MicroRNAs en el desenvolupament i la malaltia renal Ⅱ

Desenvolupament renal

Elronyó de mamífer(o metanefros) és un òrgan vital que té un paper crític en laexcreció de residus metabòlics,regulació del volum de líquid extracel·lular, imanteniment de l'electròlitihomeòstasi àcid-base. A més, el ronyó produeix hormones importants, com araeritropoietina, calcitriol,renina, iprostaglandines(48). La capacitat funcional del ronyó es correlaciona amb el nombre de nefrones en funcionament que es formen durant el desenvolupament del ronyó abans del naixement, també anomenada dotació de nefrones. Cada ronyó humà conté de mitjana 1,000,000 nefrones, tot i que aquest nombre varia considerablement, amb estimacions que oscil·len entre 200,000 i 2,000,{{8 }} nefrones (49, 50). Ambenvelliment,Pèrdua de la reserva funcional de nefronaes produeix al llarg del temps (51, 52); per tant, la baixa dotació de nefrona al néixer s'associa amb un augment del risc de desenvolupar hipertensió i malaltia renal crònica (ERC) més tard a la vida (53–55). A més, CAKUT, que condueix a una disminució de la dotació de nefrones i de la funció de la nefrona, és la principal causa d'insuficiència renal en nens, donant lloc a una morbiditat i mortalitat significatives associades al trasplantament i la diàlisi (56, 57). Així, una millor comprensió dels mecanismes cel·lulars i moleculars subjacents a l'establiment del nombre de nefrones i la formació normal de nefrones proporciona informació sobre noves vies per predir, prevenir i tractar la malaltia renal infantil.

QUANT TEMPS TREGA EL CISTANCHE A TREBALLAR PER A PACIENTS DE MALALTIA RENAL?

Desenvolupament del ronyó metanèfriccomença al voltant del dia 10,5 embrionari (E10,5) en ratolins i al voltant de la cinquena setmana de gestació en humans (58). En resposta als senyals inductius del mesenquima metanèfric, el brot uretèric s'estén des de l'extrem caudal del conducte de Wolffi i envaeix al mesenquima adjacent (figura 2). Simultàniament, els morfògens que emanen del brot uretèric indueixen la condensació del mesenquima metanèfric per formar el mesenquima de la tapa (també anomenat progenitors de la nefrona) al voltant de les puntes del brot uretèric. A mesura que avança la nefrogènesi, el brot uretèric experimenta successives rondes de ramificació, allargament i diferenciació per generar els conductes col·lectors del ronyó. Una subpoblació de progenitors de nefrona experimenta una transició mesenquimato-epitelial per formar vesícules renals, que després de la polarització i l'allargament es converteixen en estructures corporals en forma de coma i S. Finalment, la part distal del cos en forma de S es fusiona amb el conducte col·lector per formar una nefrona funcional (59-61). El cos en forma de S experimenta una més diferenciació per formar els tipus de cèl·lules madures de la nefrona, a part del conducte col·lector. Les cèl·lules progenitores de l'estroma Foxd1+ són adjacents als progenitors de nefrona a la zona cortical o nefrogènica externa del ronyó en desenvolupament (figura 2) (62). Es creu que els senyals de l'estroma cortical inhibeixen l'expansió de les cèl·lules progenitores de la nefrona i estimulen la seva diferenciació, ja que l'ablació de l'estroma renal provoca una alteració de la diferenciació dels progenitors de la nefrona (63). Les cèl·lules progenitores de Foxd1+ donen lloc a totes les cèl·lules estromals del ronyó metanefric, incloses les cèl·lules intersticials corticals i medul·lars renals, pericits, fibroblasts perivasculars, cèl·lules mesangials i cèl·lules del múscul llis vascular (64, 65). Les perturbacions en qualsevol pas d'aquest procés poden conduir a CAKUT, la principal causa d'ERC infantil (66, 67).

La nefrona madura es compon d'un glomèrul que actua com a unitat de filtració i un compartiment d'absorció posterior tubular que es subdivideix en un túbul contornejat proximal, un bucle de Henle, un túbul contornejat distal i un conducte col·lector (figura 2). La barrera de filtració del glomèrul (que comprèn l'endoteli fenestrat, la membrana basal glomerular, els processos del peu i els diafragmes d'escletxa dels podòcits) permet la filtració de plasma i petits soluts, alhora que reté de manera selectiva proteïnes com l'albúmina i les immunoglobulines a la sang (68, 69). Mentrestant, el compartiment de reabsorció tubular és responsable del manteniment de l'homeòstasi de l'aigua, la reabsorció de soluts (inclosos sodi, potassi, calci, fòsfor, magnesi, glucosa i molts altres) i l'excreció d'àcids i altres residus.

MiRNAs al ronyó en desenvolupament

En estudis en ratolins transgènics condicionals, els miRNAs han sorgit com a reguladors crítics de la morfogènesi renal en múltiples llinatges cel·lulars. Els estudis inicials que avaluaven el paper funcional dels miRNAs en el desenvolupament renal van utilitzar la supressió condicional de Dicer (70) en diferents llinatges renals. Tanmateix, també se sap que Dicer té rols independents del miRNA (71), cosa que ha complicat la interpretació d'aquests models. La supressió condicional de Dicer en el mesènquima metanèfric precoç o els progenitors de la nefrona dóna lloc a una apoptosi augmentada dels progenitors de la nefrona, nivells elevats de la proteïna proapoptòtica Bim i un cessament prematur de la nefrogènesi (72-75) (taula 1). Curiosament, la pèrdua d'expressió de Bim en genitors de nefrona amb deficiència de Dicer disminueix l'apoptosi i restaura parcialment la formació de nefrona. Es van identificar dos miRNAs expressats en progenitors de nefrona, miR-17 i miR{-106, com a supressors de l'expressió BIM (76). En conjunt, aquestes troballes indiquen que els miRNA controlen l'equilibri entre la supervivència i l'apoptosi en els progenitors de nefrones per assegurar la formació d'un nombre correcte de nefrones al llarg de la nefrogènesi.

Figura 2. Il·lustració esquemàtica de les etapes del desenvolupament del ronyó metanèfric. Els senyals del brot uretèric desencadenen la condensació del mesènquima metanèfric per formar una capa de progenitors de nefrona (mesènquima de capçal) al voltant de les puntes del brot uretèric. El mesènquima de la tapa experimenta una transició mesenquimato-epitelial per formar vesícules renals, que es desenvolupen seqüencialment en cossos en forma de coma i S. Aquestes estructures es connecten a la tija del brot ureteral, que dóna lloc al conducte col·lector. Les cèl·lules del domini proximal del cos en forma de S es diferencien en cèl·lules epitelials especialitzades del corpuscle renal madur (és a dir, podòcits i cèl·lules de la càpsula de Bowman), mentre que les cèl·lules de les parts mitjanes i distals es diferencien en els segments tubulars de la nefrona (túbuls proximals). , bucles de Henle i túbuls distals). Creat amb BioRender.com.

La supressió condicional de Dicer en el llinatge de brots ureterics dóna lloc a un espectre d'anomalies que s'assemblen molt a CAKUT, inclosa la displàsia renal i el desenvolupament de quists de conductes col·lectors (73, 77, 78). La terminació prematura de la morfogènesi de ramificació (en resposta a la disminució de l'expressió de Wnt11 i c-Ret del brot uretèric) és probablement el principal factor que contribueix a la displàsia renal (73). L'inici de la formació de quists es produeix al voltant de E15.5 i s'associa amb defectes en la longitud dels cilis primaris, augment de la mort cel·lular apoptòtica i proliferació cel·lular excessiva (73). Com que Dicer té importants funcions independents del miRNA a la cèl·lula, s'ha utilitzat la supressió condicional de Dgcr8 per confirmar que els fenotips observats en els models condicionals de Dicer-knockout són efectivament el resultat de la pèrdua de miRNAs. Els animals amb deleció de Dgcr8 a la nefrona distal i els derivats del conducte col·lector desenvolupen hidronefrosi i quists del conducte col·lector (79), un fenotip semblant a CAKUT que s'assembla a la pèrdua de l'activitat de Dicer en el llinatge del brot ureter.

Els estudis de dos grups independents van demostrar que l'ablació de Dicer del llinatge de l'estroma renal Foxd1+ i els seus derivats dóna lloc a un espectre d'anomalies renals, amb troballes consistents sobre ronyons hipoplàsics, nombres glomerulars reduïts, maduració glomerular anormal i vascular defectuosa. estampació (80, 81). Tot i que ambdós grups van descriure fenotips en gran mesura concordants utilitzant models de ratolí similars, es van observar dues diferències diferents. Nakagawa et al. va observar una manca de la medul·la interna i la papil·la, així com una disminució de la zona nefrogènica (80). En canvi, Phua et al. va mostrar una expansió de la població progenitora de nefrona i papil·la renal preservada (81). Nakagawa et al. va proposar que aquests defectes estan relacionats amb la interrupció de la senyalització de la via Wnt, donant lloc a canvis en la migració i proliferació de cèl·lules estromals, a causa de la regulació a la baixa dels miRNAs de les cèl·lules estromals, miR-214, miR-199a{{7 }}p i miR-199a-3p (80). L'estudi de Phua et al. va suggerir que els canvis en els programes apoptòtics (inclosa l'expressió augmentada dels gens efectors Bim i p53) contribueixen als defectes fenotípics (81). És concebible que les diferències de fons genètic i/o l'eficiència de la recombinació mediada per Cre puguin ser responsables de les diferències que descriuen aquests estudis. No obstant això, els fenotips descrits són coherents amb els papers polifacètics coneguts de l'estroma renal en el desenvolupament del ronyó, i els mecanismes subjacents a aquests fenotips són probablement complexos donada la naturalesa d'una supressió de Dicer. Es necessiten més estudis que examinin miRNAs específics en diverses subpoblacions estromals per definir millor els mecanismes reguladors en joc.

Un treball més recent ha abordat la qüestió de la funció dels miRNAs específics tant en els progenitors de ronyó com de nefrona en desenvolupament. Utilitzant un model de cèl·lules mare embrionàries humanes, Bantounas et al. va demostrar que la inhibició del clúster miR-199a~214 dóna lloc a glomèruls dismòrfics, túbuls proximals aberrants, disminució de l'expressió WT1 i augment dels capil·lars intersticials en organoides semblants als ronyons (82). Curiosament, la supressió global de miR -210 sensible a la hipòxia dóna lloc a un dèficit de nefrona específic per a homes (83). Per exemple, la supressió condicional del clúster miR-17~92 en progenitors de nefrones i els seus derivats en ratolins perjudica la proliferació de cèl·lules progenitores i redueix el nombre de nefrones en desenvolupament. Com a resultat, els ratolins mutants desenvolupen proteinúria, fibrosi renal i funció renal deteriorada (84). Els nivells desregulats del gen objectiu miR-17~92, CFTR, estan implicats en la proliferació defectuosa de cèl·lules progenitores i en la dotació reduïda de nefrona en aquest model de ratolí (85).

La seqüenciació d'ARN petit (smRNA-Seq) s'ha utilitzat cada cop més per perfilar patrons d'expressió de miRNA i per al descobriment de noves espècies de miRNA. smRNA-Seq de cèl·lules mesenquimals nefrogèniques E15.5 va identificar 162 miRNAs anotats que s'expressen de manera diferent en aquesta població cel·lular en comparació amb els ronyons sencers i 49 noves espècies de miRNA (86). Curiosament, els nivells de miRNA de la família miR-200 es van reduir significativament en els progenitors de la nefrona. Atès que els membres de la família miR-200 són reguladors clau de la transició mesenquimal-epitelial al conducte col·lector (87), especulem que la seva expressió podria estar estretament regulada per garantir la diferenciació epitelial normal dels progenitors de la nefrona durant el desenvolupament del ronyó.

Funció del miRNA a la nefrona madura

A més del seu requisit durant el desenvolupament del ronyó, els miRNA regulen nombrosos processos biològics en els principals llinatges cel·lulars que formen la nefrona madura (69, 88–91). D'acord amb això, s'ha descrit l'expressió específica de segments de miRNAs al llarg de la nefrona, incloent miR-143 i miR{-195a al glomèrul, miR{-107 i miR{{7} }a al túbul proximal, miR-193 i miR-378a al limbe ascendent gruixut, miR{-874 i miR{-155 al túbul contornejat distal i miR{{ 12}}c al conducte col·lector (87). A més, els estudis funcionals en compartiments de la nefrona madura donen suport a diferents papers per als miRNAs.

Els ratolins que no tenen Dicer o Drosha als podòcits presenten una marcada proteinúria, glomerulosclerosi i una progressió ràpida cap a insuficiència renal, secundària a la interrupció de la barrera de filtració glomerular (90–93). Les anàlisis in silico van revelar que diverses transcripcions regulades a l'alça en glomèruls mutants contenen seqüències diana per als membres de la família miR-30. Com els quatre membres de la família miR-30 (miR{-30c-1, miR-30b, miR{-30d i miR-30c{ {9}}) normalment s'expressen molt en els podòcits, aquests miRNAs poden ser responsables de les anormalitats dels podòcits i de la interrupció de la barrera de filtració glomerular en ratolins mutants (91).

Sorprenentment, la supressió de Dicer dels túbuls proximals de mamífers postnatals no afecta el desenvolupament, la histologia o la funció renal, però protegeix contra la lesió per isquèmia/reperfusió renal. Els ratolins mutants presenten una millor funció renal, una lesió renal reduïda, una apoptosi tubular més baixa i una supervivència millorada en comparació amb els seus companys de camada WT (94). Això probablement reflecteix la "suma" de l'efecte de la supressió de múltiples miRNAs al túbul proximal, ja que altres treballs han demostrat des d'aleshores que l'expressió de miRNAs específics és protectora en lesions d'isquèmia/reperfusió renal (per exemple, miR-16 i miR-21; ref. 95, 96); mentre que altres són perjudicials (per exemple, miR-182; ref. 97).

Tot i que els miRNA semblen ser prescindibles per a la funció del túbul proximal, són essencials per a les nefrones distals i l'homeòstasi del conducte col·lector (79, 88, 98). La recollida de la inactivació específica del conducte de Dicer i altres gens crítics associats a la biogènesi de miRNA (inclosos Dgcr8, Ago1, 2, 3 i 4) provoca insuficiència renal en ratolins adults a causa de la fibrosi tubulointersticial progressiva i la inflamació intersticial (88). Això va precedit per una transició epitelial-mesenquimal (EMT) parcial de les cèl·lules del conducte col·lector i una regulació a la baixa dels membres de la família miR-200, que inhibeixen l'EMT (88). De la mateixa manera, l'ablació de Dicer o Dgcr8 dels derivats de la nefrona distal i del brot uretèric, respectivament, produeix anomalies renals i insuficiència renal (78, 98), que finalment s'associen amb la regulació a la baixa dels membres de la família miR-200 (98). L'augment de l'expressió del gen objectiu miR-200 Pkd1 en aquests ratolins mutants altera la tubulogènesi i produeix estructures semblants a quists (98). Aquestes diferències en el requisit de miRNAs funcionals en túbuls proximals i nefrona distal / conducte col·lector es podrien explicar per la distribució segmentària dels miRNAs al llarg de la longitud de la nefrona i el conducte col·lector als ronyons WT (88).

La supressió de Dicer a les cèl·lules secretores de renina de l'aparell juxtaglomerular provoca un dèficit de cèl·lules juxtaglomerulars, nivells reduïts de renina circulant amb la consegüent reducció de la pressió arterial, reducció de la funció renal, patró ratllat de fibrosi intersticial i anomalies vasculars (89). La reducció de cèl·lules juxtaglomerulars suggereix un requisit de miRNA madurs en el manteniment del seu fenotip. Més tard, miR-330 i miR-125b{-5p es van identificar com a candidats potencials que inhibeixen o promouen, respectivament, el fenotip del múscul llis de les cèl·lules juxtaglomerulars (99).

Altres àrees actives d'investigació sobre miRNAs en lesió renal aguda (8-10), malaltia renal poliquística (11) i trasplantament de ronyó (10), s'han abordat de manera exhaustiva en altres revisions recents.

MiRNAs en malalties renals pediàtriques En aquesta secció, oferim una visió general del paper dels miRNAs en malalties renals del desenvolupament, inclosos els tumors CAKUT i Wilms. Les CAKUT es troben entre les formes més freqüents de malformacions en néixer, que afecten aproximadament 3-7 de cada 1000 nascuts vius (100). La interrupció del desenvolupament del ronyó i del tracte urinari inferior condueix a un ampli espectre de manifestacions clíniques observades a CAKUT, incloses anomalies renals (és a dir, agènesi renal, hipoplàsia i displàsia renals i ronyons displàstics multiquístics), anomalies ureteropèlvices (és a dir, obstrucció de la unió ureteropelvica), sistema de recollida dúplex i anomalies de la bufeta i la uretra (101-103). Aquesta heterogeneïtat fenotípica es deu probablement a interaccions complexes entre factors ambientals genètics, epigenètics i/o prenatals que afecten el desenvolupament del ronyó i el tracte urinari inferior, donant lloc a CAKUT (101). La major part del nostre coneixement actual de la patogènesi de CAKUT ha sorgit de models de ratolí i formes sindròmiques de CAKUT. Aquests estudis han conduït a la identificació de diversos gens CAKUT, molts dels quals estan implicats en el desenvolupament primerenc del ronyó, incloent PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 i altres (101, 104, 105). Tanmateix, les mutacions simples o les variants del nombre de còpies en els gens que codifiquen proteïnes no expliquen la majoria dels casos de CAKUT (~ 80%) (101, 106).

Com s'ha esmentat anteriorment, l'esgotament dels miRNAs madurs de diferents llinatges cel·lulars del ronyó en desenvolupament en models de ratolí dóna lloc a anomalies renals que imiten CAKUT humà (73, 74, 78, 79). A més, les supressions de la línia germinal de MIR17HG, que codifica el clúster miR-17~92, causen la síndrome de Feingold tipus 2 en humans (107). Tot i que encara no s'ha definit un fenotip renal en pacients amb síndrome de Feingold tipus 2 amb mutacions MIR17HG, s'ha informat d'una incidència del 18% de CAKUT en casos de síndrome de Feingold associats a mutacions MYCN (108, 109). En conjunt, aquestes observacions suggereixen que les mutacions en els miRNA expressats durant el desenvolupament del ronyó podrien causar CAKUT en humans, sobretot perquè molts miRNAs estan molt conservats entre ratolins i humans.

Per provar aquesta hipòtesi, un estudi va investigar 1248 pacients amb CAKUT no sindròmic de 980 famílies i va buscar mutacions en 96 regions de bucle tija de 73 gens de miRNA de desenvolupament renal (106). Dins d'aquesta cohort, es van identificar 31 individus amb 17 variants de nucleòtids diferents que afecten 16 gens de miRNA diferents. Entre aquestes, es va trobar que dues noves variants dels miRNAs eren potencialment patògenes. MIR19B1 (un membre del clúster miR-17~92) es va associar amb la presència d'agenesia renal dreta, i MIR99A es va associar amb reflux vesicoureteral greu i ptosi renal. Aquest nombre sorprenentment baix de variants patògenes candidates es deu en part a les limitacions d'aquest estudi, ja que l'anàlisi només va tenir en compte les mutacions en gens miRNA que es van incloure en l'enfocament del gen candidat i no va detectar variacions del nombre de còpies i grans reordenaments d'ADN (106) .

En un enfocament alternatiu, es van analitzar segments d'urètre de pacients amb una varietat de CAKUT per a l'expressió de transcripció diferencial mitjançant microarrays, per a la presència d'objectius de miRNA predits bioinformàticament i miRNAs madurs mitjançant qPCR (110). Mitjançant aquest enfocament polivalent, es van identificar set miRNAs amb papers potencials en CAKUT, i entre aquests, has-miR-144 va augmentar significativament en pacients amb CAKUT. L'anàlisi d'ontologia gènica va indicar que els gens objectiu has-miR-144 predits contribueixen als processos biològics implicats en el desenvolupament de CAKUT, inclòs el desenvolupament del tub (22 gens objectiu), el desenvolupament del sistema urogenital (18 gens objectiu), el desenvolupament del ronyó (14 gens objectiu) , i desenvolupament d'òrgans embrionaris (18 gens diana) (110).

Es necessiten més estudis per definir els mecanismes moleculars subjacents als papers patògens dels miRNAs a CAKUT. Els resultats d'aquests estudis seran crítics per millorar l'atenció dels pacients amb CAKUT i prevenir la seva progressió a la ERC, proporcionar un assessorament genètic adequat als pacients i les seves famílies i desenvolupar noves estratègies terapèutiques.