MicroRNAs en el desenvolupament i la malaltia renal Ⅲ

MiRNAs al tumor de Wilms

tumor de Wilms,onefroblastoma, és la infància més habitualcàncer renal, amb una incidència d'1 de cada 10,000 nens a Amèrica del Nord (111). Es tracta principalment d'una malaltia esporàdica, encara que les formes familiars es presenten en aproximadament l'1%-2% dels casos (112, 113). Els tumors de Wilms sorgeixen d'una nefrogènesi aberrant, on els precursors renals embrionaris pluripotents no es diferencien i persisteixen.anormalment en la vida postnatal(111, 114, 115). Aquests tumors s'assemblen histològicamentronyons en desenvolupamentamb unamorfologia alterada(116), i les mutacions en gens implicats en la nefrogènesi fetal, incloent WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) i TP53 (123, 124), s'associen amb aproximadament el 40% de Tumors de Wilms (125). Estudis recents que utilitzen la seqüenciació de tot el genoma i l'exoma sencer de tumors de Wilms van identificar noves mutacions en gens de risc de càncer (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), gens que codifiquen proteïnes que medien les modificacions d'histones durant la nefrogènesi (BCOR, MAP3K4) (126) (126). ), i gens de processament de miRNA (121, 122, 128, 129).

QUANT TEMPS TREGA EL CISTANCHE A TREBALLAR PER A PACIENTS DE MALALTIA RENAL?

Entre els gens de processament de miRNA, s'han informat mutacions en DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 i XPO5 (codifica exportina 5) en tumors Wilms tractats amb quimioteràpia ingènua i neoadjuvant (Figura 3) (121, 122, 128, 129). ). Al voltant del 33% dels tumors de Wilms examinats presenten mutacions nocives en els gens de la via de processament de miRNA (128). Una mutació recurrent de punt calent (E1147K) en un residu d'unió al met al (Mg2+) del domini RNasa IIIb de DROSHA, que sembla ser exclusiu del tumor de Wilms, suprimeix l'activitat catalítica d'aquest domini, donant lloc a una incompleta mutació. clivage de pri-miRNAs i reducció de la maduració de miRNA (128). Les mutacions somàtiques hotspot que afecten el domini RNasa IIIb de DICER1 perjudiquen el processament dels miRNAs 5p (els derivats del braç 5' de la forquilla pre-miRNA) (129) i sovint es troben com a mutacions de "segon èxit" que actuen conjuntament amb DICER1. mutacions de la línia germinal per induir la tumorigènesi de Wilms en la síndrome DICER1 (un trastorn que augmenta la susceptibilitat a una varietat de tumors) (130–132). Encara no està clar per què la funció DICER1 deteriorada en els tumors de Wilms provoca una nefrogènesi persistent i aberrant, a diferència de la pèrdua de Dicer1 en els progenitors de la nefrona del ratolí, que provoca un augment de l'apoptosi i un cessament prematur de la nefrogènesi (72–75). Algunes possibilitats potencials inclouen que l'activitat de dosificació del gen pot ser crucial per determinar la supervivència cel·lular o que les mutacions en el domini RNasa IIIb puguin afectar l'especificitat de la unió de miRNA per DICER1.

Les mutacions en els gens de processament de miRNA s'associen amb la regulació a la baixa de miRNAs importants, inclosos els membres de les famílies miR-200 (121) i les famílies let-7 (figura 3) (121, 129). Deixem que els-7 miRNAs i la proteïna d'unió a l'ARN Lin28 funcionin conjuntament per controlar el moment de cessament de la nefrogènesi murina, possiblement mitjançant la regulació del gen promotor del creixement Igf2 (133). La sobreexpressió de Lin28 durant el desenvolupament del ronyó provoca l'expansió dels progenitors nefrogènics, en inhibir la seva onada final de diferenciació, que culmina amb una transformació neoplàstica que recorda molt al tumor de Wilms humà (134). S'observa un augment del nombre de còpies d'ADN de LIN28B i una pèrdua de còpia d'ADN de le-7a en el 25% i el 46% de les mostres de tumors de Wilms humans, respectivament (126). D'acord amb aquestes observacions, les mutacions de la línia germinal en el gen DISL3L2 humà, que codifica una exoribonucleasa responsable de degradar les formes preprocessades de let-7, causen la síndrome de Perlman i la predisposició al tumor de Wilms (135, 136). La síndrome de Perlman és una síndrome de sobrecreixement congènita caracteritzada per macrosomia, polihidramnios, dismorfologia facial, displàsia renal i nefroblastomatosi (una lesió precursora del tumor de Wilms) (137). Entre els nadons amb síndrome de Perlman que sobreviuen més enllà del període neonatal, el 64% desenvolupa un tumor de Wilms (138). Curiosament, es van trobar supressions completes o parcials de DISL3L2 en aproximadament el 30% dels tumors de Wilms esporàdics examinats (136).

Un estudi recent va reforçar la importància de la xarxa reguladora de miRNA en l'etiologia del tumor de Wilms. Els autors van trobar que el gen 1 de l'adenoma pleiomòrfic (PLAG1) és un dels gens més constantment regulats en els tumors de Wilms amb mutacions en els gens de processament de miRNA (125). L'expressió ectòpica de PLAG1 al ronyó del ratolí en desenvolupament causa una neoplàsia, que s'acompanya de la transactivació del seu gen objectiu, l'oncogen del tumor de Wilms IGF2. miR-16 i miR{-34, que estan regulats a la baixa en els tumors de Wilms, es van identificar com a reguladors potencials de l'expressió de PLAG1 (125). La taula 2 resumeix altres estudis que han informat d'expressió aberrant de miRNA específics associats amb l'etiologia del tumor de Wilms. Curiosament, aquests miRNAs poden funcionar com a oncogens (anomenats oncomiRs) o supressors de tumors en el context del desenvolupament del tumor de Wilms, depenent de la naturalesa dels seus objectius.

MiRNAs com a biomarcadors potencials i agents terapèutics

A més de la seva ubicació intracel·lular, els miRNA també estan presents en quantitats importants en fluids biològics, com ara sang, plasma, orina, llet materna i saliva (139). Aquests miRNAs circulants es troben envellits en micropartícules (exosomes, microvesícules i cossos apoptòtics) (140, 141), conjugats amb proteïnes AGO (142) o nucleofosmina 1 (143) o carregats en HDL (144), que els fan notablement. estable fins i tot en condicions desfavorables, com ara ebullició, variacions extremes de pH, emmagatzematge prolongat i múltiples cicles de congelació-descongelació (145, 146). Així, les signatures de miRNA en fluids biològics poden reflectir associacions amb condicions fisiològiques o de malaltia (147). En conjunt, aquestes característiques fan que els miRNA circulants siguin atractius per utilitzar-los com a biomarcadors no invasius per al diagnòstic i el pronòstic de malalties.

Els miRNAs en circulació es poden extreure directament de fluids biològics no fraccionats o preparats de vesícules extracel·lulars mitjançant kits d'extracció disponibles comercialment (148) o TRIzol (149). Un cop aïllats, els miRNAs es poden emmagatzemar a -70 graus i romandre estables fins a 1 any (148). Hi ha diverses plataformes disponibles per al perfil de miRNA, inclosa la hibridació de microarrays, qPCR i la seqüenciació de nova generació (150). Microarray i qPCR són les metodologies més utilitzades per investigar l'expressió de miRNAs coneguts (151). Tots dos mètodes tenen els avantatges de ser senzills d'utilitzar, relativament ràpids des de l'etiquetatge d'ARN fins a la generació de dades i relativament rendibles (152). Tanmateix, es basen en la disponibilitat i l'anotació precisa de les seqüències de miRNA a les bases de dades per al disseny de sondes i imprimadors (150). Tot i que és més cara, la seqüenciació de nova generació permet la detecció simultània d'espècies de miRNA conegudes i noves i ofereix una alta sensibilitat (153). A més, la resolució d'un sol nucleòtid de la seqüenciació de propera generació permet la identificació d'isomiR, que són isoformes de miRNA madures que es diferencien de les canòniques en longitud, seqüència o ambdues (154, 155), que canvien l'especificitat d'orientació del miRNA (154, 155). 156).

Diversos estudis han investigat el potencial dels miRNAs circulants com a biomarcadors de malalties renals pediàtriques (157–160). Per exemple, un estudi va identificar 14 miRNAs que estaven significativament regulats en el sèrum de pacients amb tumor de Wilms. Curiosament, una signatura basada en l'expressió miR-100-5p i miR-130-3p podria diferenciar aquests pacients dels controls sans amb precisió, sensibilitat i especificitat (159). Tot i que les troballes d'aquest estudi i de molts altres estudis han proporcionat una motivació convincent per explorar el potencial dels miRNAs circulants com a biomarcadors, cal superar diversos obstacles en el camp abans d'una aplicació clínica generalitzada. En primer lloc, hi ha una manca relativa de consens entre els estudis probablement a causa de l'absència de metodologia estandarditzada per a la purificació (161) i l'anàlisi de mostres (per exemple, diferències en les plataformes de perfils de miRNA, refs. 162, 163; o diferències en la biblioteca smRNA-Seq). mètodes de preparació, ref. 164). En segon lloc, és la manca d'estudis de gran mida de mostra i investigacions detallades sobre específiquesmalalties.Un altre aspecte important és que la influència de variables de confusió com l'edat, el sexe i els factors externs (per exemple, el tabac, l'alcohol, etc.) en els perfils de miRNA no s'ha explorat completament (per a una revisió en profunditat, consulteu la ref. 165).

Pel que fa al costat terapèutic, diversos fàrmacs basats en miRNA es troben actualment en assaigs clínics, però encara no han rebut l'aprovació de la FDA (166, 167). Els principals enfocaments per a la teràpia amb miRNA impliquen la restauració dels nivells de miRNA mitjançant mimistes de miRNA o la inhibició de miRNAs específics mitjançant antagomiR (168). Un dels reptes associats al desenvolupament de terapèutiques basades en miRNA és la identificació de candidats a miRNA per a cada malaltia. Com que diversos miRNAs estan desregulats en cada malaltia, s'ha de realitzar una anàlisi acurada de mostres de pacients en combinació amb assajos in vitro i in vivo que aborden els mecanismes fisiopatològics afectats pels miRNAs en qüestió per reduir els miRNAs candidats a la intervenció terapèutica (168, 169). Un altre repte implica el desenvolupament d'estratègies per millorar l'estabilitat in vivo i el lliurament de fàrmacs específics del lloc amb una toxicitat mínima i efectes fora de l'objectiu. Les molècules d'ARN són químicament inestables a causa de la presència del grup 2′-hidroxil a l'anell de pentosa. Per proporcionar una major estabilitat i protecció contra les nucleases presents al sèrum o al compartiment endocític de les cèl·lules, les empreses biotecnològiques han generat molècules d'ARN amb modificacions químiques (grup 2′-O-metil, fosforotioat o àcids nucleics bloquejats) a la seva columna vertebral (166). Pel que fa al lliurament in vivo, les tecnologies inclouen basades en lípids (per exemple, nanopartícules de lípids i liposoma neutre) i dendrímers conjugats a un fragment d'orientació, entre moltes altres estratègies. Els principals reptes associats als sistemes de lliurament de miRNA són la immunotoxicitat i l'afinitat específica de la diana cap a un lloc de malaltia (170). Les estratègies d'administració mitjançant diversos mètodes d'administració (injeccions intraperitoneals, intravenoses i subcutànies) o mitjançant l'ús de vectors que contenen promotors inductibles i específics del ronyó s'han utilitzat amb èxit per a l'orientació renal selectiva i per evitar possibles efectes adversos en altres teixits i òrgans (171, 172). ).

Taula 2. Llista de miRNAs alterats en el tumor de Wilms

Llista de miRNAs, mostres/espècimens analitzats, nivells de miRNA observats en aquestes mostres/espècimens comparats amb els controls adequats, gen objectiu, conseqüències dels canvis de miRNA i referències. CAMKK2, proteïna quinasa quinasa 2 dependent de calci/calmodulina; CDC7, cicle de divisió cel·lular 7; CDH1, cadherina 1; CREB1, proteïna 1 d'unió a l'element de resposta a cAMP; EYA1, ulls absents homòleg 1; E2F3, E2F factor de transcripció 3; FRS2, substrat 2 del receptor de FGF; Glut1, transportador de glucosa 1; IGF1R, receptor IGF1; Jag1, dentada1; MET, transició mesenquimato-epitelial; MKNK1, serina/treonina quinasa 1 que interacciona amb MAPK; PTEN, homòleg de fosfatasa i tensina; PUMA, p53-modulador augmentat de l'apoptosi; p73, proteïna tumoral p73; SIX1, sineoculis homeobox homòleg 1; TGFBR1, receptor 1 de TGF; WT, tumor de Wilms.

Resum

Hi ha hagut una explosió d'informació sobre la biogènesi de miRNA, la regulació de l'expressió de miRNA i la funció de miRNA des del descobriment inicial dels miRNAs el 1993 (6, 7). Això ha anat acompanyat d'una comprensió cada cop més gran de com funcionen els miRNAs tant en la fisiologia normal com en la fisiopatologia de moltes malalties. Ha quedat clar que la desregulació de l'expressió de miRNA altera el desenvolupament primerenc del ronyó i està implicada en la patogènesi de les malalties renals del desenvolupament, com el tumor CAKUT i Wilms. Amb els avenços recents en l'ús de miRNAs com a biomarcadors i com a dianes de fàrmacs nous, la informació sobre com els miRNA regulen el desenvolupament i la malaltia renal són fonamentals per entendre com es poden utilitzar en nous enfocaments diagnòstics i terapèutics d'aquestes malalties. Per realitzar aquests esforços, són crítics els estudis futurs que identifiquin la funció de miRNA específics en el desenvolupament del ronyó, a més de les tecnologies per optimitzar l'orientació de la terapèutica d'oligonucleòtids petits al ronyó.

Agraïments

El laboratori de JH compta amb el suport de subvencions de l'Institut Nacional de Diabetis i Malalties Digestives i Renals del NIH (R01DK125015 i R01DK102843). DMC va comptar amb el suport del Premi al Desenvolupament de Carreres de la Xarxa d'Estudis de Síndrome Nefròtic i la Beca Postdoctoral del Consell Assessor de Recerca de l'Hospital Infantil de Pittsburgh. MT va comptar amb el suport del Programa de pràctiques de recerca d'estiu de la Universitat de Pittsburgh (R25DK119180). Les figures es van crear amb BioRender.com. Correspondència d'adreça a: Jacqueline Ho, Divisió de Nefrologia, Departament de Pediatria, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, EUA. Telèfon: 412.692.9440; Correu electrònic: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A, et al. miRBase: de les seqüències de microARN a la funció. Àcids nucleics Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC, et al. La majoria dels ARNm de mamífers són dianes conservades dels microARN. Res del genoma 2009;19(1):92–105.

3.Ghildiyal M, Zamore PD. Petits ARN silenciadors: un univers en expansió. Nat Rev Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovic S, et al. Silenciment gènic mediat per miRNA per repressió translacional seguida de deadenilació i desintegració de l'ARNm.

Ciència. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Silenciment gènic per microRNAs: contribucions de la repressió translacional i la decadència de l'ARNm. Nat Rev Genet. 2011;12(2):99–110. 6.Lee RC, et al. El gen heterocrònic de C. elegans lin-4 codifica petits ARN amb complementarietat antisentit amb lin-14. Cèl·lula.