La metaanàlisi dels resultats de quantificació de NAD(P)(H) mostra variabilitat entre teixits de mamífers
Jun 01, 2023
La nicotinamida adenina dinucleòtid (NAD plus) té un paper important en el metabolisme energètic i les vies de senyalització que controlen les funcions cel·lulars crucials. Elaugment de l'interès en el NAD més el metabolismeiNAD plus teràpies potenciadoresha reforçat la necessitat de la quantificació NAD més precisa. Per examinar les mesures de NAD (P) (H) publicades a través dels teixits de mamífers, vam realitzar ametaanàlisi de les dades existents. Una cerca a la base de dades Ovid MEDLINE va identificar articles amb resultats de quantificació de NAD(P)(H) obtinguts a partir de teixits de mamífers publicats entre 1961 i 2021. Vam examinar 4890 registres i vam extreure dades quantitatives, així com elmètodes de quantificació, condicions preanalíticas i característiques del subjecte. Les concentracions fisiològiques de NAD(P)(H) extretes ateixits diversosde ratolins, rates i humans, va revelar una important variabilitat inter i intra-mètode que es va estendre a publicacions recents. Això posa de manifest el potencial relativament baix d'anàlisis experimentals creuades per a dades quantitatives de NAD(P)(H) i la importància de l'estandardització per als mètodes de quantificació de NAD(P)(H) iprocediments pre-analíticsper al futur preclínic iestudis clínics.
Feu clic aquí per obtenir propietats anti-oxidació i productes anti-envelliment de Cistanche
La nicotinamida adenina dinucleòtid té un doble paper com areducció-oxidació (redox)coenzim, en la seva oxidació (NAD(P) més ) iformes reduïdes (NAD(P)H)., i com acosubstrat (NAD(P) més ) per als enzims implicats en la desacilació1, mono i poli-ADP-ribosilació2,3 i la creació de segon missatgers basats en adenina4–7. La relació NAD(P) més /NAD(P)H és un indicador important de l'estat redox intracel·lular i té un paper crític en la regulació de les vies metabòliques clau8,9. Per exemple, el NAD plus és essencial per a la glucòlisi, juntament amb el cicle de l'àcid tricarboxílic (TCA), per proporcionar equivalents reductors durant la generació d'adenosina trifosfat (ATP), la principal font d'energia per a la cèl·lula8,9. Quan el NAD plus està limitat, també es pot regenerar a partir del NADH mitjançant la fermentació de piruvat per produir lactat a les cèl·lules dels mamífers, mantenint així l'equilibri redox cel·lular25. NAD plus i NADH també es poden fosforilar a NADP i NADPH, respectivament, per NAD més quinases (NADKs)10,11. El NADPH és essencial per a la biosíntesi reductiva, la transducció del senyal, les respostes antioxidants cel·lulars i, en particular, la reducció del glutatió12–14. Al citosol, el NADP plus es redueix a NADPH per la glucosa-6-fosfat deshidrogenasa i la 6-fosfogluconat deshidrogenasa de la via de la pentosa fosfat (PPP), entre altres reaccions13. Mentre que als mitocondris, la producció de NADPH es manté per diverses reaccions, incloses les que depenen de l'activitat enzimàtica de la nicotinamida nucleòtid transhidrogenasa (NNT) i les isocitrat deshidrogenases (IDH2). Com a resultat, s'ha demostrat que l'estat de NAD (P) (H) afecta la senyalització i el metabolisme cel·lular, l'homeòstasi energètica, la biogènesi mitocondrial, les respostes a l'estrès oxidatiu i el manteniment i reparació de l'ADN16–18. A més, des de la progressió de les malalties relacionades amb l'edat, com l'obesitat19, la malaltia hepàtica grasa no alcohòlica20,21, la neurodegeneració22, les malalties mitocondrials23 i cardiovasculars24 i l'atròfia o distròfia muscular25, s'ha relacionat amb alteracions en els metabòlits relacionats amb NAD més, enfocaments. adreçats a mantenir la NAD més l'homeòstasi estan actualment en investigació.
Més enllà de les transicions redox comunes, el NADP plus es pot consumir intercanviant el seu grup nicotinamida amb àcid nicotínic en una reacció catalitzada per cADPR sintasis, com CD38, per formar el segon missatger NAADP, que està implicat en la mobilització de calci, la secreció d'hormones i la cèl·lula immune. proliferació6,7,26. NAD plus també es pot consumir quan actua com a cosubstrat per formar nicotinamida (NAM), que es pot utilitzar com a substrat per regenerar NAD plus mitjançant la via de salvament de NAM. El NAM també es pot metilar per formar 1-metil NAM (meNAM), que es pot oxidar encara més als productes de degradació N{1-metil{-2-piridona{-5-carboxamida (2py) i N1-metil-4-piridona-3-carboxamida (4py). En última instància, els catabòlits metilats es poden eliminar del cos mitjançant l'orina27,28. El conjunt de NAD plus també es pot reduir mitjançant el consum de NADP plus mitjançant una reacció d'intercanvi de bases per a la formació del segon missatger NAADP14. Mantenir el conjunt de NAD plus, per tant, requereix la biosíntesi mitjançant la via Preiss-Handler (començant per la molècula comuna de vitamina B3 niacina (NA; àcid nicotínic)), la via de biosíntesi de novo (començant amb l'aminoàcid triptòfan (Trp)) o regeneració a partir de la conversió de NAM a través de la via de salvament a NMN i després a NAD plus. Finalment, la via de salvament també és important per a la biosíntesi de NAD plus a partir de la nicotinamida ribòsid (NR), una forma alternativa de vitamina B3 que es troba en els aliments, després de la seva fosforilació per la nicotinamida ribósid quinasa a NMN i després la conversió a NAD plus mitjançant la via de salvament. .
Per tant, la comprensió de la dinàmica del metaboloma NAD més s'ha convertit en essencial i, en última instància, requereix una quantificació rigorosa dels metabòlits per entendre millor el fix dels metabolomes de NAD més durant la fisiologia normal, o amb la progressió de la malaltia o l'envelliment saludable. Una imatge clara d'aquests canvis és essencial per vincular les alteracions del NAD més el metaboloma amb reaccions enzimàtiques o redox aigües avall, que són la clau dels canvis en els fenotips dels teixits. Atesa la quantitat substancial de dades quantitatives informades anteriorment sobre NAD més metabòlits en mamífers, inclòs un nombre creixent d'informes en humans, és essencial i oportú resumir aquests canvis durant la salut i la malaltia. Nombrosos estudis han examinat components del NAD més el metaboloma en rosegadors i humans en diferents estats metabòlics, edats i malalties, però es basen en diferents mètodes per a la preparació o quantificació de mostres. La preparació de la mostra és important per als metabòlits implicats en reaccions redox a causa de la possible degradació i interconversions en determinades condicions29,30. Per a la quantificació, es creu que la cromatografia líquida acoblada a l'espectrometria de masses (LC-MS) i l'espectrometria de ressonància magnètica (MRS) són mètodes sensibles i específics31–33, mentre que els assaigs de ciclisme enzimàtic són els més comuns. Els mètodes quantitatius de LC-MS requereixen una inclusió integral de controls de qualitat per als metabòlits individuals que es mesuren i per a l'efecte de matriu global de les mostres, un efecte que explica les diferents respostes espectromètriques de masses per a un analit determinat quan es mesuren en diferents solucions. Sense aquests controls, LC-MS és, en el millor dels casos, semiquantitatiu. En aquest estudi, hem identificat una variabilitat considerable en les mesures de NAD (P) (H) en estudis sobre rosegadors i humans, posant èmfasi en la necessitat de mètodes adequats d'informe i protocols analítics i processament de mostres estandarditzats. En general, es necessiten conjunts de dades NAD (P) (H) comparables entre els estudis per a una interpretació significativa de les dades existents i futures en el camp de la NAD més la biologia.
Resultats
Metaanàlisi dels mètodes de quantificació comuns, juntament amb les espècies, el sexe i els teixits estudiats.
Històricament, els primers mètodes utilitzats per a la quantificació de NAD(P)(H) es basaven en les propietats espectrofotomètriques o fluoromètriques d'aquests metabòlits34,35. Més recentment, els mètodes de ciclisme enzimàtic acoblats a la detecció espectrofotomètrica o fluoromètrica s'utilitzen més habitualment per distingir els nivells de coenzim NAD(P)(H)36–38. La creixent necessitat d'una alta sensibilitat i resolució en la quantificació d'aquests coenzims, juntament amb la necessitat de mesurar altres metabòlits relacionats amb NAD plus, va portar a l'ús de tècniques de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) i LC-MS. D'aquests enfocaments, LC-MS s'ha convertit en el mètode preferit, ja que l'espectrometria de masses combinada amb la cromatografia líquida permet la identificació específica dels compostos eluïts juntament amb el benefici afegit d'incloure metabòlits d'isòtops NAD (P) (H) com a qualitat interna d'augment. controls. Malgrat els seus avantatges respecte als assaigs espectrofotomètrics o fluoromètrics clàssics, HPLC i LC-MS continuen sent cars i requereixen temps, cosa que explica per què els assajos de ciclisme enzimàtic persisteixen en estudis recents.
Mitjançant un enfocament sistemàtic, dels 241 estudis elegibles (material suplementari 2), es van seleccionar 205 estudis que incloïen una metaanàlisi quantitativa de les concentracions de NAD (P) (H) en teixits de ratolí, rata i humans per a una anàlisi posterior. D'aquests estudis, el 46,7% va utilitzar assajos de ciclisme enzimàtic, dels quals incloïa detecció colorimètrica (40,9%) o fluoromètrica (5,8%), mentre que el 17,8% va utilitzar mètodes HPLC (acoblat amb detectors d'UV o fluorescència) i el 13,2% va utilitzar assajos LC-MS ( Fig. 1a). La majoria dels estudis no van incloure una descripció detallada dels procediments d'extracció de metabòlits. Tanmateix, els procediments d'extracció utilitzats habitualment consistien en tampons d'extracció amb o sense tensioactius (Triton®, Tris, bromur de Dodecil trimetilamoni) o dissolvents orgànics polars com acetonitril, metanol, etanol o cloroform. Estudis anteriors han demostrat que la inactivació de l'enzim i les condicions òptimes de pH i temperatura eren eficients per preservar l'estabilitat de les diferents formes de NAD(P)(H)30,39,40. Quan es van divulgar, les mostres es van processar en condicions de baixa temperatura i no es va mencionar cap additiu redox als estudis inclosos. Les reaccions redox estaven limitades per la inactivació dels enzims a les mostres abans de les mesures dels metabòlits NAD(P)(H), normalment per precipitació amb dissolvents com etanol, metanol, acetonitril o àcid perclòric (PCA). Tanmateix, l'ús de PCA era rar a causa de la naturalesa àcid-làbil de les formes reduïdes (és a dir, NADH i NADPH), així com la necessitat d'un pas de neutralització addicional. Entre els estudis que van informar de l'ús de PCA durant l'extracció del metabòlit (5,4 per cent), el 3,7 per cent va informar només de NAD(P) més resultats o va utilitzar un segon mètode d'extracció no àcid per a la quantificació adequada de NAD(P)H. Només l'1,7 per cent dels estudis van informar resultats de NADH, NAD(H) total i/o NAD més /NADH utilitzant només l'extracció de PCA. El biaix potencial d'aquests estudis no es va poder analitzar a causa de les dades limitades.
Comparacions dels nivells fisiològics mitjans de NAD (P) (H) a través dels teixits per a rosegadors i humans.
Per ajudar a identificar els nivells de NAD (P) (H) fisiològics que s'esperaven per als teixits de ratolí, rates i humans més estudiats, vam recopilar dades de totes les cohorts de control i de tipus salvatge de cadascun dels estudis inclosos (material suplementari 2). ). Concretament, vam registrar els nivells mitjans de NAD(P)(H) normalitzats al pes del teixit o, en el cas de la sang, al volum. Les dades dels estudis que van normalitzar els nivells de metabòlits al contingut de proteïnes es van incloure al nostre conjunt de dades compilat (Material suplementari 2), però no es van utilitzar per a una anàlisi posterior donat el baix nombre de resultats reportats. A més, quan és possible, vam calcular les relacions NAD(P) més /NAD(P)H, com a reflex de l'estat redox, així com els nivells totals de NAD(P)(H) (NAD(P) més NAD). (P)(H)), que són sortides d'informes habituals per a les correccions de NAD(P)(H). Les dades extretes també incloïen l'espècie, les soques, l'edat, el sexe, el mètode de quantificació, la dieta i el programa d'alimentació, el tipus de mostra, el mètode de recollida de la mostra i el moment de la collita (pre o post mortem).
La metaanàlisi de les dades de NAD(H) va identificar les concentracions fisiològiques mitjanes de NAD plus i NADH en teixits de ratolí (Fig. 2a, b, figura suplementària 1a, b) i de rata (figura suplementària 2a, b) d'animals. menors de 14 mesos per als ratolins i 18 mesos per a les rates. El rang extret de valors fisiològics de relació NAD més / NADH i els nivells totals de NAD (H) (NAD més més NADH) es van representar per a ratolins (Fig. 2c, d) i rates (Fig. 2c, d suplementària). A diferència dels estudis amb ratolins, la majoria de les dades de rates informades no incloïen l'edat dels animals; tanmateix, vam optar per incloure aquestes dades sempre que l'estudi no classificés les seves cohorts com a edats. Dels teixits més estudiats, aquesta metaanàlisi mostra que el nivell mitjà de NAD més per al fetge (596 nmol/g, n=26) és més alt que tots els altres teixits dels ratolins, mentre que sorprenentment el múscul esquelètic (162,8 nmol). /g, n=9) presenta un dels valors mitjans més baixos per gram de teixit (figura 2a). Aquests resultats poden implicar una eficiència reduïda en l'extracció de NAD més metabòlits, a causa de la naturalesa altament fibrosa del múscul o que hi ha diferències importants en NAD muscular més metabolisme en comparació amb altres teixits altament metabòlics, com el fetge i el ronyó.
Malgrat pocs estudis quantitatius d'envelliment, els nivells de NAD més de ratolins vells es van reduir de mitjana al fetge, músculs i epiteli pigmentat de la retina (RPE), en comparació amb les seves cohorts joves, i en comparació amb la mitjana de tots els estudis realitzats amb ratolins més joves. de més de 14 mesos (figura suplementària 3). No va ser possible una metaanàlisi del NADH i la relació NAD més /NADH en animals envellits, ja que només un d'aquests estudis quantitatius va realitzar aquestes mesures.
Aquestes dades demostren la manca de dades quantitatives de NAD(H) en animals envellits.
Per a les dades recuperades d'estudis amb humans sans, els intervals d'edat variaven molt entre els estudis (de 15 a 92,3 anys) i en la majoria dels casos, les dades no estaven estratificades entre aquestes edats. Els teixits humans mesurats amb més freqüència incloïen el múscul esquelètic i els components de la sang, a causa de la seva naturalesa menys invasiva de recollida (Fig. 3a-d). Els resultats d'altres teixits humans (n= 1–2) es mostren a la figura suplementària 4. Aquesta anàlisi va mostrar una NAD mitjana més una concentració de 44,62 nmol/ml (n=23) a la sang sencera, amb similars Les concentracions de NAD més informades per als glòbuls vermells a 46, 96 nmol/ml (n=7) (Fig. 3a; Taula suplementària 1). Tanmateix, els nivells de NAD més en plasma sanguini van ser substancialment més baixos amb una mediana de 0,37 nmol/ml (n=8) (figura 3a). La mitjana de NAD més els nivells trobats en el múscul esquelètic dels humans va ser de 191,9 (n=4) nmol/g en preparacions de múscul humit enfront de 1713 (n=3) nmol/g en preparacions liofilitzades, una temperatura baixa. procés de deshidratació que probablement concentra els metabòlits (Fig. 3a). En els teixits més investigats per a les mesures de NADH, els nivells mitjans de glòbuls vermells humans, plasma i múscul esquelètic liofilitzat eren d'1,75 nmol/ml (n =7), 0,39 nmol/ml (n=8) i 136,8 nmol/g (n=6), respectivament (figura 3b). Les proporcions mitjanes NAD més /NADH corresponents eren 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) i 12,7 (n{=3) (figura 3c). Curiosament, la proporció mediana de NAD més / NADH per als glòbuls vermells (23, 65) i el múscul esquelètic liofilitzat (12, 7) (Fig. 3c) va ser diverses vegades més gran que la majoria dels teixits de ratolí i rata (Fig. 2c i Fig. 2c suplementària). , que indica un estat redox altament oxidatiu amb una abundància de NAD plus disponible en aquests teixits humans. En el cas del teixit muscular, això podria tenir implicacions en considerar el potencial translacional dels estudis sobre rosegadors que han identificat els beneficis d'augmentar els nivells de NAD més en el múscul. Tanmateix, una proporció elevada de NAD més /NADH al múscul també pot ser el resultat de procediments de congelació de mostres retardats en un entorn clínic, que pot provocar canvis no fisiològics en l'estat redox de la mostra.
Es van recopilar els nivells fisiològics de NADP(H) en teixits de rosegadors, sent la mesura més comuna al fetge. El fetge de ratolí presentava un valor mitjà de 124,2 nmol/g de NADP més (n=13) i 140,2 nmol/g de NADPH (n=4) (Fig. 4a,b). ), mentre que el fetge de rata va mostrar una mitjana de 95, 11 nmol/g de NADP més (n=10) i 240, 7 nmol/g de NADPH (n=9) (figura suplementària 5a, b). La relació mediana de NADP més / NADPH, derivada d'estudis que van mesurar ambdós metabòlits, era inferior a 1 a la majoria dels teixits de ratolí i rata (figura 4c, figura suplementària 5c). La mitjana dels nivells totals de NADP (H) (NADP més més NADPH) al fetge de ratolí i rata va ser de 244,4 (n=3) (Fig. 4d) i 342,1 (n=9) (Fig. 5d suplementària) , respectivament. En humans, les mesures més habituals de NADP(H) es van realitzar en glòbuls vermells mostrant una mediana de 33,2 nmol/ml per a NADP més (n=14) i 22,4 nmol/ml per a NADPH (n{{30}). }) d'estudis no coincidents, amb una relació mediana de NADP més /NADPH d'1,27 i una mediana de NADP(H) total de 52,0 nmol/ml d'estudis que van mesurar ambdós metabòlits (n=11) (Fig. 4e–). h). En general, la quantitat de dades disponibles per a NADP (H) és escassa en totes les espècies, cosa que fa que la confiança en els valors mitjans de cada teixit sigui menor.
Anàlisi de biaix i variabilitat en els mètodes de quantificació de NAD(P)(H).
Atès que la majoria dels estudis inclosos en aquesta metaanàlisi van examinar els nivells de NAD més en mostres de fetge de rosegadors (Fig. 1c, e), vam utilitzar nivells fisiològics de NAD plus de fetge de ratolí i de rata per identificar qualsevol biaix potencial en els resultats que corresponguin. al mètode de quantificació (Fig. 5a,b). L'edat mitjana dels ratolins inclosos en aquesta anàlisi va ser de 17, 9 setmanes (rang: 2-55 setmanes), amb 6 estudis que no van revelar l'edat dels animals. Per a les rates, la majoria dels estudis no van revelar l'edat dels animals, excepte tres que oscil·laven entre 2 dies i 8 mesos. Cap dels estudis va informar de l'ús d'animals vells. En el fetge de ratolí, l'ampli rang de les concentracions informades de NAD més va abastar d'1,8 a 1132 nmol/g de fetge amb un valor mitjà de 596. 0 (n=26) (Fig. 5a) , mentre que les concentracions de NADH oscil·laven entre 0,9 i 109 nmol/g de teixit amb un valor mitjà de 66,43 (n=6) (figura suplementària 6a). És important destacar que es va calcular un coeficient de variació del 52, 5 per cent i del 76, 5 per cent per als resultats fisiològics mitjans de NAD plus i NADH al fetge de ratolí, respectivament, mesurats per múltiples mètodes de quantificació, que mostren l'abast de la variabilitat entre els estudis. Tal com es va predir a partir d'aquests resultats, la proporció mitjana de NAD més /NADH al fetge del ratolí (3,41 més /- 3,16 SD, n=19) va demostrar un rang de variabilitat igualment gran amb un CV del 92,7 per cent (figura suplementària 6c) . També es va observar una variabilitat similar en les mesures de NAD plus i NADH al fetge de rata (CV=42,6% per a NAD plus i CV=44,4% per NADH). Les concentracions corresponents de NAD plus i NADH al fetge de rata van oscil·lar entre 159 i 796 (n=16) i 65 i 265 (n=12) nmol/g, respectivament (figura 5b, figura suplementària 6b). ), mentre que les proporcions NAD més /NADH presentaven un CV del 50,1 per cent (mitjana: 3,219 més /- 1,612 SD, n{=23) (figura suplementària 6d). Els valors mitjans i les desviacions estàndard de NAD més, NADH, NAD(H) total i les dades de relació NAD més /NADH al fetge de ratolí i rata, agrupats pel mètode de quantificació, es mostren a la taula complementària 2. Pel que fa als nivells de NADP (H) i la relació NADP plus / NADPH, es va observar una variabilitat similar en els teixits hepàtics. Els nivells de NADP més van oscil·lar entre 50,4 i 247,4 nmol/g de teixit per a ratolins (figura suplementària 8a) i de 45,7 a 171 nmol/g de teixit per a rates (figura suplementària 8b), mentre que els nivells de NADPH oscil·lava entre 28 i 236, 9 nmol/g de teixit per a ratolins (figura suplementària 8c) i de 90 a 409 nmol/g de teixit per a rates (figura suplementària 8d). Finalment, la relació NADP més / NADPH va oscil·lar entre 0,12 i 0,55 al fetge de ratolí (figura suplementària 8e) i de 0,12 a 1,44 al fetge de rata (figura suplementària 8f).
en el rang més gran de resultats (1,8 a 1132,3 nmol/g). Fins i tot els estudis LC-MS més recents examinats van exemplificar l'interval d'aquests valors NAD més, inclosos valors d'1,8 nmol/g41 i 33,8 nmol/g42 i valors molt més alts de 946,3 nmol/g43 i 1132,3 nmol/g44. A més, l'ampli ventall de valors LC-MS NAD més no semblava correlacionar-se amb estudis que exclouen estàndards interns marcats amb isòtops (Fig. 5a), un mètode utilitzat per millorar la identificació del metabòlit i la precisió del valor quantificat. . Tanmateix, els dos estudis LC-MS identificats que es basaven únicament en una corba estàndard externa per a NAD més quantificació, en lloc d'incloure un control intern, eren de mitjana inferiors a la mitjana de totes les mesures (Fig. 5a). A més, els estudis que van utilitzar la normalització d'estàndards interns van utilitzar diferents tipus d'estàndards interns, com ara la inclusió d'un únic metabòlit de referència marcat45,46 o extractes de metabòlits marcats de llevat43,44 o cultius cel·lulars41. Curiosament, aquests estudis que van utilitzar estàndards derivats d'extractes de llevats o cultius cel·lulars van proporcionar les mesures més altes o més baixes derivades de LC-MS per als nivells de NAD més del fetge. Això potencialment emfatitza com els extractes cel·lulars d'estàndards rics en isòtops poden contribuir a la variabilitat de les mesures de NAD més, ja que l'efecte matriu del llevat estàndard afegit o l'extracte cel·lular podria interferir amb l'eficiència d'ionització i, en conseqüència, les concentracions mesurades dels metabòlits objectiu.
Les limitacions d'aquesta anàlisi del biaix i la variabilitat de quantificació inclouen diferències potencials en l'entorn, antecedents genètics, sacrifici, sexe i edat. Totes les dades d'aquesta anàlisi provenien d'animals amb una dieta de menjar, però poden diferir de tipus. Després del sacrifici, s'informa de diferències en l'estat d'alimentació o en dejuni de l'animal i l'hora del dia per al sacrifici. A més, tot i que la majoria d'estudis amb ratolins es van realitzar sobre un fons C57BL/6, hi va haver una gamma més àmplia de fons utilitzats per a rates en tots els estudis (Wistar: 38 per cent, Albino Wistar: 25 per cent i 6 per cent per a Hooded Wistar, Sprague-Dawley, Rates Holtzman, ACI, Long-Evans i Zucker). En els estudis de fetge de ratolí, no hi va haver diferències estadístiques entre els valors masculins o femenins per als nivells de NAD més, NADH o NAD (H) totals o per a la relació NAD més / NADH (figura suplementària 7). Tanmateix, no podem treure conclusions a causa del nombre limitat de cohorts femenines.
Demana més:
Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: més 86 15292862950
