Mecanismes i objectius de la immunitat mediada pel receptor Fc als esporozoïts de la malària

Una vacuna altament protectora facilitarà enormement la consecució i el manteniment de l'eliminació de la malària. Comprendre els mecanismes de la immunitat mediada per anticossos és crucial per desenvolupar vacunes amb alta eficàcia. Aquí, identifiquem els papers clau en la immunitat humoral per a les interaccions del receptor Fc (Fc R) i la fagocitosi opsònica dels esporozoïts.

Identifiquem un paper significatiu dels neutròfils en la mediació de l'eliminació fagocítica dels esporozoïts a la sang perifèrica, mentre que els monòcits aporten un paper menor. Els anticossos també promouen l'activitat de les cèl·lules assassines naturals. Mecànicament, les interaccions d'anticossos amb Fc RIII semblen essencials, amb Fc RIIa també necessari per a la màxima activitat. Totes les regions de la proteïna circumsporozoite són objectius d'anticossos funcionals contra esporozoïts, i els anticossos N-terminals tenen més activitat en alguns assajos. Els anticossos funcionals s'adquireixen lentament després de l'exposició natural a la malària, present entre alguns adults exposats, però poc freqüent entre els nens. Les nostres troballes revelen objectius i mecanismes d'immunitat que es podrien explotar en el disseny de vacunes per maximitzar l'eficàcia.

La malària continua sent un problema de salut global important, ja que la malària per P. falciparum causa aproximadament 219 milions de casos clínics i 435000 morts anualment1. Malgrat els esforços de control internacional, la càrrega de la malària s'ha mantingut constant en els últims anys1. Hi ha una gran necessitat d'una vacuna altament eficaç per al control i l'eliminació de la malària, que es subratlla encara més amb l'augment dels informes de resistència als fàrmacs antipalúdics i resistència als insecticides1. L'Organització Mundial de la Salut i els socis finançadors es van fixar com a objectiu desenvolupar una vacuna amb una eficàcia superior o igual al 75 per cent per al 20302, cosa que ha demostrat ser un repte d'aconseguir3,4. Es necessita una major comprensió dels mecanismes que medien la immunitat per desenvolupar estratègies que generin respostes immunitàries protectores més potents.

Millorar la immunitat en la vida diària ens requereix mantenir uns bons hàbits de vida. Establir i mantenir un horari per anar a dormir i despertar pot afavorir el funcionament normal del ritme circadià. Eviteu els àpats festius rics en calories i eviteu menjar aliments àcids o picants que poden dificultar la digestió. Opta per un sopar lleuger amb productes frescos. Limitar l'ús d'aparells electrònics. La llum de la pantalla ens pot enganyar per despertar-nos diverses vegades a la nit alterant els cicles del son i la qualitat del son. Eviteu l'exercici intens a primera hora del vespre. Es recomana un mínim de dues hores. L'exercici estimula l'alliberament d'adrenalina i augmenta la freqüència cardíaca, la qual cosa activa el nostre son. A més, també podem ingerir Cistanche deserticola. Els polisacàrids i el verbascòsid de Cistanche deserticola poden millorar la immunitat. Els polisacàrids i el verbascòsid de Cistanche deserticola poden augmentar l'activitat enzimàtica del cor i el teixit cerebral, i millorar la funció fagocítica de les cèl·lules peritoneals i la resposta de proliferació dels limfòcits.

Fes clic quan vols prendre cistanche

La infecció per malària comença a partir d'una picada de mosquit Anopheles infectada, durant la qual els esporozoïts s'inoculen a la dermis5. Aleshores, els esporozoïts migren cap a un vas sanguini, circulen pel torrent sanguini fins al fetge i estableixen infecció als hepatòcits. Els esporozoïts representen un objectiu prioritari de les vacunes contra la malària perquè eliminar els esporozoïts aturarà la infecció abans de l'aparició de la malària clínica3. La investigació en models animals i assajos de vacunes ha establert que els anticossos són el mediador clau de la immunitat als esporozoïts (revisat a la ref. 3). Tanmateix, no s'entén bé com funcionen els anticossos de manera mecànica per netejar els esporozoïts i prevenir la infecció, i els objectius específics dels anticossos funcionals. Es necessiten noves idees sobre aquestes preguntes per facilitar el desenvolupament de vacunes més eficaços.

La proteïna circumsporozoite (CSP) és la proteïna més abundant a la superfície dels esporozoïts6 i un objectiu principal dels anticossos humans6. Les vacunes basades en CSP han superat els altres antígens de la vacuna fins ara, tot i que l'eficàcia segueix sent subòptima3. La vacuna contra la malària més avançada, RTS, S, es basa en una forma truncada de CSP (que només conté la regió de repetició central i la regió C-terminal) i va aconseguir una eficàcia modesta contra la malària clínica (29-36%) en l'assaig clínic de fase III7. La regió de repetició central de CSP es considera un objectiu d'anticossos important i, en conseqüència, la importància potencial dels anticossos per a les regions no repetides ha estat molt poc estudiada8, però pot ser important. Els anticossos de la regió C-terminal es van associar amb la protecció en els assaigs de vacunes RTS i S en nens9.

Pel que fa als mecanismes funcionals d'anticossos, la majoria dels estudis publicats s'han centrat en l'activitat inhibidora directa dels anticossos a la regió central repetida de CSP, que pot inhibir la motilitat dels esporozoïts i la invasió d'hepatòcits in vitro10–17. Se sap poc sobre altres mecanismes i objectius potencialment importants de la immunitat.

Un mecanisme immunològic clau que es reconeix cada cop més en la immunitat contra patògens virals i bacterians18–21 és la capacitat dels anticossos d'interaccionar amb els receptors Fc (Fc R) en diversos tipus de cèl·lules que condueixen a la fagocitosi opsònica o la citotoxicitat directa. Els anticossos contra els antígens d'esporozoïts solen estar dominats per les subclasses IgG1 i IgG313, que tenen un fort potencial per interaccionar amb Fc Rs22. Tanmateix, actualment es coneix poc sobre aquests mecanismes potencials en la immunitat als esporozoïts. Els principals tipus de cèl·lules fagocítiques inclouen monòcits i neutròfils (2-10% i 45-70% dels glòbuls blancs perifèrics, respectivament).

A més de la fagocitosi, els neutròfils i les cèl·lules assassines naturals (NK) també poden matar cèl·lules mitjançant la citotoxicitat cel·lular dependent d'anticossos (ADCC)23,24, i tant els monòcits com els neutròfils també tenen impactes immunitaris més amplis mitjançant l'expressió de marcadors d'activació, citocines, i quimiocines (revisats a les refs. 25-27).

Els patrons d'expressió de Fc R difereixen entre monòcits i neutròfils, cosa que afecta les seves funcions en la immunitat. Com que els esporozoïts representen el primer pas per iniciar la infecció per malària, els esporozoïts solen trobar-se amb cèl·lules fagocítiques potencials en un estat de repòs o homeostàstic en lloc d'un estat activat.

Els monòcits en fase de repòs expressen predominantment Fc RI i Fc RIIa, amb un petit subconjunt que expressa Fc RIIIa28, mentre que els neutròfils en repòs expressen Fc RIIa i Fc RIIIb29, i nivells baixos de Fc RIIIa30 (que és important funcionalment). Per tant, avaluar les interaccions específiques entre anticossos i diferents Fc Rs és important per entendre els papers potencials dels diferents fagòcits en la immunitat. La subclasse d'IgG, la glicosilació i l'especificitat de l'epítop poden afectar les interaccions amb diferents Fc Rs22.

La definició de mecanismes mediats per Fc R dirigits als esporozoïts pot revelar idees que es podrien aprofitar per millorar l'eficàcia protectora de les vacunes basades en esporozoïts. En aquest estudi, revelem mecanismes i objectius importants de la immunitat contra els esporozoïts mediats per Fc Rs específics a les cèl·lules immunitàries. Desenvolupem tècniques per mesurar les interaccions entre anticossos i Fc Rs específics i identificar propietats d'anticossos específiques, dianes antigèniques i Fc Rs importants per a una activitat funcional òptima. A més, quantifiquem l'adquisició de respostes funcionals d'anticossos dependents de Fc R en nens i adults exposats de manera natural a la malària. Les nostres troballes revelen mecanismes immunitaris importants contra els esporozoïts i suggereixen estratègies i objectius antigènics per desenvolupar una vacuna contra la malària altament eficaç.

Resultats

La fagocitosi opsònica dels esporozoïts està mediada principalment per neutròfils a la sang perifèrica.

Per investigar la rellevància dels mecanismes mediats per Fc R contra els esporozoïts, primer vam establir assajos de fagocitosi opsònica mitjançant la línia cel·lular THP-1 indiferenciada (cèl·lules pro-monocítiques), en condicions estàndard31,32 (figura suplementària 1A). Per opsonitzar els esporozoïts, hem utilitzat anticossos sèrics d'adults kenyans residents en una regió amb alta intensitat de transmissió de la malària i tenen una immunitat clínica significativa contra la malària i anticossos contra CSP33. Els esporozoïts de P. falciparum opsonitzats van ser fagocitats eficaçment per cèl·lules THP -1 de manera dependent de la concentració amb poca fagocitosi utilitzant anticossos de donants ingenus de la malària (residents de Melbourne) (figura suplementària 1B). La fagocitosi opsònica mediada per sèrums individuals era altament reproduïble (r=0.925, P <0.001; Fig. 1C suplementària).

Per superar els reptes de generar un gran nombre d'esporozoïts viables per a assajos de fagocitosi opsònica, vam establir l'ús de perles fluorescents recobertes amb CSP de longitud completa, l'antigen principal expressat en esporozoïts, com a mesura substitutiva de la fagocitosi opsònica dels esporozoïts. Les perles recobertes de CSP opsonitzades amb una selecció de mostres d'anticossos de diferents adults kenyans van ser fagocitades eficaçment per cèl·lules THP-1, i la fagocitosi opsònica de les perles recobertes de CSP es va correlacionar fortament amb la fagocitosi opsònica dels esporozoïts de P. falciparum (r {{4}). }}.831, P=0.0015, figura suplementària 1D). Per tant, les perles CSP van proporcionar una plataforma eficient per estudiar mecanismes i objectius de la fagocitosi opsònica mediada per anticossos.

Posteriorment, vam investigar els tipus de cèl·lules que medien la fagocitosi opsònica en un assaig de leucòcits sencers amb sang fresca, inicialment utilitzant perles de CSP opsonitzades amb anticossos de conill policlonal contra CSP. Curiosament, la taxa de fagocitosi (nombre de perles fagocitades per cèl·lula) era molt més alta pels neutròfils que pels monòcits (Fig. 1A, B). Com que hem quantificat la taxa de fagocitosi, la major activitat dels neutròfils no s'explica simplement per la seva major abundància en comparació amb els monòcits. La fagocitosi opsònica va augmentar amb l'augment de les concentracions d'anticossos i es va observar una activitat relativa més alta dels neutròfils en comparació amb els monòcits a través de les concentracions d'anticossos i un rang de proporcions de perles: cèl·lules. La major activitat de fagocitosi dels neutròfils es va confirmar mitjançant esporozoïts vius acabats d'aïllar (hem utilitzat esporozoits transgènics de P. berghei que expressen P. falciparum CSP, que substitueix el gen CSP endògen de P. berghei12, conegut com PfCSP-P. berghei). La fagocitosi opsònica d'esporozoïts opsonitzats amb anticossos de donants exposats a la malària kenyana va ser predominantment mediada per neutròfils amb només nivells baixos de fagocitosi per monòcits i neutròfils que mostraven una taxa de fagocitosi més alta (Fig. 1C). També vam realitzar assajos per permetre un temps prolongat per a la fagocitosi (fins a 60 min), però encara vam observar una fagocitosi molt més gran pels neutròfils en comparació amb els monòcits (figura suplementària 2A).

Una anàlisi addicional de la població de monòcits va indicar que la majoria de la fagocitosi era del subconjunt clàssic (CD14high CD16−; Fig. 1D i Fig. 2B–D suplementària). Per donar suport a les nostres troballes, vam demostrar a més que els neutròfils purificats podrien fagocitar eficaçment els esporozoïts de P. falciparum opsonitzats amb anticossos (Fig. 1E). L'esgotament d'anticossos específics de CSP, per pre-incubació amb CSP recombinant, va reduir la fagocitosi dels esporozoïts en un 70 per cent en comparació amb la mostra no esgotada (Fig. 1F i Fig. 3 suplementària). Hem utilitzat un enfocament addicional per obtenir proves de la importància de la CSP com a objectiu dels anticossos funcionals adquirits en la immunitat humana mitjançant la prova d'un mAb (MGG4) aïllat d'un individu exposat a infeccions repetides d'esporozoits34. El mAb va induir una fagocitosi substancial dels esporozoïts, mentre que hi havia poca fagocitosi amb anticossos humans no immunes, o utilitzant un MAb anti-CSP (2A10) que va ser mutat a la regió Fc per inhibir les interaccions Fc R (Fig. 1G).

Definició dels receptors Fc implicats en la fagocitosi opsònica dels esporozoïts.

Vam opsonitzar tots els esporozoïts de P. falciparum i les perles CSP amb anticossos d'adults kenyans i vam mesurar la fagocitosi opsònica per neutròfils en presència d'anticossos específics de bloqueig de Fc R. Els neutròfils tenien una fagocitosi opsònica significativament menor tant de les perles CSP com dels esporozoïts de P. falciparum en presència de bloquejadors de Fc RIIa o Fc RIII (Fig. 2A, B i Fig. 4A suplementària), cosa que suggereix que ambdós receptors eren importants.

En particular, el bloqueig de Fc RIII va ser el més eficaç per inhibir la fagocitosi dels esporozoïts de P. falciparum o les perles de CSP, amb un efecte més feble del bloqueig de Fc RIIa. La fagocitosi opsònica per neutròfils no es va veure afectada pel bloqueig de Fc RI. La valoració de la concentració d'anticossos de bloqueig va suggerir que havíem aconseguit l'efecte màxim per al bloqueig de cada Fc R (figura suplementària 4B).

Per tant, vam combinar anticossos de bloqueig de Fc RIIa i Fc RIII i vam trobar que això donava una major inhibició de la fagocitosi que l'ús de qualsevol dels anticossos bloquejadors, cosa que suggereix encara més la importància dels dos tipus de Fc R per a una fagocitosi òptima (Fig. 2B). Aquests resultats són coherents amb l'expressió de Fc Rs en neutròfils en repòs, que expressen predominantment Fc RIIa i Fc RIIIa/b, però no tenen Fc RI35 (figura suplementària 2C). La importància de Fc RIII en la mediació de la fagocitosi opsònica de les perles CSP i els esporozoïts pot explicar en part l'activitat relativament baixa dels monòcits, ja que els principals subconjunts de monòcits expressen poc Fc RIIIa a la superfície en estat no activat i no expressen Fc RIIIb35. Les cèl·lules THP-1 s'utilitzen àmpliament com a model de fagocitosi de monòcits i expressen molt Fc RI36, que està unit per IgG monomèrica (mentre que Fc RIIa i Fc RIII expressats pels neutròfils només s'uneixen a complexos immunes).

En conseqüència, vam trobar que la fagocitosi opsònica per cèl·lules THP-1 en condicions estàndard (que contenia només un 10 per cent de FCS i sense sèrum humà) estava fortament inhibida pel bloquejador Fc RI amb inhibició limitada pel bloquejador Fc RIIa, i cap amb Fc. Bloqueig de RIII (Fig. 2C). Això va suggerir que la interacció entre IgG i Fc RI era especialment important per a les cèl·lules THP-1, contrastant els resultats observats amb els neutròfils. Per tant, vam modificar l'assaig estàndard de THP-1 per fer-lo més rellevant fisiològicament mitjançant la inclusió de sèrum humà al medi d'assaig.

En presència d'un sèrum humà addicional del 2,5 per cent (tal com s'utilitza en els assaigs de leucòcits i neutròfils sencers), hi va haver molta menys fagocitosi opsònica (Fig. 2D), presumiblement a causa de la unió de la IgG humana monomèrica no immune present al sèrum humà. al Fc RI. Aquestes troballes poden explicar encara més la baixa activitat fagocítica dels monòcits primaris observada en els assaigs de leucòcits sencers en presència de sèrum humà; IgG bovina (present a FCS) no s'uneix a la Fc RI37 humana.

Donada l'aparent importància de Fc RIII, vam mesurar encara més la funció dels anticossos contra la CSP entre els adults kenyans en assajos ADCC, ja que les interaccions de Fc RIII tenen un paper clau en la mediació de l'ADCC mitjançant cèl·lules NK. Hem provat una selecció de mostres de la cohort d'adults de Kenya (cohort de Kanyawegi) per representar els responents alts, intermedis i baixos (n=31) en un assaig mitjançant una línia cel·lular reportera ADCC que només expressa Fc RIIIa. Els anticossos adquirits de manera natural entre els adults kenyans tenien una activitat significativa, mentre que els anticossos de donants ingenus de la malària de Melbourne no ho van fer (Fig. 2E, F). Aquestes troballes suggereixen que els anticossos contra CSP també poden promoure l'activitat de l'ADCC mitjançant la implicació de Fc RIIIa. Posteriorment, vam provar l'activitat de cèl·lules NK primàries en sang fresca mitjançant un assaig de desgranulació establert 38. La incubació de cèl·lules NK amb perles CSP opsonitzades per anticossos adults de Kenya condueix a la desgranulació de cèl·lules NK primàries (Fig. 2G, H). L'activitat va variar entre les mostres provades i es va correlacionar significativament amb la unió de Fc RIII (r=0.538, P=0.002, Fig. 2H), però feblement correlacionada amb IgG a CSP (r {{10} },127, P=0,489, n=31).

Unió directa de Fc RIII i Fc RIIa per complexos anticossos-antigen.

Hem desenvolupat assajos d'unió a Fc R mitjançant Fc RIIa i Fc RIII que es van expressar i purificar com a dímers perquè puguin interactuar amb complexos antigen-anticossos39. Els adults kenyans tenien una elevada prevalença i magnitud d'anticossos contra CSP que podrien interactuar amb els dímers de Fc RIIa i Fc RIII (Fig. 3A). En general, el 67,3 i el 61,5 per cent de les mostres (n=104) es van considerar positives per a la unió de Fc RIIa i Fc RIII. Mentre que la unió d'ambdós Fc Rs tenia una correlació forta i positiva entre les mostres (r=0.71, P< 0.0001, n = 104) (Fig. 3B), some individual samples demonstrated high binding to one FcγR and low binding to the other. Furthermore, the ability of antibodies to CSP to promote direct binding of FcγRIII was significantly correlated with ADCC tested by the ADCC reporter cell line (r = 0.405, P = 0.022, Fig. 2F) and primary NK cells (r = 0.538, P = 0.002, Fig. 2H). FcγRs occur in populations as different alleles40. 

Per tant, vam provar diferents al·lels de Fc RIIa (R131, H131) i Fc RIII (F158, V158) per a la unió mediada per IgG39. Les dades publicades indiquen que aquests al·lels són freqüents a la nostra població d'estudi41. Els anticossos contra CSP van promoure eficaçment la unió dels dos al·lels de Fc RIIa i Fc RIII. Hi va haver una alta correlació de la unió de Fc R entre els diferents al·lels; rho=0,8371 per a Fc RIIa, i rho=0,78 per a Fc RIII (Fig. 3C, D).

Regions de CSP dirigides per anticossos funcionals.

Les nostres dades anteriors indicaven que la CSP era un objectiu important dels anticossos humans que promouen la fagocitosi (Fig. 1F, G). Per tant, a continuació, vam investigar diferents regions de CSP com a objectius d'anticossos funcionals en individus exposats a la malària mitjançant tres construccions de CSP: (i) un pèptid sintètic que representa la regió NT (que no està inclosa a la vacuna RTS, S), (ii) ) un pèptid sintètic que representa la regió repetida (repeticions NANP), (iii) una proteïna recombinant que representa la regió CT. Cada construcció es va revestir per separat sobre perles fluorescents (a concentracions de saturació) i es va opsonitzar amb el conjunt de sèrums de Kenya. Els anticossos van promoure eficaçment la fagocitosi dels neutròfils de les perles recobertes amb cada construcció (Fig. 4A).

Posteriorment es van avaluar anticossos adquirits de manera natural a regions de CSP per la seva capacitat per promoure el compromís de Fc RIIa i Fc RIII. Els anticossos humans uneixen cada regió CSP amb la densitat suficient per promoure la unió de Fc RIIa i Fc RIII (Fig. 4B). Com que el nivell total d'unió d'IgG va variar entre diferents construccions CSP (figura suplementària 5), ​​vam estandarditzar la unió de Fc RIIa i Fc RIII en relació al nivell de reactivitat d'IgG (anomenada eficiència d'unió a Fc R). Les nostres dades van suggerir que els anticossos de la regió NT tenien un potencial més gran per implicar Fc Rs que les regions de repetició central i CT (l'activitat era significativament més alta per a les regions NT versus CT o NANP, P <{3}}.001 per a cada comparació) .

A més, vam avaluar la importància de diferents regions com a dianes d'anticossos funcionals mitjançant anticossos generats contra regions específiques i esporozoïts sencers en assajos de fagocitosi. Primer vam confirmar que els anticossos anti-CSP de conill poden promoure la fagocitosi dels esporozoïts. Els esporozoïts de P. falciparum opsonitzats amb aquests anticossos van donar un alt índex de fagocitosi (40,5 per cent) en comparació amb el control (Fig. 4C). Posteriorment, vam establir que un mAb conegut contra la regió central NANPrepeat de P. falciparum CSP (mAb 2H8, subclasse IgG2a de ratolí)33 va promoure una fagocitosi significativa (17, 4 per cent, figura 4D) que va ser més gran que la vista amb un mAb de control negatiu 3D11 que apunta a CSP de P. berghei que no té l'epítop NANPrepeat (Fig. 4D). La regió de repetició de NANP codifica un epítop immunodominant, mentre que se sap molt menys sobre la importància de les regions NT i CT com a objectius dels anticossos.

Per definir encara més el paper dels anticossos a les regions CT i NT i complementar les dades mitjançant anticossos humans, vam generar anticossos policlonals de conill a cada regió (figura suplementària 6) i vam utilitzar aquests anticossos per opsonitzar PfCSPP transgènic. esporozoïts de berghei per a la fagocitosi per neutròfils. Els anticossos policlonals de conill tant a les regions CT com a NT van promoure eficaçment la fagocitosi de PfCSP-P. esporozoïts de berghei (Fig. 4E). Atès que la concentració d'IgG a la CT i NT dels sèrums de conill vacunats era diferent (figura suplementària 6), es va avaluar l'eficiència de la fagocitosi i els anticossos, en relació amb els nivells d'IgG (calculats com a activitat de fagocitosi dividida per la reactivitat d'IgG determinada per ELISA). Això va demostrar que els anticossos de la regió N-terminal tenien una eficiència de fagocitosi significativament més alta en comparació amb els anticossos CT.

Com que els anticossos de la regió NT eren molt efectius per activar Fc Rs i promoure la fagocitosi opsònica, vam realitzar un mapeig d'epítops dels anticossos policlonals de conill contra la regió NT mitjançant una matriu de pèptids superposats (Fig. 4F i Fig. 6D suplementària). Una matriu de pèptids era adequada per al mapeig d'epítops perquè es preveu que la regió NT no estigui estructurada i no conté cisteïnes (PlasmoDB, https://plasmodb.org/plasmo/app/record/gene/PF3D7_0304600). Els anticossos eren reactius amb pèptids que cobrien una regió 21-aa (DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ) que està a prop de la unió entre la regió N-terminal i la regió repetida NANP/NVPD.

Adquisició d'anticossos que promouen les interaccions Fc R i la fagocitosi opsònica mitjançant l'exposició natural.

Es van analitzar mostres de sèrum recollides d'una cohort de nens i adults exposats a la malària que resideixen a l'oest de Kenya en una regió amb alta intensitat de transmissió de la malària (de la regió de Chulaimbo, taula suplementària 1). En aquest entorn, la major part de la morbiditat i mortalitat per malària es produeix en nens d'edat<5 years. 

En canvi, els adults tenen una immunitat substancial, demostrada per la manca de desenvolupament d'episodis de malària simptomàtica, encara que es pot produir parasitemia asimptomàtica42. Hem mesurat la capacitat dels anticossos específics de CSP per interactuar amb Fc RIIa i Fc RIII, així com promoure la fagocitosi opsònica de les perles de CSP per neutròfils (Fig. 5A-D). La prevalença global d'anticossos amb cada activitat funcional va ser la fagocitosi de neutròfils al 16 per cent, (IC del 95 per cent, 9,19, 26,38 per cent), la unió de Fc RIIa al 20 per cent (IC del 95 per cent, 12,28, 30,84 per cent) i la unió de Fc RIII al 14,7 per cent. (IC del 95 per cent, 8,19, 24,85 per cent). El nivell de reactivitat d'IgG a CSP, unió a Fc R i fagocitosi opsònica per neutròfils era baix entre els nens petits i augmentava significativament amb l'edat.

Per contra, els adults amb exposició de tota la vida havien adquirit anticossos funcionals significativament més alts en comparació amb els nens. També es van avaluar anticossos que van promoure la fagocitosi dels merozoïts en fase sanguínia, que tenien una prevalença i un nivell substancialment més alts entre els nens petits en comparació amb els anticossos funcionals contra la CSP (Fig. 5B, E, F). Això dóna suport al concepte que la immunitat adquirida de manera natural als esporozoïts s'adquireix molt més lentament i requereix una exposició substancialment més gran per desenvolupar-se, en comparació amb la immunitat de l'etapa de la sang. Es va investigar si la major activitat funcional entre els adults només resulta de la major concentració d'IgG específica de CSP o també reflecteix un potencial funcional més alt dels anticossos entre els adults. Hem analitzat l'activitat funcional dels anticossos en relació amb la reactivitat de IgG contra CSP; per fer-ho, vam excloure els individus amb molt baixa IgG a CSP (per sota de la OD mediana de 0.140) i vam calcular l'activitat funcional en relació amb el nivell d'IgG per a cada individu.

Curiosament, això va demostrar que l'eficiència relativa de la fagocitosi era significativament més alta en adults en comparació amb nens (figura 5G) (prova de Mann-Whitney, P=0.022). A més, hi va haver una correlació significativa entre l'edat i les eficiències d'unió de Fc R (r=0.354, P=0.031 per a la unió de Fc RIIa i r=0.572 per a la unió de Fc RIII, P <0,001).

Fagocitosi opsònica per neutròfils correlacionada amb la unió a Fc R i les subclasses d'IgG citofíliques

Hem ampliat la nostra anàlisi a una cohort més gran d'adults immunes a l'oest de Kenya (cohort Kanyawegi, n=104) que han estat exposats a la malària durant tota la vida en una regió amb una alta intensitat de transmissió de la malària. Vam raonar que una gran proporció d'aquests adults és probable que tinguin anticossos funcionals contra CSP, facilitant l'anàlisi dels factors d'anticossos i les especificitats que determinen l'activitat de la fagocitosi opsònica funcional. De fet, moltes mostres van demostrar una fagocitosi substancial i una activitat d'unió a Fc R. La prevalença d'anticossos amb cada activitat funcional va ser la fagocitosi de neutròfils del 47,1 per cent (IC del 95 per cent, 37,6, 56,9 per cent), la unió de Fc RIIa un 67,3 per cent, (IC del 95 per cent, 57,6, 75,8 per cent) i la unió de Fc RIII per cent (61,5 per cent). , 51,7, 70,5 per cent).

La fagocitosi opsònica per neutròfils es va correlacionar significativament amb la unió de Fc RIIa (r {{0}},50, P <0.001) i la unió de Fc RIII (r=0,43, P <0,001) (Fig. 6A). L'anàlisi de regressió multivariant va suggerir que Fc RIII era el principal factor associat a la fagocitosi opsònica dels neutròfils (coeficient de regressió=10, 15, P <0, 001, Taula 1), mentre que Fc RIIa era menys important. Anteriorment hem informat que els anticossos contra CSP en aquesta cohort d'adults són predominantment IgG1 i IgG3, amb nivells més baixos d'IgG2 i molt poca IgG433. IgG1 i IgG3 són les principals subclasses que interaccionen amb Fc RIIa i Fc RIII per promoure la fagocitosi, i la IgG2 té una activitat feble. Entre els adults kenyans, la fagocitosi dels neutròfils es va correlacionar positivament de manera significativa amb IgG1 (r=0,32, P <0,001), IgG2 (r=0,26, P=0,007) i més. fortament amb IgG3 (r=0, 50, P < 0, 001) (Fig. 6B, C, figura suplementària 7 i taula suplementària 2).

No es va observar cap correlació amb IgG4 (r=0.09, P = 0.365), tot i que els nivells d'IgG4 eren baixos. En la regressió multivariant, IgG3 es va mantenir associada significativament a la fagocitosi dels neutròfils, cosa que suggereix que és el principal mediador d'aquesta activitat (taula suplementària 3). A més, tant la unió de Fc RIIa com de Fc RIII es van correlacionar significativament amb els nivells totals de subclasses IgG i IgG, principalment IgG1 i IgG3 (taules suplementàries 2 i 3). En general, les mostres classificades com amb una alta activitat de fagocitosi (definida com per sobre de la mediana) tenien nivells significativament més alts d'unió a Fc RIIa i Fc RIII i IgG3, i tenien nivells significativament més alts d'IgG a totes les regions de CSP, en comparació amb mostres amb baixa fagocitosi. activitat (Fig. 6D, E).

Es van trobar observacions similars entre la cohort de nens i adults de Chulaimbo. La fagocitosi opsònica es va correlacionar significativament amb la unió de Fc R i IgG1 i IgG3, amb la correlació més forta per a Fc RIII i IgG3 (taules suplementàries 4 i 5). Hem aplicat aquests assajos en un assaig clínic de fase 1/2a de la vacuna RTS, S. Això va demostrar que els anticossos que promouen la fagocitosi opsònica per neutròfils i la unió de Fc RIII i Fc RIIa eren més alts entre els subjectes protegits que els no protegits43.

Discussió

Proporcionem resultats que defineixen mecanismes i objectius de la immunitat mediada per anticossos als esporozoïts mitjançant interaccions amb Fc Rs específics expressats en cèl·lules immunitàries. Les nostres troballes donen suport a un paper clau dels neutròfils en l'eliminació dels esporozoïts a la sang, mediat per les interaccions Fc RIIa i Fc RIII amb IgG1 i IgG3 dirigides a l'antigen principal d'esporozoit, CSP, amb contribucions addicionals de monòcits (subconjunt clàssic) i cèl·lules NK. Utilitzant esporozoïts intactes i perles recobertes d'antigen, vam establir que la fagocitosi, a la sang sencera, era predominantment per neutròfils, contrastant amb l'activitat de baix nivell observada amb els monòcits. Hem definit mecanismes clau implicats bloquejant Fc Rs específics a les superfícies cel·lulars i utilitzant dímers Fc R com a sondes per unir complexos antigen-anticossos.

Això va identificar la importància de Fc RIIa i Fc RIII, i les dades apunten especialment a la importància de Fc RIII. Hem definit dianes d'anticossos d'aquest mecanisme funcional utilitzant anticossos a diferents regions de CSP, diferents regions de CSP recobertes de perles i esporozoïts quimèrics de P. berghei que expressen P. falciparum CSP. Vam establir que la CSP és un objectiu principal d'aquests anticossos funcionals i les tres regions de la CSP poden ser dirigides per anticossos per involucrar Fc R i promoure la fagocitosi.

En particular, els anticossos de la regió NT van tenir una activitat significativa en una sèrie de diferents assajos, proporcionant un potencial avantatge per al desenvolupament de vacunes, ja que la regió NT no s'inclou a les vacunes basades en CSP RTS, S (ara en estudis d'implementació) o R21. (en assaigs de fase 2). A més, vam establir que els anticossos adquirits de manera natural eren capaços de promoure la fagocitosi opsònica dels esporozoïts. L'adquisició d'anticossos funcionals depenia de l'edat i només es van observar nivells més alts d'activitat de fagocitosi opsònica i unió de Fc RIIa i Fc RIII amb mostres d'adults però no de nens petits. L'activitat funcional es va correlacionar amb les subclasses IgG1 i IgG3.

La major activitat de fagocitosi dels neutròfils, però l'activitat molt baixa dels monòcits, pot estar relacionada amb la presència i l'ús de diferents Fc R; els neutròfils tenien una major taxa de fagocitosi, que no s'explicava simplement per la major abundància de neutròfils en comparació amb els monòcits. Curiosament, el bloqueig de Fc RIIa o Fc RIIIa/b va inhibir l'activitat de fagocitosi dels neutròfils, cosa que suggereix que tots dos receptors són necessaris per a la fagocitosi, que es va recolzar en aconseguir una inhibició més gran amb anticossos bloquejadors de Fc RIIa i Fc RIII utilitzats en combinació. El bloqueig de Fc RI no va afectar la fagocitosi dels neutròfils. Diverses observacions van suggerir la major importància de Fc RIII; En general, hi va haver una major inhibició de la fagocitosi d'esporozoits pel bloqueig de Fc RIII, i la unió de Fc RIII per anticossos estava més altament correlacionada amb la fagocitosi que Fc RIIa en l'anàlisi multivariant.

Fc RIIIb, que està ancorat a GPI, és el tipus Fc RIII més abundant expressat en neutròfils, però estudis recents han informat que els neutròfils també expressen Fc RIIIa30, que té un domini transmembrana i citoplasmàtic per a la senyalització intracel·lular. Per a la fagocitosi, la senyalització intracel·lular es pot produir a través de Fc RIIIa o Fc RIIa, i la unió a Fc RIIIb també és important, tal com indiquen les nostres troballes. Si Fc RIII i Fc RIIa actuen de manera cooperativa en la fagocitosi, això pot explicar per què hi havia una activitat limitada de Fc RIIa en la fagocitosi dels monòcits. Les cèl·lules NK expressen Fc RIIIa i vam establir que els anticossos contra CSP poden promoure l'activació de NK mitjançant la interacció amb Fc RIIIa. Això pot provocar la matança d'esporozoïts així com l'alliberament de citocines proinflamatòries44.

Tanmateix, les cèl·lules NK només comprenen entre l'1 i el 5% dels leucòcits a la sang, cosa que suggereix que tindrien un paper menys destacat en la immunitat contra els esporozoïts que els neutròfils, que comprenen entre el 50 i el 70% dels leucòcits. Els esporozoïts també s'exposen als macròfags dèrmics i a les cèl·lules de Kupffer del fetge, cosa que podria implicar mecanismes addicionals d'eliminació mediada per Fc R i justificar la investigació en estudis futurs, però la freqüència relativa d'aquestes cèl·lules i la seva expressió de Fc Rs és diferent a la dels fagòcits a la sang. .

Els estudis existents sobre la fagocitosi opsònica mediada per anticossos a la malària han utilitzat en gran mesura la línia cel·lular THP-1 com a model, utilitzant condicions estàndard amb FCS (però sense incloure sèrum humà). En aquestes condicions, vam trobar que la fagocitosi es va inhibir efectivament pel bloqueig de Fc RI, però es va observar una inhibició mínima amb el bloqueig de Fc RIIa o Fc RIII. Un estudi recent va informar que la fagocitosi opsònica per cèl·lules THP-1 no es va correlacionar amb la protecció en un assaig RTS, fase I/IIa S en adults sense malària45. Hem demostrat que la IgG inespecífica en sèrum humà també pot reduir l'activitat de fagocitosi cel·lular THP-1 perquè les interaccions Fc RI són inhibides per IgG monomèrica presentada al plasma humà, mentre que la IgG monomèrica bovina no s'uneix a la Fc RI humana. En conjunt, aquestes troballes suggereixen que les cèl·lules THP-1 no són un model ideal per estudiar la fagocitosi opsònica contra els esporozoïts.

Vam establir que les tres regions de CSP poden ser dirigides per anticossos que involucren Fc RIIa i Fc RIII per promoure la fagocitosi dels esporozoïts per part dels neutròfils, atribuint així funcions d'anticossos a aquestes regions que no s'han informat anteriorment. Cal destacar que hi va haver una activitat significativa d'anticossos a la regió NT tal com es va veure en assajos de fagocitosi utilitzant anticossos humans amb perles recobertes d'antígens, fagocitosi d'esporozoïts per anticossos de conill elevats a diferents regions i unió de Fc R per anticossos humans. Aquestes troballes suggereixen que un enfocament més gran a la regió NT en el disseny de la vacuna pot ser valuós, a més de la inclusió de les regions de repetició central i CT. Les vacunes líders actuals no inclouen la regió NT3,46. Hem mapejat els epítops d'anticossos a una regió 21-aa que es troba a prop de la unió entre les regions de repetició NT i central, però no inclou l'epítop d'unió descrit recentment34 i és diferent de l'epítop de la Regió I, que és un lloc per a Escissió N-terminal en el moment de la invasió dels hepatòcits47,48.

Les nostres observacions que els anticossos adquirits mitjançant l'exposició a la malària poden promoure la fagocitosi mediada per Fc R per neutròfils donen suport encara més al concepte que es tracta d'un mecanisme que es produeix in vivo entre individus que desenvolupen alts nivells d'immunitat. En un entorn d'alta transmissió de la malària a Kenya, aquests anticossos funcionals són molt baixos entre els nens petits que tenen més risc d'infecció i malària greu, però que es produeixen en adults. Estudis previs en aquesta població van trobar que els nivells elevats d'anticossos contra la CSP entre els adults estaven associats amb un risc reduït d'infecció entre els adults49. En canvi, una cohort de nens predominantment no va trobar cap associació a Mali, on la intensitat de transmissió de la malària era inferior a la nostra població d'estudi50. Curiosament, els nivells relatius d'activitat d'unió amb cada Fc R van variar significativament entre els individus, cosa que és probable que afecti l'activitat de la fagocitosi. Les variacions en la unió específica de Fc R estaran influenciades pels perfils de la subclasse d'IgG, els epítops dirigits per anticossos i la glicosilació d'IgG22. IgG1 i IgG3 van predominar entre les subclasses d'IgG adquirides i es van correlacionar amb l'activitat d'unió a Fc R.

En aquest estudi, vam adaptar l'ús de microesferes recobertes d'antigen per estudiar l'activitat de fagocitosi opsònica dels anticossos contra CSP, l'objectiu immune clau dels esporozoïts de P. falciparum. Un avantatge d'aquest enfocament és que supera els reptes de generar grans quantitats d'esporozoïts per a assaigs immunològics, cosa que és difícil d'aconseguir per a grans estudis de població i assaigs clínics. El nivell de fagocitosi opsònica mesurat amb comptes recoberts de CSP estava altament correlacionat amb el mesurat amb esporozoïts intactes. Aquesta plataforma també ens va permetre disseccionar les respostes d'anticossos funcionals a cada regió de CSP. També vam confirmar la fagocitosi mitjançant esporozoïts criopreservats (viabilitat > 85 per cent 51) i esporozoïts recentment dissecats.

Estudis anteriors han demostrat que els anticossos contra els esporozoïts poden inhibir la motilitat dels esporozoïts, el recorregut cel·lular i la invasió d'hepatòcits com a mecanismes immunitaris potencials. Tanmateix, actualment no hi ha proves consistents que demostrin que aquests mecanismes es correlacionin amb la protecció contra la infecció per Plasmodium en estudis clínics3. En els models d'immunització passiva en animals, nivells elevats d'IgG a CSP poden protegir contra la infecció experimental3,4. No obstant això, els anticossos induïts per la vacuna encara no s'han aconseguit nivells alts de protecció similars, sostinguts al llarg del temps, en assaigs clínics52–56. RTS, S indueix nivells CSP IgG molt alts, però només proporciona una protecció modesta53,56, cosa que suggereix que es necessiten altres estratègies per generar anticossos que tinguin una activitat protectora funcional més alta3,4. Les nostres dades proporcionen informació sobre un mecanisme immune d'anticossos molt poc estudiat en l'eliminació fagocítica dels esporozoïts i suggereixen que l'aprofitament dels mecanismes mediats per Fc podria ser una estratègia per generar una immunitat més potent per a nivells de protecció més alts. Això es podria aconseguir mitjançant estratègies de vacuna que optimitzin les respostes de la subclasse d'IgG, redueixin la IgM que pot inhibir les interaccions Fc R i milloren l'orientació d'epítops funcionals específics. Aquests avenços es podrien aconseguir mitjançant l'ús d'adjuvants específics de vacuna i disseny d'immunogen. Les interaccions Fc R amb IgG unides als antígens també poden estar influenciades per la densitat d'epítops i l'orientació espacial i el posicionament dels epítops57,58. Els enfocaments de la biologia estructural poden ser valuosos per entendre-ho i per informar el disseny de vacunes. També és possible que diferents regions de CSP mediïn la immunitat mitjançant diferents mecanismes immunitaris.

Això s'ha demostrat per a l'hemaglutinina de la grip, i els mecanismes mediats per Fc R són importants per als anticossos de la regió de la tija conservada, però menys importants per als anticossos específics de la soca a la regió del cap18,21.

Els estudis futurs que investiguen la inducció d'aquests anticossos funcionals i la seva correlació amb la protecció estan justificats en assaigs de fase II i fase III de RTS, S i altres vacunes basades en CSP. Hem realitzat un estudi inicial en l'assaig de fase I/IIa de RTS, S56. Això va establir que la vacunació RTS, S indueix efectivament anticossos contra CSP que promouen la unió de Fc RIIa i Fc RIII, així com la fagocitosi pels neutròfils. És important destacar que aquestes activitats funcionals eren significativament més altes entre els subjectes que estaven protegits contra la infecció per malària en comparació amb els que van desenvolupar la infecció43. Tot i que la CSP és un objectiu de la immunitat humana adquirida, inclosos els anticossos funcionals, actualment hi ha una comprensió limitada de les diferències potencials en la immunitat adquirida de manera natural i induïda per la vacuna contra els esporozoïts. Més investigacions sobre aquestes diferències poden revelar idees importants per informar el desenvolupament de vacunes.

En resum, els nostres estudis han definit mecanismes i objectius clau de la immunitat mediada per Fc R contra els esporozoïts a la sang. Els nostres resultats assenyalen un paper important dels neutròfils en l'eliminació fagocítica dels esporozoïts, van definir papers importants per a Fc RIIa i Fc RIII i van establir CSP com a objectiu clau per a aquesta activitat funcional. Els monòcits també contribueixen a la fagocitosi, però tenen una activitat més baixa, i els anticossos també poden promoure l'activitat ADCC de les cèl·lules NK mitjançant la participació de Fc RIIIa. Entendre i definir els mecanismes que medien la immunitat és crucial per permetre el desenvolupament de vacunes més eficaços. Els estudis futurs haurien d'investigar amb quina eficàcia les vacunes actuals en assaigs clínics generen anticossos amb aquestes activitats funcionals. Aprofitar aquest coneixement en el desenvolupament de vacunes pot ser una estratègia eficaç per generar una resposta immune potent que proporcioni nivells més alts de protecció contra la malària.

Mètodes

Estudiar poblacions i declaració ètica.

El plasma d'adults sans i asimptomàtics exposats a la malària que vivien al subdistricte de Kanyawegi del comtat de Kisumu, Kenya (n=104, interval d'edat entre 18 i 79 anys; 26,9 per cent d'homes) es va recollir el 2 d'agost007 (cohort Kanyawegi)59; cap participant tenia símptomes de malària i el 46,15 per cent té parasitemia asimptomàtica per P. falciparum (detectada per microscòpia). El plasma de nens petits i adults sans i asimptomàtics que viuen al subdistricte de Chulaimbo del comtat de Kisumu, Kenya (n=75, interval d'edat de 0,3 a 5,9 anys per als nens, interval d'edat de 19,6 a 69,2 anys per a adults; 55 per cent de dones) va ser recollit entre febrer-març de 2007 (cohort Chulaimbo)42; Els detalls de la cohort es resumeixen a la taula complementària 1. La intensitat de la transmissió era relativament alta en el moment en què es va recollir sang (la prevalença de parasitemia asimptomàtica en nens menors o iguals a 10 anys era del 70-80 per cent)60. Es va recollir sang d'adults homes i dones sans per utilitzar-la en assajos de leucòcits, neutròfils, monòcits i NK sencers.

L'aprovació ètica es va obtenir de l'Alfred Hospital Human Research and Ethics Committee (protocol 385-18), la Institutional Review Board for Human Investigation als Hospitals Universitaris de Cleveland per a Case Western Reserve University, EUA (protocol 02-04-04) i el Comitè de revisió ètica del Kenya Medical Research Institute, Kenya (protocol SSC867). Es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els participants de l'estudi o dels seus pares o tutors legals.

Antígens.

Els antígens utilitzats en aquest estudi es basaven tots en la seqüència de referència 3D7 de P. falciparum CSP (ID del gen PF3D7_0304600; www.plasmodb.org). El CSP recombinant de longitud completa es va comprar a Sanaria (Sanaria, Rockville, EUA).

La proteïna es va expressar en Pichia pastoris començant al residu d'aminoàcids 50 i conté (NANP) 22 repeticions i (NVPD) 4 repeticions. La regió C-terminal de CSP (CT) i una fusió de la regió N-terminal i la regió C-terminal de CSP (N més C) es van generar com a proteïnes recombinants mitjançant cèl·lules HEK293F (comprate a Invitrogen, Austràlia). La regió N-terminal de CSP (aminoàcid 19-104, NT) es va generar com a pèptids sintètics, i la regió de repetició central de CSP (NANP) també es va generar com a pèptids sintètics (NANP × 15) per LifeTein (LifeTein, NJ, EUA).

Generació d'anticossos contra diferents proteïnes CSP.

realitzat per la instal·lació d'anticossos de l'Institut Walter Eliza Hall; l'aprovació va ser proporcionada pel Comitè d'Ètica Animal de l'Institut Walter i Eliza Hall (ref: 2020.019, 2014.009). Breument, els conills (n=2) es van vacunar amb un dels antígens següents: CSP de longitud completa, proteïna recombinant N més C i pèptid NT. Cada conill va rebre tres dosis d'antigen (200 µg/dosi) coadministrades amb l'adjuvant de Freud el dia 0, el dia 28 i el dia 56. Els sèrums de conill es van recollir després de la tercera vacunació el dia 68 i la IgG de conill es va purificar per la proteïna A. - Selecció positiva. El conill anti-N més C IgG es va provar inicialment i es va demostrar que reconeixia predominantment la regió C-terminal de CSP, i no la regió N-terminal (figura suplementària 6A). Es va confirmar que la IgG anti-NT del conill reconeixia la regió N-terminal de CSP (figura suplementària 6B). Tant els anticossos NT com CT van reaccionar amb CSP de longitud completa (figura suplementària 6C). L'anticòs monoclonal (mAb) MGG434, que es va aïllar d'un individu després d'una infecció repetida amb esporozoïts atenuats, es va expressar i purificar com a anticossos IgG1 recombinant a les cèl·lules HEK293 mitjançant enfocaments establerts. El mAb es va provar amb CSP recombinant per confirmar l'especificitat. El mAb 2A1061 anti-CSP es va expressar amb mutacions LALA a la regió Fc62 per inhibir les interaccions Fc R com a anticossos de control.

Aïllament de PBMC, neutròfils i leucòcits sencers de sang perifèrica.

Les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) i els neutròfils es van aïllar de la sang perifèrica mitjançant mètodes establerts prèviament63,64. Breument, la sang perifèrica de donants sans es va separar mitjançant la centrifugació de gradient Ficoll. Es van recollir per separat les capes de Buffy, que contenen PBMC, i el pellet de RBC que conté neutròfils. Per a l'aïllament de PBMC, les cèl·lules recollides de la capa de Buffy es van rentar quatre vegades amb PBS -1 per cent de NCS a 4 graus. Els PBMC es van tornar a suspendre posteriorment en sèrum boví fetal (FCS) de RPMI 1640-10 per cent i es van mantenir en gel. Els neutròfils es van enriquir mitjançant la segmentació de dextran del pellet RBC després de la centrifugació en gradient de Ficoll, seguida de la lisi hipotònica63.

Es van aïllar leucòcits sencers de la sang sencera mitjançant l'enriquiment inicial amb segmentació de dextran seguida de lisi hipotònica. Els neutròfils aïllats i els leucòcits sencers es van ajustar a 5 × 105 neutròfils / ml o 5 × 106 fagòcits (monòcits i neutròfils) / ml i posteriorment es van tornar a suspendre en RPMI1640 suplementat amb un 10 per cent de FCS i un 2, 5 per cent de sèrum humà inactivat per calor i conservat. Les cèl·lules es van fenotipar per a l'expressió de Fc R mitjançant anticossos contra Fc RI (Clone 10.1 BD Bioscience, 1:50), Fc RIIa (Clone 8.26, BD Bioscience, 1:25) i Fc RIII (Clone 3G8 BD Bioscience, 1:50) . També es van utilitzar anticossos contra CD14 (Clone M5E2, BD Bioscience, 1:20) per determinar subconjunts de monòcits.

Manteniment de cèl·lules THP-1.

Les cèl·lules de la línia cel·lular promonocítica THP{{{0}} (procedent d'ATCC) es van mantenir a RPMI-1640 amb 0,002 mol/L L-glutamina, 0,01 mol/L HEPES , i sèrum de vedella fetal al 10 per cent (FCS). La densitat cel·lular es va controlar de prop i es va mantenir entre 1 × 105 i 1 × 106 cèl·lules/ml. Les cèl·lules es van passar cada 6 dies o quan la densitat cel·lular s'acostava a 1 × 106 cèl·lules/ml.

Cultiu i aïllament d'esporozoïts de P. berghei.

Els mosquits Anopheles stephensi es van alimentar amb ratolins Swiss Webster infectats amb un CSP quimèric que expressava la línia de paràsits ANKA de P. berghei 12. Les glàndules salivals es van disseccionar entre 18 i 22 dies després del menjar de sang infecciosa i es van homogeneïtzar en PBS. Els esporozoïts es van passar per un colador de teixit de 70- μm (Falcon) i es van comptar amb un hemocitòmetre.

Cultiu i aïllament de merozoïts de P. falciparum.

La línia D10 de P. falciparum es va mantenir a RPMI-HEPES complementada amb 0,5% Albumax (Life Technologies) i 0,18% NaHCO3. Els cultius es van mantenir per sota del 10% de parasitemia i es van sincronitzar mitjançant el tractament amb sorbitol. Els merozoïts es van aïllar mitjançant mètodes publicats anteriorment 32. Breument, l'etapa d'esquizont dels eritròcits infectats es va enriquir mitjançant purificació magnètica i es va continuar cultivant en un medi complementat amb transepoxisuccinil-L-leucilamido(4-guanidino)butà (E64, Sigma). -Aldrich) durant 8 h abans de passar els esquizonts madurs per un filtre d'1,2-μm per alliberar els merozoïts. Els merozoïts es van ajustar a 5 × 107 / ml per a l'assaig de fagocitosi opsònica o 1 × 107 / ml per al recobriment a una placa ELISA per a l'assaig d'unió a Fc R.

Acoblament covalent d'antígens a perles de làtex fluorescents.

Perles de làtex fluorescents modificades amb amina de 2,0-µm (Sigma-Aldrich) es van rentar dues vegades amb 40{0 µl de PBS i es van centrifugar a 2000 × g durant 3 min. Es va afegir glutaraldehid del 8 per cent en PBS a les perles i es va incubar en un corró durant la nit a 4 graus. Després de rentar-se amb PBS, es va afegir 1 mg/ml de CSP recombinant a les perles i es va incubar en un vòrtex durant 6 h. Posteriorment, les perles es van centrifugar i es van tornar a suspendre en 200 µl d'etanolamina i es van incubar durant 30 min en un vòrtex per apagar tots els grups amines restants. Les perles es van rentar posteriorment en PBS i es van bloquejar amb un 1% de BSA durant la nit a 4 graus. Les perles recobertes d'antigen es van mantenir en un bany d'aigua de sonicació durant 20 min a 4 graus per reduir l'agregació i posteriorment es van ajustar a 5 × 107 perles/ml. Les perles es van emmagatzemar a 4 graus en presència d'un 0,1 per cent de SDS i un 0,02 per cent de NaN3.

Assajos de fagocitosi opsònica.

Els assajos de fagocitosi opsònica es van realitzar en configuracions variables per a diferents finalitats, tal com es descriu a continuació i a la taula suplementària 6.

Per a la fagocitosi opsònica dels esporozoïts de P. falciparum i P. berghei utilitzant cèl·lules aïllades, PATHMVI (Samaria, Rockville, EUA) va proporcionar esporozoits criopreservats de P. falciparum i es van emmagatzemar en nitrogen líquid i es van descongelar a 37 graus durant 40 s com es descriu a manual d'usuari del fabricant. En aquest estudi també es van utilitzar esporozoïts de P. berghei recentment dissecats que havien estat transfectats per expressar el PfCSP12. El mateix enfocament es va utilitzar per als esporozoïts de P. falciparum i P. berghei en els experiments. Els esporozoïts es van tacar amb 10 µg/ml de bromur d'etidi durant 1 h sobre gel seguit de tres rentats amb RPMI-HEPES. Per a l'opsonització, es van incubar 50,000 esporozoïts amb 1 ul de sèrum de prova durant 1 h en gel, seguit de la co-incubació amb 5000 neutròfils a una concentració de 5 × 105 cèl·lules/ml en RPMI-1640 complementat amb un 10 per cent de FCS i un 2,5 per cent de sèrum humà inactivat per calor de donants de Melbourne ingenus a la malària. També es va afegir 1 ul addicional de sèrum de prova per tenir en compte el canvi de volum de l'addició de neutròfils i mantenir la mateixa concentració d'anticossos de prova durant la fagocitosi.

La coincubació es va permetre durant 15 minuts a 37 graus en una incubadora al 5% de CO2 perquè es produís la fagocitosi. Les cèl·lules es van centrifugar a 4 graus i es van rentar amb PBS fred -1% NCS–0,04% NaN3 (tampó FACS) per aturar l'activitat de la fagocitosi. El nivell de fagocitosi es va quantificar mitjançant citometria de flux (FACS CantoII, BD Biosciences) i es va analitzar mitjançant el programari FlowJo (versió 10). Les dades es van presentar com a índex de fagocitosi (PI), que es va definir com la proporció de neutròfils (figura suplementària 4A) o cèl·lules THP -1 (figura suplementària 1A) que tenien esporozoïts fagocitats. Per als experiments de la cohort Kanyawegi i Chulaimbo, el PI es va estandarditzar encara més com a índex de fagocitosi relativa (RPI), que es va definir com el percentatge de PI per a cada mostra en relació amb el control positiu. Els esporozoïts no opsonitzats es van incloure com a controls negatius en tots els assajos. Els assaigs estàndard de fagocitosi de neutròfils van incloure un 2,5 per cent de sèrum humà de donants no exposats a la malària. Els assajos estàndard de fagocitosi THP-1 es van realitzar mitjançant mètodes establerts que inclouen un 10% de FCS.

Per a la fagocitosi de perles o merozoïts recoberts d'antigen utilitzant cèl·lules aïllades, l'assaig de fagocitosi es va adaptar a partir de mètodes publicats anteriorment amb modificacions 32. Breument, es van opsonitzar 1 × 106 perles de làtex fluorescents o merozoïts amb mostres de sèrum durant 1 h. Les perles o merozoïts es van rentar tres vegades amb RPMI-1640 abans de la co-incubació amb 1 × 105 neutròfils per a la fagocitosi. Es va deixar que la fagocitosi es produís durant 20 min per a les perles o 10 min per als merozoïts a 37 graus i les cèl·lules es van rentar posteriorment amb tampó FACS a 300 × g i 4 graus durant 4 min. La proporció de neutròfils que contenen perles fluorescents o merozoïts es va avaluar mitjançant citometria de flux (FACS CantoII, BD Biosciences) i es va analitzar mitjançant el programari FlowJo (figura suplementària 4A). En alguns assajos, la línia cel·lular THP-1 es va utilitzar amb condicions estàndard que inclouen un 10% de FCS; en altres assajos, es va utilitzar un sèrum humà addicional del 2,5 per cent de donants ingènus de la malària de Melbourne per a la comparació.

Per a la fagocitosi de perles recobertes d'antigen o esporozoïts de P. berghei utilitzant preparacions de leucòcits de sang sencera, les perles recobertes de CSP es van opsonitzar amb un anticòs policlonal de conill generat contra CSP. La fagocitosi es va realitzar coincubant les perles opsonitzades amb la fracció total de leucòcits de sang sencera que contenia 1 × 106 fagòcits (monòcits i neutròfils) durant 20 min a 37 graus en una incubadora de 5 per cent de CO2. Aquests experiments es van realitzar utilitzant concentracions variables d'anticossos per a l'opsonització o proporcions variables de perles a fagòcits. Per provar la fagocitosi opsònica dels esporozoïts de P. berghei mitjançant preparacions de leucòcits sencers, es van opsonitzar 5 × 105 esporozoïts amb un grup de sèrums adults kenyans exposats a la malària a una dilució d'1:100, seguida d'una co-incubació amb leucòcits sencers que contenien 5 ×. 104 fagòcits. Les cèl·lules es van centrifugar a 4 graus durant 4 minuts per aturar l'activitat fagocítica i es van marcar diferents fagòcits (monòcits i neutròfils) amb anticossos conjugats amb fluorescència per a una anàlisi posterior. Els monòcits es van marcar amb anti-CD14-Alexa647 (MφP9 BD Bioscience, 1:33) i anti-CD{16- BV421 (3G8 BD Bioscience, 1:20), i els neutròfils es van marcar amb anti-CD66bAPC -H7 (G10F5 BD Bioscience, 1:33).

Per a l'anàlisi FACS, es van seleccionar les perles fagocitades com a poblacions PEhigh i FSChigh. Les perles que van ser fagocitades per monòcits i neutròfils es van distingir encara més mitjançant la tinció de CD14 i CD66b. El nombre de perles fagocitades per monòcits i neutròfils es va calcular en funció de la intensitat de fluorescència (figura suplementària 8). Aquest nombre es va estandarditzar encara més utilitzant el nombre total de fagòcits (monòcits i neutròfils) i es va expressar com a perles per 100 fagòcits, que representa la taxa de fagocitosi de diferents tipus de cèl·lules.

Per inhibir la fagocitosi opsònica bloquejant els receptors Fc o esgotant anticossos CSP, es van bloquejar diferents Fc R mitjançant anticossos de bloqueig específics. Fc RI es va bloquejar amb 50 µg/ml d'anticossos de bloqueig (mAb 10.1 Merck), Fc RIIa es va bloquejar amb 50 µg/ml d'anticossos de bloqueig (mAb IV.3), Fc RIII es va bloquejar amb 50 µg/ml d'anticossos de bloqueig (mAb 3G8) . Les cèl·lules THP-1 i els neutròfils es van tractar amb cada bloquejador Fc R, respectivament, a 4 graus durant 30 minuts abans de la co-incubació amb comptes de làtex recoberts de CSP, que s'han opsonitzat amb sèrum d'adults immunes. Es va realitzar un assaig de fagocitosi tal com s'ha esmentat anteriorment. Per avaluar el paper dels anticossos contra la CSP en la promoció de la fagocitosi mediada per anticossos humans adquirits, es va preincubar un grup de sèrum adult de Kenya durant 30 min amb CSP recombinant i pèptid de la regió NT a una concentració de 20 ug/ml per unir-se a CSP específic. anticossos, abans d'utilitzar-los en assajos de fagocitosi.

Mesura de les subclasses d'IgG i IgG totals mitjançant ELISA.

Les subclasses d'IgG i IgG totals a proteïnes recombinants es van mesurar mitjançant ELISA tal com es va descriure anteriorment33. Breument, el CSP es va recobrir a 1 µg/ml en plaques de microtitulació 96-pou Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca) i es va incubar durant la nit a 4 graus. Les plaques es van rentar amb PBS que contenia 0, 05 per cent de Tween20 (PBS-Tween) i es van bloquejar amb PBS {-1 per cent de BSA a 37 graus durant 2 h. El sèrum humà o IgG de conill es va diluir a la concentració desitjada i es va afegir a les plaques per duplicat. Per a la detecció total d'IgG, es va utilitzar IgG anti-humana de cabra conjugada amb HRP a una dilució 1:2500 seguida del substrat ABTS per al desenvolupament del color. La reacció es va aturar amb un 1% de SDS i es va mesurar l'absorbància a 405 nm. Per a la detecció de la subclasse d'IgG, es van utilitzar mAbs a IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 humana a una dilució 1:1000, seguida de la IgG anti-ratolí de cabra conjugada amb HRP utilitzada a una dilució 1:2500. Finalment, es va utilitzar el substrat de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB, Life Technologies) per al desenvolupament del color i la reacció es va aturar amb H2SO4 1 M. L'absorbància es va mesurar a 450 nm. Com a control positiu es va utilitzar un grup de sèrum adult de Kenya amb una alta reactivitat d'IgG a CSP.

Mapeig d'epítops d'anticossos de la regió NT.

Es va sintetitzar una matriu que contenia 70 pèptids 15-mers biotinilats que representen la seqüència lineal de CSP (cep 3D7/NF54) (Mimotopes, Austràlia). Cada pèptid tenia un espaiador SGSG curt entre la seqüència del pèptid CSP i l'etiqueta de biotina (que es va afegir per ajudar a la immobilització) i una superposició de 12 aa entre pèptids. Els assajos d'anticossos es van realitzar mitjançant enfocaments establerts prèviament65,66; Es van afegir 50 ul per pou de pèptids a plaques ELISA que estaven recobertes prèviament amb estreptavidina 1 ug/ml (Sigma-Aldrich). La saturació de la unió de pèptids es va aconseguir i es va confirmar mitjançant la quantificació dels llocs d'unió de biotina residuals a l'estreptavidina mitjançant biotina-HRP. seguit de bloqueig amb llet al 10 per cent i rentat amb PBS amb Tween al 0,05 per cent. La IgG policlonal de conill generada contra la regió NT de CSP es va afegir a cada pou a una concentració d'1:500. El nivell d'unió a IgG de conill es va detectar mitjançant IgG anti-conill de cabra conjugada amb HRP (Millipore, 1:2500) i es va quantificar mitjançant el substrat TMB.

Assaig d'unió al receptor Fc.

L'assaig d'unió al receptor Fc es va adaptar a partir de mètodes publicats anteriorment amb modificacions menors39. Breument, es van recobrir 5{{20}} ul de CSP recombinant a una concentració d'1 ug/ml a plaques Maxisorp ™ i es van incubar durant la nit a 4 graus, seguits de tres rentats amb PBS-Tween. A continuació, es van bloquejar les plaques amb 200 ul d'1 per cent de BSA-PBS a 37 graus durant 2 h seguits de tres rentats amb PBS-Tween. Les mostres de sèrum es van diluir a 1:50 en PBS-BSA i es van afegir 50 ul de cada mostra a les plaques per duplicat i es van incubar a temperatura ambient durant 2 h, seguits de tres rentats en PBS-Tween. Es van afegir cinquanta microlitres de dímers d'ectodomini Fc RIIa H131 solubles solubles conjugats amb biotina (0,2 ug/ml) o dímers d'ectodomini Fc RIII V158 (0,1 ug/ml) a cada pou i es van incubar a 37 graus durant 1 h seguit de tres rentats amb PBS. - Entre. Per a alguns assajos, es va utilitzar l'al·lel R131 de Fc RIIa i l'al·lel F158 de Fc RIII a la mateixa concentració. Això va ser seguit per una estreptavidina conjugada amb HRP secundària (Thermo Fisher Scientific, 1:10, 000) en PBS-BSA a 37 graus durant 1 h seguit de tres rentats amb PBS-Tween.

Finalment, es van afegir 50 ul de substrat líquid TMB durant 20 min per mesurar la reactivitat enzimàtica. La reacció es va aturar amb 50 ul de solució 1 M de H2SO4. El nivell d'unió es va mesurar com a densitat òptica a 450 nm. Es va utilitzar com a controls positius IgG humana agrupada d'adults kenyans exposats a la malària (1:100) i IgG policlonal de conill a CSP (1:500). Es van utilitzar sèrums individuals d'adults ingenus de Melbourne (1:50) com a controls negatius.

L'assaig d'unió al receptor Fc es va adaptar a partir de mètodes publicats anteriorment amb modificacions menors39. Breument, es van recobrir 5{{20}} ul de CSP recombinant a una concentració d'1 ug/ml a plaques Maxisorp ™ i es van incubar durant la nit a 4 graus, seguits de tres rentats amb PBS-Tween. A continuació, es van bloquejar les plaques amb 200 ul d'1 per cent de BSA-PBS a 37 graus durant 2 h seguits de tres rentats amb PBS-Tween. Les mostres de sèrum es van diluir a 1:50 en PBS-BSA i es van afegir 50 ul de cada mostra a les plaques per duplicat i es van incubar a temperatura ambient durant 2 h, seguits de tres rentats en PBS-Tween. Es van afegir cinquanta microlitres de dímers d'ectodomini Fc RIIa H131 solubles solubles conjugats amb biotina (0,2 ug/ml) o dímers d'ectodomini Fc RIII V158 (0,1 ug/ml) a cada pou i es van incubar a 37 graus durant 1 h seguit de tres rentats amb PBS. - Entre. Per a alguns assajos, es va utilitzar l'al·lel R131 de Fc RIIa i l'al·lel F158 de Fc RIII a la mateixa concentració. Això va ser seguit per una estreptavidina conjugada amb HRP secundària (Thermo Fisher Scientific, 1:10, 000) en PBS-BSA a 37 graus durant 1 h seguit de tres rentats amb PBS-Tween. Finalment, es van afegir 50 ul de substrat líquid TMB durant 20 min per mesurar la reactivitat enzimàtica. La reacció es va aturar amb 50 ul de solució 1 M de H2SO4. El nivell d'unió es va mesurar com a densitat òptica a 450 nm. Es va utilitzar com a controls positius IgG humana agrupada d'adults kenyans exposats a la malària (1:100) i IgG policlonal de conill a CSP (1:500). Es van utilitzar sèrums individuals d'adults ingenus de Melbourne (1:50) com a controls negatius.

Assaig de citotoxicitat mediada per cèl·lules dependents d'anticossos.

L'activitat induïdora de l'ADCC d'una selecció de mostres de sèrum es va avaluar mitjançant el kit ADCC Reporter Bioassay (Promega, núm. cat. G7010) segons les instruccions del fabricant, amb les modificacions següents. Les perles recobertes de CSP es van opsonitzar amb sèrum humà a una dilució 1:50. Les cèl·lules informadores es van xapar a 72,000 cèl·lules per pou juntament amb perles fluorescents recobertes de CSP en una proporció de 10:1. Després de 6 h d'incubació, es va afegir el substrat de quimioluminescència i es va detectar i quantificar la luminescència aproximadament cada 5 min durant 40 min (CLARIOstar, BMG LabTech). Les dades presentades es van registrar uns 30 minuts després de l'addició del substrat de quimioluminescència.

El nivell d'ADCC també es va confirmar en cèl·lules NK primàries mitjançant un mètode publicat anteriorment 38. Breument, es van cultivar PBMC que contenien cèl·lules NK en RPMI1640 suplementat amb un 10 per cent de FCS i 100 UI/ml d'interleucina-2 (IL{{5 }}) durant la nit. Les perles recobertes de CSP es van opsonitzar amb sèrum humà a una dilució 1:50, després es van cocultivar amb els PBMC imprimats en presència d'anti-CD107a-AF647 (H4A3, BD Bioscience) durant 1 h. Posteriorment, es van afegir brefeldina A (Sigma-Aldrich) i inhibidor del transport de proteïnes (BD Bioscience) al cocultiu a una concentració de 5 ug/ml i 1/1500, respectivament, i es van continuar incubant durant 3 h. Després de la incubació, les cèl·lules es van centrifugar a 300 × g durant 4 min a 4 graus i es van tacar amb anti-CD3-APC-H7 (SK7, BD Bioscience, 1:33), anti-CD56- PE-Cy7 (B159, BD Bioscience, 1:33) i anti-CD16-BV421 (3G8, BD Bioscience, 1:20). Les cèl·lules NK es van definir com a CD3-, CD56 més limfòcits i el nivell d'ADCC es va quantificar com el percentatge de cèl·lules NK amb tinció de CD107a per citometria de flux (LSR Fortessa X -20, BD Bioscience) (figura suplementària 9).

Anàlisi de dades.

Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant Prism versió 7 (GraphPad Software Inc) i STATA versió 13.1 (StataCorp). Les proves estadístiques i els valors P s'indiquen a les llegendes de les figures. Les correlacions entre la fagocitosi, la unió de Fc R i els nivells d'IgG es van avaluar mitjançant els coeficients de correlació de Spearman i models de regressió lineal múltiple. Les diferències en els nivells de fagocitosi, la unió de Fc R i els nivells d'IgG entre grups d'edat i diferents condicions d'opsonització es van avaluar mitjançant l'ANOVA unidireccional amb múltiples comparacions.

Per avaluar les activitats funcionals d'anticossos independentment del títol total d'IgG a CSP, es van calcular les eficiències d'unió de Fc R i de fagocitosi com el nivell d'unió de Fc R o el nivell de fagocitosi opsònica en relació amb la reactivitat d'IgG a CSP. La correlació de Spearman i la prova de Mann-Whitney es van utilitzar per analitzar les eficiències funcionals dels anticossos entre nens i adults. Es va utilitzar ANOVA bidireccional per comparar la fagocitosi opsònica per neutròfils i monòcits en els assaigs de leucòcits sencers. Es va realitzar la prova de Kruskal-Wallis i la prova de Mann-Whitney per a dades que no estaven distribuïdes normalment. Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar com a proves a dues cares. Les mostres es van classificar com a positives per a anticossos si la reactivitat era superior a la mitjana més 3 desviacions estàndard dels valors dels controls no exposats a la malària.

Resum de l'informe.

Hi ha més informació sobre el disseny de la investigació disponible al Resum d'informes de recerca sobre la natura enllaçat amb aquest article.

Disponibilitat de dades.

Les dades utilitzades per generar xifres estan disponibles als autors a petició. Les bases de dades analitzades en l'elaboració d'aquest article i presentades en xifres i taules estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable i pendent de l'acord dels comitès d'ètica pertinents (per a dades clíniques). Les seqüències de P. falciparum es van obtenir de la base de dades pública a PlasmoDB.org.

Rebut: 2 de setembre de 2019; Data d'acceptació: 24 de febrer de 2021.

Referències

1. Organització Mundial de la Salut. Informe Mundial de la Malària 2018 (Organització Mundial de la Salut, 2018).

2. Organització Mundial de la Salut, Full de ruta sobre la tecnologia de la vacuna contra la malària (Organització Mundial de la Salut, 2018).

3. Beeson, JG et al. Reptes i estratègies per desenvolupar vacunes contra la malària eficaços i de llarga durada. Ciència. Trad. Med. 11, eaau1458 (2019).

4. Cockburn, IA i Seder, RA Prevenció de la malària: des de conceptes immunològics fins a vacunes efectives i anticossos protectors. Nat. Immunol. 19, 1199–1211 (2018).

5. Choumet, V. et al. Visualització de l'alimentació de sang d'Anopheles gambiae no infecciosa i infecciosa en ratolins ingènus i immunitzats amb saliva. PLoS ONE 7, e50464 (2012).

6. Nussenzweig, V. & Nussenzweig, RS Proteïnes circumsporozoïtes dels paràsits de la malària. Cel·la 42, 401–403 (1985).

7. Associació, ECA Eficàcia i seguretat de la vacuna contra la malària RTS, S/AS01 amb o sense dosi de reforç en nadons i nens a Àfrica: resultats finals de la fase 3, assaig controlat aleatoritzat individualment. Lancet 386, 31–45 (2015).

8. Dups, JN, Pepper, M. & Cockburn, IA Respostes d'anticossos i cèl·lules B als esporozoïts de Plasmodium. Davant. Microbiol. 5, 625 (2014).

9. Dobano, C. et al. La concentració i l'avidesa d'anticossos contra diferents epítops circumsporozoits es correlacionen amb l'eficàcia de la vacuna contra la malària RTS, S/AS01E. Nat. Commun.

10, 2174 (2019). 10. Stewart, MJ, Nawrot, RJ, Schulman, S. i Vanderberg, JP La invasió d'esporozoits de Plasmodium berghei està bloquejada in vitro per anticossos immobilitzadors d'esporozoïts. Infectar. Immun. 51, 859–864 (1986).

11. Mishra, S., Nussenzweig, RS i Nussenzweig, V. Els anticossos de la proteïna circumsporozoite de Plasmodium (CSP) inhibeixen l'activitat de travessia cel·lular de l'esporozoit. J. Immunol. Mètodes 377, 47–52 (2012).

12. Triller, G. et al. L'exposició natural als paràsits indueix anticossos antipalúdics humans protectors. Immunitat 47, 1197–1209 e1110 (2017).

13. Hoffman, SL et al. Immunitat a la malària i anticossos adquirits de manera natural contra la proteïna circumsporozoite de Plasmodium falciparum. N. Anglès. J. Med. 315, 601–606 (1986).

14. Foquet, L. et al. Els anticossos monoclonals induïts per la vacuna dirigits a la proteïna circumsporozoite eviten la infecció per Plasmodium falciparum. J. Clin. Investig. 124, 140–144 (2014).

15. Przysiecki, C. et al. Anticossos neutralitzadors d'esporozoïts provocats en ratolins i macacs rhesus immunitzats amb un pèptid de repetició de Plasmodium falciparum conjugat al complex proteic de la membrana externa del meningocòc. Davant. Infecció cel·lular. Microbiol. 2, 146 (2012).

16. Flores-Garcia, Y. et al. La protecció mediada per anticossos contra els esporozoïts de plasmodi comença al lloc d'inoculació dèrmica. mBio 9, e02194–02118 (2018).

17. Aliprandini, E. et al. Els anticossos citotòxics anti-circumsporozoite es dirigeixen als esporozoits de la malària a la pell de l'hoste. Nat. Microbiol. 3, 1224–1233 (2018).

18. DiLillo, DJ, Tan, GS, Palese, P. & Ravetch, JV Els anticossos específics de la tija d'hemaglutinina que neutralitzen àmpliament requereixen interaccions FcgammaR per protegir-se del virus de la grip in vivo. Nat. Med. 20, 143–151 (2014).

19. Hessell, AJ et al. La unió del receptor Fc però no del complement és important en la protecció d'anticossos contra el VIH. Nature 449, 101–104 (2007).

20. Bournazos, S. et al. Els anticossos anti-VIH-1 de neutralització àmplia requereixen funcions efectores de Fc per a l'activitat in vivo. Cel·la 158, 1243–1253 (2014).

21. Mullarkey, CE et al. Els anticossos específics de la tija d'hemaglutinina que neutralitzen àmpliament indueixen una potent fagocitosi dels complexos immunitaris per part dels neutròfils de manera dependent de Fc. mBio 7, e01624–01616 (2016).

22. Irani, V. et al. Propietats moleculars de les subclasses d'IgG humanes i les seves implicacions per al disseny d'anticossos monoclonals terapèutics contra malalties infeccioses. Mol. Immunol. 67, 171–182 (2015). 23. Nauseef, WM i Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15, 602–611 (2014).

24. Kolaczkowska, E. i Kubes, P. Reclutament i funció de neutròfils en salut i inflamació. Nat. Reverent Immunol. 13, 159–175 (2013).

25. Gordon, S. Fagocitosi: un procés immunològic. Immunitat 44, 463–475 (2016).

26. Scapini, P. & Cassatella, MA Xarxes socials de neutròfils humans dins del sistema immunitari. Sang 124, 710–719 (2014).

27. Dale, DC, Boxer, L. & Liles, WC Els fagòcits: neutròfils i monòcits. Blood 112, 935–945 (2008).

28. Ziegler-Heitbrock, L. et al. Nomenclatura de monòcits i cèl·lules dendrítiques a la sang. Sang 116, e74–e80 (2010).

29. Rosales, C. Heterogeneïtat del receptor Fcgamma en les respostes funcionals dels leucòcits. Davant. Immunol. 8, 280 (2017).

30. Golay, J. et al. Els neutròfils humans expressen nivells baixos de FcgammaRIIIA, que té un paper en l'activació de PMN. Sang 133, 1395–1405 (2019).

31. Steel, RW et al. Un assaig de fagocitosi opsònica per als esporozoïts de Plasmodium falciparum. Clin. Vacuna Immunol. 24, e00445–00416 (2017).

32. Osier, FH et al. Fagocitosi opsònica dels merozoïts de Plasmodium falciparum: mecanisme en la immunitat humana i un correlat de protecció contra la malària. BMC Med. 12, 108 (2014).

33. Kurtovic, L. et al. Els anticossos humans activen el complement contra els esporozoïts de Plasmodium falciparum i s'associen amb la protecció contra la malària en nens. BMC Med. 16, 61 (2018).

34. Tan, J. et al. Un llinatge d'anticossos públics que inhibeix potentment la infecció per malària mitjançant la doble unió a la proteïna circumsporozoite. Nat. Med. 24, 401–407 (2018).

35. Kerntke, C., Nimmerjahn, F. i Biburger, M. Hi ha força (científica) en els números: una quantificació completa dels números de receptors gamma Fc en leucòcits de sang perifèrica humana i murina. Davant. Immunol. 11, 118 (2020).

36. Fleit, HB i Kobasiuk, CD La línia cel·lular semblant a monòcits humans THP-1 expressa Fc gamma RI i Fc gamma RII. J. Leukoc. Biol. 49, 556–565 (1991).

37. Ulfman, LH, Leusen, JHW, Savelkoul, HFJ, Warner, JO i van Neerven, RJJ Efectes de les immunoglobulines bovines sobre la funció immune, l'al·lèrgia i la infecció. Davant. Nutr. 5, 52 (2018).

38. Lichtfuss, GF et al. El VIH inhibeix els esdeveniments de transducció de senyal primerencs provocats per la reticulació de CD16 a les cèl·lules NK, que són importants per a la citotoxicitat cel·lular depenent dels anticossos. J. Leukoc. Biol. 89, 149–158 (2011).

39. Vins, BD et al. Ectodominis dimèrics FcgammaR com a sondes de la funció del receptor Fc del virus antigripal IgG. J. Immunol. 197, 1507–1516 (2016).

40. Li, X., Gibson, AW i Kimberly, RP Polimorfisme i malaltia de la FcR humana. Curr. Superior. Microbiol. Immunol. 382, 275–302 (2014).

41. Munde, EO et al. Associació entre els polimorfismes genètics del receptor Fcgamma IIA, IIIA i IIIB i la susceptibilitat a l'anèmia greu de malària en nens de l'oest de Kenya. BMC Infect. Dis. 17, 289 (2017).

42. Chelimo, K. et al. Diferències relacionades amb l'edat en la memòria de cèl·lules T adquirides de manera natural amb la proteïna de superfície 1 del merozoït de Plasmodium falciparum. PLoS ONE 6, e24852 (2011).

43. Kurtovic, L. et al. Els anticossos multifuncionals són induïts per la vacuna contra la malària RTS, S i s'associen amb protecció en assaigs de fase I/IIa. J. Infectar. Dis, jiaa144 (2020). 44. Abel, AM, Yang, C., Thakar, MS i Malarkannan, S. Cèl·lules assassines naturals: desenvolupament, maduració i utilització clínica. Davant. Immunol. 9, 1869 (2018).

45. Chaudhury, S. et al. La funció biològica dels anticossos induïts pel candidat a la vacuna contra la malària RTS, S/AS01 està determinada per la seva especificitat fina. Malar. J. 15, 301 (2016).

46. ​​Collins, KA, Snaith, R., Cottingham, MG, Gilbert, SC i Hill, AVS Millora de la immunitat protectora contra la malària amb una vacuna de partícules similars a virus altament immunogènica. Ciència. Rep 7, 46621 (2017).

47. Coppi, A., Pinzon-Ortiz, C., Hutter, C. i Sinnis, P. La proteïna circumsporozoite de Plasmodium es processa proteolíticament durant la invasió cel·lular. J. Exp. Med. 201, 27–33 (2005).

48. Coppi, A. et al. La proteïna circumsporozoite de la malària té dos dominis funcionals, cadascun amb funcions diferents a mesura que els esporozoïts viatgen d'un mosquit a un hoste mamífer. J. Exp. Med. 208, 341–356 (2011).

49. John, CC et al. Correlació d'alts nivells d'anticossos amb múltiples antígens preeritrocítics de Plasmodium falciparum i protecció de la infecció. Am. J. Trop. Med Hyg. 73, 222–228 (2005).

50. Tran, TM et al. Un estudi de cohort longitudinal intensiu de nens i adults malians no revela cap evidència d'immunitat adquirida a la infecció per Plasmodium falciparum. Clin. Infectar. Dis. 57, 40–47 (2013).

51. Epstein, JE et al. Protecció contra la malària de Plasmodium falciparum mitjançant la vacuna PfSPZ. JCI Insight 2, e89154 (2017).

52. Sack, BK et al. Protecció humoral contra la infecció per Plasmodium falciparum transmesa per picada de mosquit en ratolins humanitzats. Vacunes NPJ 2, 27 (2017).

53. Stoute, JA et al. Una avaluació preliminar d'una vacuna recombinant de proteïnes circumsporozoite contra la malària Plasmodium falciparum. RTS, S Grup d'Avaluació de la Vacuna contra la Malària. N. Anglès. J. Med. 336, 86–91 (1997).

54. Kester, KE et al. Eficàcia dels règims de vacuna de proteïnes recombinants circumsporozoite contra la malària experimental Plasmodium falciparum. J. Infectar. Dis. 183, 640–647 (2001).

55. Kester, KE et al. Assaig de fase 2a dels programes d'immunització de 0, 1 i 3 mesos i 0, 7 i 28-dies de la vacuna contra la malària RTS, S/AS02 en adults sense malària al Walter Reed Institut de Recerca de l'Exèrcit. Vacuna 26, 2191–2202 (2008).

56. Kester, KE et al. Assaig de fase 2a, aleatoritzat, doble cec, de vacunes contra la malària de falciparum RTS, S/AS01B i RTS, S/AS02A en adults sense malària: seguretat, eficàcia i associacions immunològiques de protecció. J. Infectar. Dis. 200, 337–346 (2009).

57. Lux, A., Yu, X., Scanlan, CN i Nimmerjahn, F. Impacte de la mida del complex immune i la glicosilació en la unió d'IgG a FcgammaRs humans. J. Immunol. 190, 4315–4323 (2013).

58. Nesspor, TC, Raju, TS, Chin, CN, Vafa, O. & Brezski, RJ L'avidity confereix la unió de FcgammaR i la funció efectora immune a la immunoglobulina G1 glicosilada. J. Mol. Reconèixer. 25, 147–154 (2012).

59. Dent, AE et al. Estabilitat temporal de la immunitat adquirida de manera natural a la proteïna superficial del merozoït-1 en adults kenyans. Malar. J. 8, 162 (2009).

60. John, CC et al. Anticossos contra antígens preeritrocítics de Plasmodium falciparum i risc de malària clínica en nens kenyans. J. Infectar. Dis. 197, 519–526 (2008).

61. Zavala, F. et al. La justificació per al desenvolupament d'una vacuna sintètica contra la malària Plasmodium falciparum. Science 228, 1436–1440 (1985).

62. Arduin, E. et al. Unió molt reduïda als receptors gamma Fc del ratolí d'alta i baixa afinitat per mutacions L234A/L235A i N297A Fc dissenyades en IgG2a del ratolí. Mol. Immunol. 63, 456–463 (2015).

63. Quinn, MT, DeLeo, FR i Bokoch, GM a Methods Mol Biol, vol. 412 (ed. Quinn, MT) 13–18 (Springer Science plus Business Media, Springer Nova York Heidelberg Dordrecht Londres, 2007).

64. Maueroder, C. et al. La capacitat dels neutròfils per formar NET no està directament influenciada per un pèptid dirigit a CMA. Davant. Immunol. 8, 16 (2017).

65. Feng, G. et al. La immunització humana amb un candidat a la vacuna de la malària polimòrfica va induir anticossos contra epítops conservats que promouen anticossos funcionals contra múltiples soques de paràsits. J. Infectar. Dis. 218, 35–43 (2018).

66. Boyle, MJ et al. Els anticossos humans fixen el complement per inhibir la invasió dels eritròcits de Plasmodium falciparum i s'associen amb la protecció contra la malària. Immunitat 42, 580–590 (2015).

Agraïments

Donem les gràcies als participants de l'estudi i al personal de l'Institut d'Investigació Mèdica de Kenya per les mostres de la cohort Chulaimbo i les cohorts Kanyawegi. Els esporozoïts de P. falciparum i el mAb 2H8 van ser amablement proporcionats per PATH Malaria Vaccine Initiative (MVI). El mAb 3D11 i l'hibridoma van ser amablement proporcionats per Miguel Prudêncio de l'Instituto de Medicina Molecular. Els paràsits de P. berghei que expressaven P. falciparum CSP van ser proporcionats per Chris Janse, Shahid Khan i Hans Kroeze del Centre Mèdic de la Universitat de Leiden. L'acoblament covalent de l'antigen a les perles fluorescents va ser molt recolzat per Paul Ramsland de RMIT, Paul Sanders del Burnet Institute i Geoffrey Pietersz del Baker Heart and Diabetes Institute.

També agraïm a Michelle Wong del Burnet Institute per ser la nostra flebotomista i a Emily Locke per la seva ajuda i els seus consells. Aquest estudi també va comptar amb el suport de la instal·lació bàsica de citometria de flux AMREP. Aquest treball va comptar amb el suport del National Health and Medical Research Council (NHMRC) d'Austràlia (Program Grant i Senior Research Fellowship a JG Beeson; Project Grants a JGB, GI McFadden i PM Hogarth; Career Development Fellowship a MJB), PATH-MVI (subvenció a JGB), Fundació CASS (subvenció a GF), beca premiada del Consell de Recerca d'Austràlia a GI McFadden i NIH International Centers for Excellence in Malaria Research (U19AI129326). El Burnet Institute compta amb el suport de l'NHMRC for Independent Research Institutes Infrastructure Support Scheme i el Victorian State Government Operational Infrastructure Support. JGB, GF, MJB, JAC, SC i LK són membres del NHMRC Australian Center for Research Excellence in Malaria Elimination.

Aportacions dels autors

JGB, GF i BDW van liderar el disseny de l'estudi amb aportacions de PMH, GIM, LK, JAC i altres autors; GF, BDW, LK, PB, DML, SC, VM i AC van realitzar experiments i van interpretar els resultats; GF, PB i JAC van realitzar anàlisis de dades amb aportacions de JGB, LK i MJB; JGB, BDW, PMH, JWK, AED, KC, GIM, AC, VM, DRD i RJC han proporcionat o generat reactius, dades i/o recursos clau; GF, JGB, LK, JAC i DRD van contribuir a la preparació del paper amb la contribució de tots els altres coautors.

Interessos competitius

Els autors no declaren interessos en competència.

Informació de revisió per iguals

Nature Communications agraeix a Katie Ewer, Photini Sinnis i als altres revisors anònims per la seva contribució a la revisió per parells d'aquest treball. Els informes de revisors per parells estan disponibles.

Nota de l'editor

Springer Nature es manté neutral sobre les reclamacions jurisdiccionals en mapes publicats i afiliacions institucionals.

Accés Obert

Aquest article té una llicència Creative Commons Attribution 4.0 International License, que permet l'ús, la compartició, l'adaptació, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà o format, sempre que doneu el crèdit adequat als autors originals. ) i la font, proporcioneu un enllaç a la llicència Creative Commons i indiqueu si s'han fet canvis. Les imatges o altres materials de tercers d'aquest article s'inclouen a la llicència Creative Commons de l'article tret que s'indiqui el contrari en una línia de crèdit del material. Si el material no està inclòs a la llicència de Creative Commons de l'article i el vostre ús previst no està permès per la normativa legal o supera l'ús permès, haureu d'obtenir el permís directament del titular dels drets d'autor. Per veure una còpia d'aquesta llicència, visiteu http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

 For more information:1950477648nn@gmail.com