) mantinguda a 45 graus amb un cabal. de 0,2 ml/min. La cromatografia es va realitzar en condicions àcides per reduir la reactivitat dels grups tiol. La fase mòbil A era aigua i B era acetonitril, ambdues contenen un 0,1% d'àcid fòrmic. El gradient de LC va ser del 85% de B durant 2 minuts, del 85% de B al 20% de B durant 15 minuts, del 20% de B al 85% de B durant 0,1 minuts i del 85% de B durant 8,9 minuts. El mostreig automàtic es va mantenir a 4 graus i es van injectar 4 μL de cada mostra per anàlisi. Es van utilitzar els paràmetres MS següents: cabal de gas de la funda, 40 UA; cabal de gas auxiliar, 10 UA; cabal de gas d'escombrat, 2 UA; temperatura de l'escalfador de gas auxiliar, 350 graus; tensió de polvorització, 3,75 kV en mode positiu i 3,5 kV en mode negatiu; temperatura capil·lar, 375 graus; i nivell de RF de l'embut, 40%. Totes les mostres es van analitzar mitjançant MS completa amb canvi de polaritat. Es van adquirir exploracions MS completes de 65 a 975 m/z a una resolució de 120,000 amb un objectiu de control automàtic de guany d'1 × 106 ions i un temps màxim d'injecció de 100 mil·lisegons. Les dades en brut es van analitzar mitjançant TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Els metabòlits dirigits es van identificar mitjançant la massa precisa i el temps de retenció en la seva polaritat preferida basant-se en estàndards analítics. La detecció de pics va utilitzar l'algorisme ICIS amb un suavització d'1. La quantificació relativa es va realitzar mitjançant una àrea de pic integrada, i aquests valors es van corregir a la quantitat total per mostra (definida com l'àrea de pic total). Edició PPT1-CRISPR/Cas9. Les cèl·lules A375P PPT1-no objectiu i KO es van preparar tal com es va descriure anteriorment (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) va ser un regal de Feng Zhang (plasmidi Addgene, 48139). Els oligos d'ARN guia (IDT) van ser recuits, fosforilats i després lligats al plasmidi pX459 digerit i desfosforilat amb BbsI seguint els protocols de laboratori de Zhang, disponibles a través d'Adgene. Els plasmidis lligats es van transformar en cèl·lules Stbl3 (Invitrogen). La seqüenciació de preparacions plasmídiques va confirmar la presència de les seqüències d'ARN guia desitjades. Les cèl·lules A375P es van transfectar mitjançant Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), seguida de la selecció de puromicina. Els assajos de Surveyor van confirmar l'edició del gen PPT1 per CRISPR/Cas9, i la derrota de PPT1 es va confirmar mitjançant Western blotting amb anticossos PPT1 (Origene). Les seqüències per als oligos d'ARN guia són les següents: ARN guia no objectiu cap endavant (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ARN guia no objectiu invers (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ARN guia PPT1 humà 1 cap endavant (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), ARN guia PPT1 humà 1 inversa), guia PPT1 humà 1 inversa (AAAGGGPTAGCAGGRNA) endavant (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) i l'ARN guia PPT1 humà 3 invers (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Els clons cultivats a partir de cèl·lules individuals utilitzats en aquest article inclouen els següents: el clon C8 és la guia humana 1 i el clon B5 és la guia humana 3. Immunoblotting. Es van xapar un milió de cèl·lules en un plat de 10 cm i es van fer tractaments l'endemà; les cèl·lules es van recollir per raspat. Els lisats de cèl·lules senceres es van preparar mitjançant tampó de lisi SDS. La concentració de proteïnes es va mesurar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Es va utilitzar una proteïna de 30 a 50 ug per a SDS-PAGE i es va transferir a una membrana de PVDF (Bio-Rad, 1620177). La membrana es va bloquejar amb 5% de BSA o 5% de llet desnatada, segons les condicions optimitzades, i es va incubar amb anticossos primaris durant la nit a 4 graus. Les membranes de PVDF es van rentar amb 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) i es van incubar durant 1 hora a temperatura ambient amb un anticòs secundari conjugat amb HRP específic de l'espècie. Les membranes es van rentar i desenvolupar posteriorment amb el substrat Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) i pel·lícules d'autorradiografia (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Per als estudis de piroptosi, els lisats de proteïnes es van separar mitjançant SDS-PAGE i es van transferir a membranes de PVDF. Després de bloquejar-se en un 5% de BSA, les membranes de PVDF es van incubar amb els anticossos primaris indicats durant la nit a 4 graus, es van rentar en PBS/Tween i es van incubar amb anticossos secundaris acoblats a peroxidasa. La immunoreactivitat es va detectar mitjançant anticossos secundaris conjugats amb HRP (CalBioTech), un substrat de quimioluminescència (Thermo Fisher Scientific) i un sistema d'imatge ChemicDoc MP (Bio-Rad). Per als experiments amb sobrenedant, es van cultivar cèl·lules en un medi lliure de FBS per evitar la distorsió de SDS-PAGE. Els sobrenedants cel·lulars es van recollir i es van centrifugar durant 10 minuts a 500 g a 4 graus per eliminar les restes cel·lulars. Els sobrenedants resultants es van concentrar 10 × amb Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) per centrifugació durant 30 minuts a 4.500 g a 4 graus. Els concentrats es van barrejar amb tampó de mostra i es van analitzar mitjançant Western blotting tal com es descriu anteriorment. La tinció de gel de proteïnes es va realitzar mitjançant la tinció vermella de Ponceau. Assaig d'activitat de LMP i catepsina L. El plasmidi pEGFP-hGal3 humà va ser un regal de Tamotsu Yoshimori (plasmidi Addgene, 73080) i es va utilitzar per crear la línia A375P-Galectin-3. Es va comprar la columna vertebral del vector plasmidi de control pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Els plasmidis es van transfectar (1 ug/mL) a cèl·lules A375P mitjançant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) segons el protocol del fabricant; les cèl·lules transfectades es van seleccionar de manera estable mitjançant G418 (Gibco, 10131035). Per a LMP, es van comptar un total de 25 cel·les A375P-galectina-3 puntua-positives en diversos camps d'imatge. El percentatge de cel·les puntuals positives es va calcular a cada camp per separat i es va calcular un percentatge mitjà per a cada grup. El kit d'assaig Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) es va utilitzar segons el protocol del fabricant. Les cèl·lules es van fotografiar amb un microscopi invertit Zeiss Axio Observer 7. La intensitat integrada en brut Magic Red es va calcular mitjançant el programari Fiji - ImageJ (NIH). Assaig de viabilitat cel·lular MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol{-2-il]{-2, 5-difenil tetrazoli bromur). Es van xapar 2.000 cèl·lules per triplicat a cada pou d'una placa de 96-pou, i es van realitzar assajos de 3-dia MTT mitjançant el kit de viabilitat de cèl·lules (Roche, 11465007001) segons el protocol del fabricant. El pretractament d'inhibidors es va donar durant 1 hora, seguit d'un cotractament de les cèl·lules amb inhibidors amb o sense DC661. Es va utilitzar el mètode de regressió no lineal (ajust de corba) per calcular l'IC50.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Assaig de formació de colònies. 2,000 cèl·lules per pou es van sembrar en una placa de 6-pou i es van tractar l'endemà; les cèl·lules es van mantenir sota el tractament durant un total de 8 dies. Les colònies formades a cada pou es van rentar amb PBS, es van fixar amb metanol fred a -20 graus durant 20 minuts i es van tenyir amb una solució aquosa Crystal violet al 0,5% (V5265; MilliporeSigma).
Assaig d'exclusió del colorant blau tripà. La barreja de reacció per a l'assaig de blau tripà es va preparar barrejant 1 part de 0,4% blau tripà (25- 900-CI, Corning) i 1 part de mostres de cèl·lules diluïdes. La barreja es va incubar durant 1 minut i les cèl·lules es van comptar amb Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Figura 8. L'expressió de superfície de calreticulina induïda per DC661-primeix les cèl·lules T contra les cèl·lules tumorals. (A)
Figura 9. La inoculació de cèl·lules tractades amb DC661- produeix rebuig del tumor en contextos específics. (A)
ESPUMA-LPO. LLP es va estudiar mitjançant una sonda fluorescent, FOAMLPO. FOAM-LPO es va sintetitzar tal com es va descriure anteriorment (26). Les cèl·lules es van cultivar en un diapositiva de 8 pous (ibid, 80807) i es van tractar amb inhibidors i amb o sense DC661. Les cèl·lules es van incubar amb medis que contenien FOAM-LPO (1 M) en una atmosfera de 5% CO2 i 95% d'aire durant 5 minuts a 37 graus. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb mitjans i després es van observar cèl·lules al microscopi (microscopi invertit Zeiss Axio Observer 7) per detectar el canvi de fluorescència de 586 a 512 nm en resposta a LLP. qRT-PCR i primers. Les cèl·lules A375P (3 × 105) es van cultivar en plats de 60 mm i es van tractar amb DMSO o DC661 (3 μM) durant 24 hores. L'ARN total es va aïllar amb un kit d'aïllament d'ARN (QIAGEN, 74134) segons el protocol del fabricant. L'ADNc es va sintetitzar mitjançant un kit de transcriptasa inversa iScript amb 500 ng d'ARN purificat segons el protocol del fabricant (Thermo Scientific, K1642). La reacció qPCR es va configurar mitjançant SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) que contenia 1 μL d'ADNc. Totes les mesures es van realitzar per triplicat i es va utilitzar BACTIN com a estàndard intern per als càlculs de ΔCT. L'anàlisi de l'expressió gènica es va fer utilitzant els primers següents: PTGS2/COX-2 endavant (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 invers (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS endavant (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS inversa (GACCAGTGATGTCAACAG) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 inversa (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN cap endavant (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) i BACTIN inversa (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
transfecció de siRNA. Es van realitzar estudis de derrocament genètic per a ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 i MFSD12 humans en línies cel·lulars A375P. Es van realitzar estudis d'inhibició genètica per a Ppt1 i Calreticulina del ratolí en cèl·lules MC38. siRNA no objectiu (sc{{10}}), ULK1 humà (sc{-44182), ATG7 (sc{-41447), TAX1BP1/T6BP (sc{-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc{-97888), ratolí Ppt1/Cln1 (sc{-142398) i Calreticulina Els siRNAs /Calregulin (sc-29895) es van comprar a Santa Cruz Biotechnology. Aquests siRNAs consisteixen en grups de 3-5 siRNAs específics per a la diana. Citometria de flux. La inducció de ferroptosi es va mesurar mitjançant C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Les cèl·lules A375P es van sembrar en una 6-placa de pous i es van tractar amb DMSO, ferrostatina{{40}} (10 μM), roxstatina de llavi-1 (2 μM), elastina (5 μM). ), DC661 (3 μM) o una combinació durant 24 hores. Les cèl·lules es van recollir centrifugant a 300 g durant 5 minuts. Les cèl·lules es van tornar a suspendre en 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) que contenien 1 μM de C{11-BODIPY i es van incubar a 37 graus durant 15 minuts. Les cèl·lules es van granular i es van tornar a suspendre en 500 μL 1X HBSS i es va mesurar la intensitat de la fluorescència en un citòmetre BD LSRII mitjançant 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). La quantificació de l'expressió de la superfície cel·lular de la calreticulina per a la mort cel·lular immunogènica es va realitzar tal com es va descriure anteriorment (45) mitjançant citometria de flux. Les cèl·lules B16F10 o MC38 es van cultivar i es van tractar amb NAC (10 mM) o DC661 (3 μM) durant 24 hores. Les cèl·lules MC38 es van tractar amb siPpt1 o siNT durant 48 hores en presència o absència de NAC 10 mM durant 24 hores. Les cèl·lules es van tacar amb anticossos CALR (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 de cabra anti-conill segon anticòs (Invitrogen) i iodur de propidi (PI) (Biolegend, 421301). Les mostres tacades es van adquirir en un citòmetre de flux BD LSRII mitjançant 710/50 Blau i 670/30 Vermell per capturar la fluorescència PI i CALR, respectivament (instal·lació Flow Core de la Universitat de Pennsylvania), i l'anàlisi es va limitar a les cèl·lules positives i negatives de CALR. per evitar esdeveniments falsos positius. Priming de cèl·lules T i percentatge de citotoxicitat. Les cèl·lules tumorals B16 o MC38 (5 × 104) es van cultivar i es van tractar amb NAC (10 mM) o DC661 (1 μM o 3 μM), respectivament, durant 24 hores. Per a la inhibició genètica de Calr, les cèl·lules MC38 es van tractar amb siRNA de Calr o siRNA no objectiu (siNT) durant 48 hores, seguit d'un tractament amb DMSO o 3 μM DC661 durant 24 hores. A continuació, es van cultivar esplenòcits amb DC661 amb o sense cèl·lules B16 o MC38 en presència d'IL-2 (5 UI/mL) i es van cocultivar durant 72 hores. L'encebament es va confirmar per IFN-ELISA (Biolegend, 430815) del sobrenedant. A continuació, els esplenòcits primers es van cocultivar amb cèl·lules B16 o MC38 acabades de cultivar amb proporcions objectiu a efector (B16 o MC38 a esplenòcits) d'1:20 i 1:50 per a cèl·lules B16 i MC38, respectivament. L'alliberament de LDH associada a la mort de cèl·lules B16 o MC38 i després el percentatge de citotoxicitat es va mesurar segons el protocol del fabricant (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Assajos de vacunació antitumoral i estudis de quimioteràpia amb models de càncer establerts. Es van obtenir ratolins WT C57BL/6 femelles de sis a vuit setmanes, NOD/SCID i BALB/c del Laboratori Jackson. Per als experiments de vacunació antitumoral, les cèl·lules WT B16F10, MC38 i CT26 es van tractar amb DC661 (3 μM) durant 36 hores en matràs de 175 cm2. A continuació, es van recollir sobrenedants i cèl·lules separades en un tub falcó de 50 ml. Les cèl·lules es van centrifugar i es van rentar amb PBS fred amb gel. Per a la vacunació, es van injectar 150 μL de suspensió cel·lular sc al flanc esquerre de ratolins C57BL/6 immunocompetents, ratolins NOD/SCID immunodeficients (1, 8 × 104 cèl·lules B16F10, 1, 5 × 106 cèl·lules MC38 per ratolí) o singènics BAL3B/. × 106 cèl·lules CT26 per ratolí). Les cèl·lules congelades i descongelades resuspeses en PBS es van injectar com a control negatiu. Una setmana més tard, es van injectar cèl·lules canceroses vives del mateix tipus (3 × 104 cèl·lules B16F10, 2 × 105 cèl·lules MC38 o 5 × 105 cèl·lules CT26 per ratolí) amb un volum igual de Matrigel (Corning, 354248) al flanc dret. de ratolins vacunats. Els tumors es van mesurar amb pinces electròniques i el volum es va calcular com a L × W2 × 0,5. El creixement del tumor es va controlar regularment durant els dies següents, i l'absència de tumors es va considerar com una indicació d'una vacunació antitumoral eficient. Els estudis de vacunació DC661-MC38 es van repetir en ratolins NOD/SCID. Estadístiques. La significació estadística es va determinar utilitzant la prova t de 2-cua no aparellada de Student en comparar 2 grups. La prova ANOVA 1-manera es va utilitzar quan es van comparar més de 2 grups. Una hipòtesi nul·la es va rebutjar significativament si el valor P era inferior a 0,05. Les dades es mostren com a mitjana ± SEM. Aprovació de l'estudi. Tots els experiments amb animals es van realitzar d'acord amb els protocols aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Pennsilvània.
Planta de cistanche herba xinesa-Antitumor
Referències
1. Zeh HJ, et al. Un estudi preoperatori aleatoritzat de fase II de la inhibició de l'autofàgia amb dosis altes d'hidroxicloroquina i gemcitabina / Nab-paclitaxel en pacients amb càncer de pàncrees. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW, et al. PPT1 promou el creixement del tumor i és l'objectiu molecular dels derivats de la cloroquina en càncer. Càncer Discov. 2019;9(2):220–229.
3. Brun S, et al. GNS561, un nou inhibidor de l'autofàgia actiu contra les cèl·lules mare del càncer en el carcinoma hepatocel·lular i la metàstasi hepàtica del càncer colorectal. J Càncer. 2021;12(18):5432–5438.
4. Brun S, et al. GNS561, un inhibidor de PPT1 en fase clínica, és eficient contra el carcinoma hepatocel·lular mitjançant la modulació de les funcions lisosòmiques. Autofàgia. 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C, et al. La permeabilització de la membrana lisosomal i l'alliberament de catepsina és un esdeveniment amplificador de l'apoptosi depenent de Bax/ Bak en fibroblasts i monòcits. La mort cel·lular difereix. 2010;17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Permeabilització de la membrana lisosomal en la mort cel·lular. Oncogen. 2008;27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW, et al. Un enfocament unificat per orientar els rols de senyalització de degradació i creixement del lisosoma. Càncer Discov. 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R, et al. Ferroptosi, necroptosi i piroptosi en la immunitat contra el càncer. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.
9. Yamamoto K, et al. L'autofàgia afavoreix l'evasió immune del càncer de pàncrees degradant l'MHCI. Naturalesa. 2020;581(7806):100–105.
10. Deng J, et al. La inhibició d'ULK1 supera la presentació d'antigen compromesa i restaura la immunitat antitumoral en el càncer de pulmó mutant LKB1. Nat Càncer. 2021;2(5):503–514.
11. Lazarou M, et al. La ubiquitina cinasa PINK1 recluta receptors d'autofàgia per induir la mitofagia. Naturalesa. 2015;524(7565):309–314.
12. Choi YB, et al. TAX1BP1 frena l'apoptosi induïda pel virus facilitant la degradació mediada per picor de l'adaptador mitocondrial MAVS. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, et al. Bnip3 perjudica la bioenergètica mitocondrial i estimula el recanvi mitocondrial. La mort cel·lular difereix. 2011;18(4):721–731.
14. Leu JI, et al. Bases mecàniques per a la ferroptosi deteriorada en cèl·lules que expressen la variant S47 de p53 centrada en l'Àfrica. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. Els inhibidors mutants de BRAF i MEK regulen el microambient immune del tumor mitjançant piroptosi. Càncer Discov. 2020;10(2):254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilització de la membrana lisosomal en la mort cel·lular: noves evidències i implicacions per a la salut i la malaltia. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.
17. Thirusangu P, et al. L'autofàgia induïda per quinacrina en el càncer d'ovari desencadena la permeabilització de la membrana lisosomal/mitocondrial mediada per catepsina L i la mort cel·lular. Càncers (Basilea). 2021;13(9):2004.
18. Michallet MC, et al. Apoptosi dependent de la catepsina desencadenada per l'activació supraòptima dels limfòcits T: un possible mecanisme de tolerància a dosis altes. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.
19. Mondal A, et al. La deficiència de Ppt1-desregula l'homeòstasi de Ca++ lisosomal contribuint a la patogènesi en un model de ratolí de malaltia CLN1. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Les fosfolipases i les espècies reactives d'oxigen van derivar biomarcadors de lípids en humans i animals sans i malalts: un enfocament en la lisofosfatidilcolina. Physiol frontal. 2021;12:732319.
21. Fu R, et al. Eficàcia de la N-acetilcisteïna en la supressió fenotípica de models de ratolí de la malaltia de Niemann-Pick, tipus C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.
22. Boz Z, et al. La N-acetilcisteïna prevé l'estrès oxidatiu induït per l'olanzapina a les neurones hipotalàmiques mHypoA-59. Ciència Rep. 2020;10(1):19185.
23. Khare S, et al. ASS1 i ASL suprimeixen el creixement del carcinoma de cèl·lules renals de cèl·lules clares mitjançant un metabolisme alterat del nitrogen. Càncer Metab. 2021;9(1):40.
24. Gęgotek A, et al. Comparació de l'efecte protector de l'àcid ascòrbic sobre les interaccions dels sistemes redox i endocannabinoides en fibroblasts de pell humana cultivats in vitro exposats a radiació UV i peròxid d'hidrogen. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.
25. De Raedt T, et al. Aprofitant les vulnerabilitats de les cèl·lules canceroses per desenvolupar una teràpia combinada per als tumors impulsats per ras. Cèl·lula Càncer. 2011;20(3):400–413.
26. Zhang X, et al. Monitorització de la peroxidació lipídica dins de les cèl·lules d'escuma mitjançant una sonda raciomètrica i orientable a lisosomes. Química Anal. 2015;87(16):8292–8300.
27. Wei CY, et al. L'anàlisi basada en bioinformàtica revela un MFSD12 elevat com a promotor clau de la proliferació cel·lular i un potencial objectiu terapèutic en el melanoma. Oncogen. 2019;38(11):1876–1891.
28. Aldini G, et al. N-acetilcisteïna com a agent de trencament de disulfurs i antioxidants: els motius. Radic lliure Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. La metabolòmica lisosomal revela la regulació depenent de la V-ATPasa i mTOR de l'eflux d'aminoàcids dels lisosomes. Ciència. 2017;358(6364):807–813.
30. Zhou J, et al. Mort de cèl·lules immunogèniques en la teràpia del càncer: inductors actuals i emergents. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. La inhibició de PPT1 millora l'activitat antitumoral de l'anticossos anti-PD-1 en el melanoma. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (autofàgia de BRAF i inhibició de MEK en el melanoma): un assaig de fase I/II de dabrafenib, trametinib i hidroxicloroquina en melanoma mutant BRAFV600-avançat. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Les proteïnes de macroautofàgia controlen els nivells de MHC de classe I a les cèl·lules dendrítiques i donen forma a les respostes antivirals de les cèl·lules T CD8(+). Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P, et al. La mobilització de la cisteïna lisosomal dóna forma a la resposta de TORC1 i al creixement del teixit al dejuni. Ciència. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. N-acetilcisteïna: una revisió de la utilitat clínica (un fàrmac antic amb trucs nous). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.
36. Beer LA, et al. Descobriment sistemàtic de biomarcadors sèrics d'embaràs ectòpic mitjançant el perfil de proteïnes 3-D juntament amb una quantificació sense etiquetes. J Proteoma Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. L'efecte principal sobre el proteoma del carcinoma de cèl·lules clares d'ovari mutat amb ARID1A és la baixada de la via del mevalonat a nivell post-transcripcional. Proteòmica de cèl·lules Mol. 2016;15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant permet altes taxes d'identificació de pèptids, precisions individualitzades de la massa del rang de ppb i quantificació de proteïnes a tot el proteoma. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.
39. Cox J, et al. Andròmeda: un cercador de pèptids integrat a l'entorn MaxQuant. J Proteoma Res. 2011;10(4):1794–1805.
40. Cox J, et al. Quantificació precisa sense etiquetes a tot el proteoma mitjançant una normalització retardada i una extracció màxima de proporció de pèptids, anomenada MaxLFQ. Proteòmica de cèl·lules Mol. 2014;13(9):2513–2526.
41. Tyanova S, et al. La plataforma computacional Perseus per a l'anàlisi integral de dades de (prote)òmica. Mètodes Nat. 2016;13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: una plataforma bioinformàtica per a l'anàlisi integrativa de dades de proteòmica en la investigació del càncer. Mètodes Mol Biol. 2018;1711:133–148.
43. Alicea GM, et al. Els canvis en el metabolisme dels lípids dels fibroblasts envellits indueixen la resistència de les cèl·lules del melanoma depenent de l'edat a la teràpia dirigida mitjançant el transportador d'àcids grassos FATP2. Càncer Discov. 2020;10(9):1282–1295.
44. Ran FA, et al. Enginyeria del genoma mitjançant el sistema CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.
45. Liu P, et al. Quantificació de l'exposició a la calreticulina associada a la mort de cèl·lules immunogèniques. Mètodes Enzimol. 2020;632:1–13.
