El seroproiling multifactorial dissecciona la contribució de les respostes de coronavirus humans preexistents a la immunitat SARS-CoV-2 (part 2)

Per obtenir més informació, contacteudavid.wan@wecistanche.com

Resolució de temporal anticossos dinàmiques per ABCORA ser-oprofiling.  Creu-seccionalanàlisi de reactivitat d'anticossos post-SARS-CoV-2diagnòstic per RT-PCR (N = 369) ipost-inici desímptomes (N = 333) subratllat el capacitat de ABCORA ser- oprofillarg per disseccionar l'inici, el pic i la disminució del SARS-CoV-2 anticossos respostes (Fig. 5a, b, figura suplementària 11). En individus amb a conegut data de fiprimer Diagnòstic RT-PCR de SARS-CoV-2 o aparició de símptomes, detectar ABCORA 2.3ed d'hora seroconvertir-sió en 98 per cent (48de 49) i100 per cent (9de 9) de individus dins7 dies post-RT-PCR i aparició dels símptomes, respectivament. A més IgM i La reactivitat d'IgA, les respostes d'IgG es van detectar fàcilment ABCORA 2.0 després d'uns dies d'infecció (complementntàriaFig. 11a).

Valoració longitudinal d'una cohortde convalescent pacients amunta  11  mesos després de la infecció (251 mesures en 120 pacients)  destacateltemporaldinàmiquesde SARS-CoV-2 anticossos d'unió. Hem estimat la decadència of enquadernació reactivitat emprant allei de poder model mixt i va identificar un significatiu reduacció en RBD, S1, i N en tots Ig subtipus (Fig. 5b) ambvides mitjanes oscil·lant des de 67 a 404 dies, amb títols d'IgG N en descomposició més ràpid,enlíniaambanterior   informes10.   La meitat-videsdeel neutreizació rellevants IgG respostes a RBD i S1 eren 125 i 404 dies, respectivament. Curiosament, la cinètica de neutralització anticossos va fer no mirall el decaïment tarifes observat per a la vinculació anticossos. L'activitat de neutralització va disminuir més d'unll a a més lenttaxa, amb a la meitat-vida de 991 dies (Fig.5c). Això va ser en part degut a abarrejatreactivitatpatróambalgunsindividusmostrantunaugmentar en neutralització activitat publicació positiu SARS-CoV-2 RT- PCR5, mentre que l'activitat de neutralització en altres va disminuir ràpidament (Suplementària Fig. 11c).

Efectes de VHC immunitat activat SARS-CoV-2 adquisició. A

permetre una investigació de les interdependències entre preexistènciesng immunitat a HCoV i SARS-CoV-2 infecció, nosaltres ampliat elABCORA taló antigen matriu a incloure S1 proteïnes de tots quatre circulant  HCoV  (VHC-NL63,  VHC-229E, VHC-HKU1,HCV-OC43) (dgcomplementari Fig. 12a). Segons a la sevacapacitat a monitor anticossos a five coronavirus, nosaltres denominat l'assaig ABCORA 5.0 i entrenat i validat això activat el mateixcohorts com ABCORA 2.0 (Fig. 1). Per permetre la comparació directa amb ABCORA 2.0 ielutilitzar dels models de predicció de neutralització, nosaltresutilitzat el llindar-/Configuració d'anàlisi basada en SOC d'ABCORA 2.0 també per ABCORA 5.0. Basat activat ABCORA 5.0 mesures de formació cohorts I–III, nosaltres ideat dos aleatòria bosc-anàlisi basada models. ANCORA 5.4 inclòs únicament el 12 SARS-CoV-2 paràmetres i ABCORA 5.5 inclouend enaddició el  S1  HCoV mesures afegint fins a 24 paràmetres en total. En analogia ambABCORA 2.3, incorporació de VHC reactivitat a el modelera avantatjosa. ANCORA 5.5 proporciona la sensibilitat més alta iespecífiquesficiutat entre el anàlisi algorismes sondat ABCORA 5.0 (Suplementària Fig. 12b, Taula complementària 10).

Interdependències entreanticossos  reactivitat  a  el  quatre HCoV i SARS-CoV-2 mirall què nosaltres prèviament observat

per HKU1 amb a particularment alt correlació de IgM reactivitat de

SARS-CoV-2 i HCoV en pre-pandèmia particulars, particularment enaquellsambrecent  VHC  infecció  (SuplementàriaFig. 13). Les infeccions per VHC són freqüents però subjectes a l'estacionalitatielprevalença de individual VHC infeccions luctua41,42. En linia amb això, la prevalença de respostes al VHC mesurada per ABCORA 5.0 en locals sang donants en gener 2019 (N = 285), maig  2019   (N=288) i gener de 2020 (N=252) van variarconsiderablement  (Fig. 6). A habilitar a temps-controlat comparació de VHC reactivitat entre SARS-CoV-2-infectat i donants sans, nosaltres projectat sang donants des de maig 2020  (N = 672), Quan SARS-CoV-2 prevalença era estimat per sota del 2 per cent a Zuric, Suïssa43, per ABCORA 2.{{0}}/5.0 i s'han exclòs totes les mostres amb SARS-CoV-2 reactivitat. El residual maig 2020cohort (N=653)format a pandèmia, saludable donant control grup. Curiosament,Patrons de reactivitat del VHC el 2019 i el 2020 differed substancialment com valorat per un-manera ANOVA, amb el gener de 2020 mostrant elcomparativament més baix i maig 2020 el més alt IgA i IgGreactiuitat, quin maig indicar a més tard inici de un VHC epidèmia el 2020 en comparació amb el 2019 (tests t de maig de 2020 enfront d'altres grups scom en Fig. 6).

El més intrigant és que una anàlisi temporal comparet maigDonants sans 2020 amb mostra de pacients positius-2-SRAS-CoVleden April, maig, i juny 2020 (N = 65) revelat significansament més baixVHC reactivitat en SARS-CoV-2 positiu pacients (Fig. 7a). Això patró era també evident Quan nosaltres ampliat l'anàlisi per incloure elplecohortde SARS-CoV-2  persones infectades mesuradesamb  ABCORA  5.0 (N=389, mostrat des de març de 2020 fins afebrer  2021,  Suplementària  Fig. 14). En conjunt, aquests resultats endicat això pre-existents immune respostes a HCoV maig a a un cert grau de protecció contra la infecció per SARS-CoV-2iactivat.

Feu clic aquí per obtenir més informació sobre Cistanche

Fig. 5 Seguiment temporal evolució de anticossos respostes. un ABCORA 2.3 definició de seropositivitat en donants amb positiu RT-PCR confirmat SARS- Infecció per CoV-2 i data coneguda de RT-PCR (N = 369). Seropositivitat qualificacióSobre plasma mostreig temps puntpost-diagnòstic és representat. Gris zona ombrejada destacats el primer set dies des que positiu RT-PCR detecció. bLlei de poder model, amb temps des que RT-PCR com fixat efecte i individual com a efecte aleatori, estimant el decaïment de activitat d'unió d'anticossos basada en mesures d'ABCORA 2.0 en 1-4 punts de temps longitudinals en 120 individus en total251 mesurants. Porpra línies correspondre a el del model estimació iamb tons porpra àrees a el95 per centconfiança intervals. Anticòs la meitat-vides (t1/2 en dies) des de significatiu models són representat. Importància era valorat utilitzant Satterthwaite aproximació per a dos-costat t-prova activat el pendent paràmetres. c Llei de poder model, amb temps des que RT-PCR com fixat efecte i individual com a aleatòria efecte, estimant el decaïment de neutralitzant capacitat activat 251mesures des de 120 individus. Només individus amb Nou Testament50 > 100a els seus primer mesura eren utilitzat a estimació el la meitat-vida. El porpra la línia correspon a el model estimació i el porpra ombrejat zona a el95 per centconfiança intervals. Importància era valorat utilitzant Aproximació de Satterthwaite per a dos-costat t-prova activat el pendent paràmetres.

Fig. 6 Temporal i anual fluctuació en VHC reactivitat. Reactivitat a humana coronavirus (VHC-NL63, VHC-229E, VHC-HKU1, VHC-OC43)era comparat per ABCORA 5.0. Reactivitat en saludable sang donants des de 2019 i 2020 era comparat. Pre-pandèmia mostres inclòs: gener 2019 (N = 285), maig 2019 (N = 288), gener 2020 (N = 252). Mostres des de maig 2020 (N = 672) eren recollits durant el pandèmia en Suïssa. Només mostres sense SARS-CoV-2 específic reactivitat com definit per ABCORA eren inclòs (N = 653). Estrelles correspondre a nivells de importància de dos-costat t-proves comparant el indicat grups. Nivells de importància són corregit per el Bonferroni mètode per múltiples provant i indicat com segueix:        *p< 0.05/36, **p < 0.01/36,="">p< 0.001/36.Boxplots representar el següent: mitjana amb el mig línia, superior i més baix quartils amb el Caixa límits, 1.5x interquartil rangs amb el bigotis, i atípics amb punts.

Efectes de  VHC  immunitat en  SARS-CoV-2  infecció.  A

Exploreu més les interdependències amb la immunitat del VHC, noxtinvestigat si VHC respostes són enllaçat a l'evolucióde SARS-CoV-2 anticossos. A això al final, vam analitzar l'anticossosrespostes en plasma de 204 individus mostrejatsen 60 dies després del SARS-CoV-2Diagnòstic mitjançant un model de regressió lineal ajustat per edat, gènere i temps des de la RT-PCR positiva i el VHCreactivitat. A estratificar HCoV reactivitat a alt i baix Activitat HCoV, mitjanaregistre IMF-enemic eren defined per cadascun VHC ianticossosclasse. LogMFI-FOE superior al corresponentmitjana com a mínimt tres HCoV (HKU1, OC43, NL63, o 229E) en un específicc Ig classe eren classificat com tenint alt VHC activitatdins d'aquesta classe. En primer lloc, només reactivitats entre els mateixos antibodiclasse were explorat en el model (i.e., VHC IgG alt activat SARS- CoV-2 IgG). Vam observar una excepcióllyfortinterdependències per IgA i IgM respostes al SARS-CoV-2, quetotserensignificansamentmés altenindividusambalt VHCreactivitat (Fig. 7b). Això suggereix fermament que el VHC preexistent la immunitat pot proporcionare un avantatge en muntatge SARS-CoV-2 respostes.Interdependències entre IgG del VHC i SARS- CoV-2  Només es van observar IgG específiques per a la resposta S2. Curiosament, donant suport a aquesta troballa, HCV S2 helper resposteseren recentment trobat a estímul SARS-CoV-2 immunitat, enparticular Activitat d'anticossos S231. Per explorar si el SARS-CoV-2 IgG potconstruir activat recent VHC IgA i IgM respostes nosaltres Pròxim sondatsi IgM i IgA del VHC estan relacionades amb elevatada SARS-CoV-2 específiquesfic  IgGnivells.Tot i que no va ser evident cap efecte per a IgM, nosaltres va observar un senyalifino puc Associació de alt VHC IgA activitat activattotsquatremesurat  SARS-CoV-2  respostes  (Fig.  7c,  d). Això suggereix fortamentaixòrecent  VHC  infecció téa beneficial efecte en el muntatge de la resposta d'anticossos SARS-CoV-2ses.

En el Pròxim anàlisi, nosaltres sondat si pre-existents VHC immunitatté un impacte en la gravetat de la malaltia a COVID- 19. Amb aquesta finalitat, nosaltressondat HCoV immunitat en 80 hospitalitzats i no hospitalitzatsindividus infectat per menys de 30 dies (Fig.8a). Controlant per edat i sexe, vam trobar que les persones amb high pre-existents La reactivitat del VHC va ser significativaformigamés baix  DDSarequereixenhospitalització  (logísticaregressió  O = 0.16, IC del 95 per cent (0,04, 0.67), Fig.8b, figura suplementària 15). Una altra estratificatió deppacients per si ells requerit tractament a un UCI mostrat a redueix la probabilitat que el pacientts amb alt HCoV resposta tarifes requerides hospitalització amb intensiva cura (ordinal regressióO {{0}},36, IC del 95 per cent (0. 13, 0,96), Fig.8b, SuplementàriaFig. 15). Així, individus amb alt HCoV nivells tenia a 6Les probabilitats van reduir un 4%. de requerir hospitalització segons odinal rang anàlisi de regressió comparant hospitalitzat en regular barris, en UCI, ino hospitalitzard individus   (Fig.  8a,  b).   Col·lectivament,  aquests les observacions suggereixen fortament un efecte de protecció creuadaof VHCimmunitat en la configuració de la defensa immune contra el SARS-CoV-2.

Fig. 7 Efectes de pre-existents VHC immunitat durant SARS-CoV-2 adquisició. a Temps-coincideixen comparació de ABCORA 5.0 reactivitat per SARS-CoV-2i HCoV en saludable i SARS-CoV-2 infectat individus. Sana donants eren mostrat en maig 2020 (N = 653; blau). Plasma des de SARS-CoV-2     individu infectats era recollits entre Abril–juny 2020 (N = 65; vermell). Mireu Suplementària Fig. 14 perunanàlisi de el ple SARS-CoV-2 positiu cohort(N = 389). Gris caixes indicar valors a dalt el individual IMF-enemic tallar-offs per SARS-CoV-2 específic respostes per cadascun antigen. Estrelles correspondre a nivells de importància de dos-costat t-proves comparant negatiu contra positiu pacients. Nivells de importància són corregit per el Bonferroni mètode per a múltiples provant i indicat com segueix: *p< 0.05/12, **p< 0.01/12, ***p< 0,001/12 (IgG HKU1: p = 0.66, IgG OC43: p = 0.45, IgG NL63: p=3.3 × 10−04, IgG 229E: p = 1.6 × 10−05, IgA HKU1: p=1,8 × 10−03, IgA OC43: p=1,3 × 10−05, IgA NL63: p=1,4 × 10−07, IgA 229E: p=3.0 × 10−05, IgM HKU1: pàg = 3.3 × 10−08, IgM OC43: p = 4.3 × 10−03, IgM NL63: p = 1.1 × 10−07, IgM 229E: p = 2.7 × 10−02). Boxplots representar el següent: mitjana amb el mig línia, superior i més baix quartils amb el Caixa límits, 1.5x interquartil rangs amb el bigotis, i atípics amb punts. b Lineal regressió es mostren models el Associació entre SARS-CoV-2 i VHC senyals en 204 SARS-CoV-2 positiu pacients amb conegut dates de primer positiu RT-Detecció per PCR. Influències dins el mateix anticossos classe són investigat. El models eren ajustat activat edat (spline amb 3 graus de llibertat), gènere, temps des de llavors positiu RT-PCR (spline amb 3 graus de llibertat), i nivell de HCoV reactivitat. Mostres són dissenyat a port alt VHC reactivitat si ells mostrar ABCORA 5.0 VHCregistre IMF-enemic valors més alt que el corresponent mitjana en a almenys 3 HCoV mesures (HKU1, OC43, NL63, o 229E). Les corbes corresponen a el del model estimació i ombrejat àrees a el95 per centconfiança intervals. p-valors eren obtingut per corrent a dos-costat Estudiant t-prova a la paràmetre associats amb VHC reactivitat en el lineal regressió. c Lineal regressió model mostrant el Associació entre SARS-CoV-2 IgG i el VHC IgA senyals. Corbes correspondre a el del model estimació i ombrejat àrees a el95 per centconfiança intervals. p-valors eren obtingut per corrent un dos-costat Estudiant t-prova activat el paràmetre associats amb VHC reactivitat en el lineal regressió. d Lineal regressió model mostrant el Associacióentre els senyals IgG del SARS-CoV-2 i IgM del VHC. Les corbes corresponen a l'estimació del model i les àrees ombrejades als intervals de confiança del 95%. valor ps eren obtingut per corrent a dos-costat Estudiant t-prova activat el paràmetre associats amb VHC reactivitat en el lineal regressió.

Discutiuió

Definició de  SARS-CoV-2  immunitat postvacunació ila infecció és d'importància immediata44–46. Desxifrant anticoscorrelacionade SARS-CoV-2  proteccióiseguiment vacuna la capacitat de resposta són tasques difícils per endavant. La magnitud ai longevitat de protectora anticossos respostes a natural infecció i diferents vacunes necessitat a ser examinat a entendreparàmetres això forma protectora respostes i orientar les decisions sobre la revacunació en els que no responen i la immunització againstnovel·la sorgint SARS-CoV-2 variants47. De la mateixa manera, crear significa distingir serològicament entre infecció de novo, reinfecció,i vacuna respostes, els seus durabilitat i fracassos voluntat romandrecrític per clínica diagnòstic.

Aquí nosaltres demostrar el alt utilitat de multi-paràmetre ser- o perfilar per abordar qüestions clau en defining  SARS-CoV-2 immunitat.  Simultàniadeteccióde respostes d'anticossos a a rangde SARS-CoV-2  antígensidiferents  Igclassesamb ABCORA  seroprofilingva oferir una imatge completa Estat serològic del SARS-CoV-2 en un sol examen, que aproxn ser útil per al diagnòstic clínic per determinar la presència d'eof reinfecció,  definereinfecció,  irespondreavacunació. Computacionalmodelatgetambépermèspredir neu de plasmarealització capacitat des de ABCORA resultats, habilitant aintegral valoració de SARS-CoV-2 anticossos dinàmiques i els seus interactuar ambVHC respostes. Nosaltres estudiat dos ABCORA assaigversions tha tots dos mesurat VHC reactivitat al costat el  12 SARS-CoV-2 paràmetres.ANCORA 2 incloïa l'antigen S1 deHKU1. ANCORA 5 inclòs S1 de tots quatre circulant VHC.Notablement, computacional models això inclòs el VHCmesures permès a més alt precisió en determinant SARS-CoV- 2 seropositivitat, altail·luminació interdependències entre HCoVi SARS-CoV-2 respostes que s'han de resoldre.

Gravació reactivitat en contra tots quatre HCoV en SARS-CoV-2no infectat iinfectatindividusnosaltresobservatintrigantassociacions. Uninfectatindividusmostratmés alt  VHCreactivitat en comparació amb les persones infectades que suggereixenacontribució de VHC immunitat a d'hora defensa en contra SARS-CoV- 2. La immunitat contra el VHC també pot tenir efectes positius sobre el SARS-CoV-2infecció. En acord amb altres informes, nosaltres assenyalat aalimentació creuada de SARS-CoV-2 i respostes del VHC en la infecció per SARS-CoV-231,48 amb individus amb alt VHC reactivitat desenvolupar-obertura més alt SARS-CoV-2 anticossos nivells. La majoria notablement, preexistent VHC immunitat tenia un impacte activat malaltia gravetat en la nostra cohort. SARS-CoV-2 infectat individus amb baix Reactivitat del VHC tenia a més alt probabilitat de requerint hospitalització.

Mentrenostreestudiarrespostes d'anticossos només mesurades, apotencialprotectoraefectede HCoVimmunitat contra el SARS-CoV-2 adquisició hauria de no ser vistcomrestringit a activitat d'anticossos. Anticossos i la immunitat cel·lular poden ser rellevantsi actiu en concert31,49–51. Alternativament, la resposta d'anticossossesmalleugerit en el present estudiar maig únicament document recent VHC infección i lliurar a substitut mesura de altres protectoraVHC respostes. El enllaç entre més alt VHC  i SARS-CoV-2 reactivitat en individus infectats és especialment intrigant. El més fort efectes eren vist per IgM i IgA HCoV respostes, suggestant això recent VHC immunitat proporciona un d'hora estímul a Desenvolupament d'anticossos SARS-CoV-2ent.  Tant siaixòésdeguta respostes de cèl·lules B de reacció creuada sobre les qualsel  SARS-CoV-2immunitat construeix activat i madura o si creu-reactiu T ajudantactivitatsjugarun paper dominant com es proposa31  serà important a resoldre en endavant-arribant estudis. El paper exacte i timing de HCoVrespostesinfluint  SARS-CoV-2  anticossosrespostes també romandre a ser defined. D'hora baix-affinitat Respostes al HCoV maig tenir a positiu impacte activat el desenvolupament del SARS-CoV-2 immunitat formant una memòria immune sobre la qual a construir, mentre que amplificatió de no-protectorareactiva creuadaVHC ancossos segons a el antigènic pecat principi maig tenir efectes negatius30.

Encara queAssociacióestudis com el nostre no poden formalment define causalitat, el implicacions de nostre les troballes són evidents: Anteriorimmunitat a VHC maig protegir a alguns extensió en contra SARS-CoV-2 adquisició, imaig proporcionar a estímul a el desenvolupament del SARS-CoV-2 específiquesfic immunitat i amb això més baix el risc pergreuhospitalització.  A  Modestefecte protector del HCoVimmunitat ho faria ser a plausible explicació per el altproporciód'asimptomàtic i lleu SARS-CoV-2 infeccions52,53. Fins i tot més intrigants són les perspectives de futur. Com els altres i nosaltrestenir mostrat, SARS-CoV-2 i VHC immunitat a infecció sónsovint no llarg-durador (Fig. 5, Suplementària Fig. 11)5,54, una limitacióaixò  SARS-CoV-2  vacunesesperançaasuperar. Hauria SARS-CoV-2  respostesentornproporcionarun grau de defensa contra el VHC infecció, ample protecció en contra coronavirus pot estar en rcadascun.

Fig. 8 Impacte de HCoV immunitat activat COVID-19 gravetat. a Associació de hospitalització estat (no hospitalitzat (N = 16); hospitalitzat no en UCI(N = 42); hospitalitzat en UCI (N = 22)) i alt o baix IgG HCoV reactivitat. Rectangle mides correspondre a el proporció de inclòs pacients. b Influència de HCoV reactivitat (baix/alt) activat el hospitalització estat en a subconjunt de N = 80 pacients, com estimat amb possibilitats ràtios, en un ordinal regressió (amb nivells = no hospitalitzat (N = 16); hospitalitzat no en UCI (N = 42); hospitalitzat en UCI (N = 22)) i a logística regressió (referència = no hospitalitzat(N = 16); contra tots hospitalitzat (N = 64)). Dades és presentat com paràmetre estimació i la seva95 per centcondència interval. Nivell de significació de el paràmetre és obtingut amb a dos-costat t-prova (p-valor és mostrat si <>d'una altra manera indicat com n.s.).

jomètodes

Humans exemplar. Sèrum i es van recollir mostres de plasma abans i després de l'emergència

SARS-CoV-2 aSuïssa (pre ipost-febrer 2020, respectivament) ereninclòs. No pacient matrícula era realitzat per el present estudiar. Totsexperiments implicant mostres des de humana donants eren realitzat amb el vistiplau de les respostesible locals ètica comitè (Kantonal Comissió Ethic) Zuric,

Suïssa (BASEC núm 2020-01327, 2020-00363; 2021-00437; 2020-00787), per el disposicions de el Declaració de Hèlsinki i el Bona clínica Pràctica directrius de la Conferència Internacional sobre Harmonització. Mostres eren obtingut des de les fonts següents: (i) Donació de sang de Zuricserveies (ZHBDS): Anònim saludable adult plasma des de pre-pandèmia tempspunts (gener 2019, maig 2019,i gener de 2020) i des de la primera onada de la pandèmia a Zuric, Suïssa (maig 2020) eren proporcionat per el ZHBDS intern dipòsit de sèrum i consent per això estudiar era renunciat per el ètica comitè(BASEC 2021-00437). (ii) Anònim mostres sobrants del diagnòstic rutinari a el Institut de Medicina Virologia, Universitat de Zuric, el Infants Universitaris Hospital Zuric, i el Cantonal Hospital Winterthur (BASEC núm2020-01327, 2021-00437). Es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els participantsla mostra del qual was presa durant el pandèmia a el Universitat HospitalZuric (BASEC 2020-01327). Per a mostres de pandèmia d'altres hospitals and prepandèmia mostres consentiment era renunciat per el ètica comitè. (iii) Assistencialels treballadors amb RT-PCR confirmen que estan infectats per SARS-CoV-2ió participant en a estudiar al Universitat Hospital Zuric (BASEC 2020-00363). Escrit informat el consentiment era obtingut des de tots participants. (iv) Mascle plasma donants participant en un SARS-CoV-2 plasma teràpia estudiar realitzat a l'Hospital Universitari de Zuric(CPT-ZHP, Swissmedic 2020TpP1004; BÀSIC 2020-00787). Escrit informates va obtenir el consentiment per a la investigació de tots els participants. Tell informes de tots humana i patiNou Testament dadescompleix ambelSTROBE declaració. Pre-pandèmia (SARS- CoV-2 negative, N = 825) i confirmed SARS-CoV-2 positiu mostres (N = 389)eren dividit a formació i validació cohorts (Suplementària Taula 3).          Dades demogràfiques disponibles data activat gènere, edat, temps des que positiu RT-PCR issímptoma inici, i hospitalització estat són reportat en Suplementària Taula 11.El SARS-CoV-2 formació cohort (N = 175) inclou plasma recollit durantinfecció (N=114) i convalescència (N=61). Per donor només un mostreig tempspunt va ser inclòs, longitudinal mostres de donants inclòs en el formació cohort eren no inclòs en el validació cohort per comprovar la independència quanvalorant el sensibilitat i l'especificitat dels diferents mètodes de diagnòstic. El   SARS-CoV-2 validació cohort (N = 214), compresos plasma recollits durant la infecció (N = 90, un moment de mostreig per donant) i convalescència

(N = 124, 79 pacients convalescents amb 1-4 mostres longitudinals). Temps múltiplepunts de convalescent pacients eren inclòs en el conjunt de dades de validació per capturar a ampli espectre de waning anticossos títols. Una secció transversal anàlisi era basat activatmostres amb conegut temps des que positiu RT-PCR (N = 369) o conegut temps des del símptoma inici (N = 333), ambdues incloses les observacions de l'anàlisi longitudinal.Tots dos, temps des de la RT-PCR positiva i tempsdes que inici era conegut per330 mostres, amb un temps mitjà de tres dasí entre símptoma inici i RT-PCR(1st–3rdquartil: 1–7 dies). Es va basar l'anàlisi longitudinal de la reactivitat dels anticossos en 251 observacions de 120 convalescent pacients amb conegut temps des que positiu RT-PCR i temps des de l'aparició dels símptomes. Neutralització was mesurat activat 467 SARS-CoV-2 RT-PCRpositiu mostres (N = 369 amb conegut temps des que RT positiu-PCR, N = 333 amb conegut temps des que símptoma inici).

Hem avaluat encara més la reactivitat creuada ABCORA 2.0 i 5.0 a l'esquerrat-acabat plasmaa partir de diagnòstics rutinaris en un grup de control prepandèmic with documentat, VHC recent infecció (Formació II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63      (N = 22), 229E (N = 9)). Circulant VHC és comunament només projectat per enhospitalitzats, infeccions respiratòries greus i immunodeprimits individusque habitualment es sotmeten a un germàad projecció per respiratori infeccions. Per tant, en aquest pacient grup, tots dos reduït anticossos reactivitat degut a immune comprometent oVHC elevat antibody reactivitat degut a recent o recurrent VHC infecció maigocorren. Com aquest grup és diagnòsticestèticament rellevants nosaltres considerat això prudent a incloure això cohort com Formació II dades conjunt a verificar si creu-reactivitat amb SARS-CoV-2 enABCORA es produeix en aquest entorn. Les dades de Training II no es van incloure en el llindar definició a no acabat-representar individus amb malaltia greu. Aquest infectat pel VHCgrup mostrat en general més baix reactivitat amb SARS-CoV-2 que plasma desaludable adults però important mostrat no indicació de reactivitat creuada (Fig.1a, b). Mostra de pandèmiales des de anònim sang donants amb desconegut SARS-CoV-2estat recollits en maig 2020 (N = 672) eren no inclòs en formació i validació cohorts.

Reactius i línies cel·lulars. El seu-tenvellit SARS-CoV-2-derivat antígens (receptor

domini d'enllaç (RBD), subunitat S1 (S1), subunitat S2 (S2), nuclieocàpsida proteïna (N)) i S1 de tell quatre circulant HCoV (HKU1, OC43, NL63, 229E) eren comprat de Sino Biological Europe GmbH, Eschborn, Alemanya (SuplementàriaTaula 12). Fonts, característiques específiques i concentració d'anticossos de detecció i control i sèrums utilitzats per ABCORA i neutralització tests són enumerat en Taula complementària 13. 293-Les cèl·lules T es van obtenir de la American Type Culture Collection(ATCC CRL- 11268)55. HT1080/AS2cl. 14 cèl · lules33 eren amablement proporcionat per P.Bieniasz, Rockefeller Universitat, NY. Tots dos cel·la línies eren culte en DMEMcontenirng10 per centFCS.

Disseny de multiplex taló assaig ABCORA 2.0. Nosaltres establert dos taló-basatSARS-Co multiplexatV-2 immunoassaigs (ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0) aixòinclou una sèrie de SARS-CoV-2 i HCoV antígens (Sino Biològic EuropaGmbH, Eschborn, Alemanya, Taula suplementària 12). Quatre antig SARS-CoV-2ns- RBD, S1, S2, i N - eren inclòs en tots dos ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0.ANCORA 2.0 inclòs en addició S1 de VHC-HKU1, iABCORA 5.0 inclòs S1de tots circulant HCoV (VHC-NL63, VHC-229E, VHC-HKU1, VHC-OC43). En breu, individual MagPlex perles (Luminex Corporació, Austin, TX)    amb unique fluorescent taló regions eren escollit per cadascun antigen, perles erenacoblats i mescles de perles acoblades a antigenserenincubat amb pacient plasma en a 96-bé placa conjunt-amunt. ElMitjana Fluorescent Intensitat (IMF) de plasma lligat a perlesantibodies era mesurat utilitzant a FlexMap 3D lector (Luminex Corporació,Austin, TX). Nosaltres dissenyat el assaig a plefill el següent criteris: (i) alt velocitat-cificiutat, sensibilitat, i reproductibilitat, (ii) flexible multiplex disseny això permet senzill addició i/o alteració de antígens; (iii) ample dinàmic rang;  (iv) opcional quantificatió de anticossos respostes; (v) opcional gravació deanti-cossosrespostes als HCoV i (vi) ús en rutinane diagnòstics i recerca.

Vam triar un estèric orientació captura via anti-Seva anticossos a assegurar a Presentació d'antigen homogeni. Per tant, carboxilat MagPlex perles (Luminex

Corporació, Austin, TX) eren acoblat amb anti-Seva anticossos (Sino Biològic

Europa GmbH, Eschborn,Alemanya, taula suplementària 13) i després acoblat amb His-etiquetatantígens utilitzant bio-Plex Amina acoblament (bio-Rad LaboratorisAG, Cressier, Suïssa) segons el fabricant iinstruccions i comdescrit56.

La valoració de sèrum/plasma es considera en general l'estra més precisategy aretriVigília quantitativa informació activat anticossos reactivitat. malgrat això, en diagnòstic utilitzarproves idealment hauria de lliurar (semi)-quantitativa informació des de a sèrum únicdilució a permís un rendiment suficient. Les condicions de l'assaig finalitzats van cobrir a 2-log MFI en totes les combinacions d'antigen-Ig sondades (figura suplementària 1).Ratificant el validesa de utilitzant a solter plasma dilució, nosaltres confirmed això plasmades de SARS-CoV-2 positiu pacients i pre-pandèmia SARS-CoV-2negatiules mostres de plasma mostren una dosi-resposta òptima corbes acabat a ample plasma diluciórang (Suplementària Fig. 1f). És importantíssim, a 1/100 dilució de plasma era en totscasos Tanca al màxim senyal, subratllant que el plasma augmentaLa concentració no augmentaria la intensitat del senyal sinó que augmentariaer decreixentsignals degut a prozona efectes (Suplementària Fig. 1f).

Màxima anti-Seva anticossos carregant era aconseguit a 5 µg anticossos per milionsperles (Suplementrada Fig. 1c) i utilitzat com a estàndard acoblament condició. En el finalprotocol,Es van incubar cinc milions de perles magnètiques acoblades a anticossos anti-His Seva-etiquetat antígens diluït en PBS a una concentració de 320 nM.Anticossos secundaris marcats amb ficoeritrina (PE) específics de IgG, IgA, o IgM erenutilitzat com a anticossos detectors (complementariTaula 13). Qualitat control de elantigen loafegint era realitzat per incubant el perles amb monoclonalanticossos dirigits al CoV-d corresponentderivada antigen com detallat enTaula complementària 12. L'anàlisi es va realitzar amb intel·ligènciah el FlexMap 3D lector(Corporació Luminexn, Austin, TX) amb el adquisició de a almenys 50 perles perregió de perles. Resultats are gravat com IMF per taló regió.

Diverses mesures de control van ser installed a comprovarinter-i intra-assaigrendiment. Per determinar un assaig baix a-assaig variabilitat, gran lots deindividual carregat d'antigen beads eren preparat i congelat en alíquotes fins que utilitzat a-20 grauC a eludireldecaïment de el antigen-acoblat perles (figura suplementària 1). Es van barrejar perles individuals acoblades el dia de la prova per yield el requerit antigencòctel de comptes. Els còctels contenien 60 perles per taló regió per µl. En addició ales regions de perles SARS-CoV-2 i VHC, cada còctel incloïa un buity regió de perles (no antigen acoblat) a control per no especificatfic enquadernació. Qualitat control i validació procediments per el FlexMap 3D instrument eren fet activat cadascun dia delexperiment segonsordenant aelfabricant's instruccions. El variabilitat de el assaigera analitzat com segueix56: plasma mostres des de 20 RT-PCR confirmed SARS-CoV- Es van agrupar i provar 2 pacients infectatsver a rang de set dilucions en 31  diferent titracions realitzat activat 10 diferents dies (Suplementària Fig. 2). A través detots antígens i Ig classes, senyals eren retinguts acabat el prova període de 25dies post acoblament de perles. Coeficients de variació (CV) del senyal d'enllaç a través de titracionsde la combinació de classe 12 antigen-Ignacions demostrat baix (rang: 0.010–0. 128, mitjana  0.059, figura suplementària 3c, d, taules complementàries 1, 2). El mateix dia i el dia a diavariabilitat pàgvagava baix i comparable (Suplementària Fig. 3e, f). Baix a 1/ 100 plasma concentració, CV augmentat notablement (Suplementària Fig. 3d),         definint 1/100 com la concentració més altaactivat (més baix plasma dilució) a ser provat en el assaig. Així, es va definir una dilució de plasma 1/100 com a bàsicadilució per projecció plasma en ABCORA 2.0 Quan a qualitativa (és a dir, presència o absència de SARS-CoV- 2anticossos específics) o la lectura semiquantitativa (és a dir, la intensitat del senyal MFI).rrequerit.

Totes les mesures ABCORA eren dereblat des de solter mesures tret queva dir el contrari. Per mesurar el SARS-CoV-2 específicc anticossos en pacient plasma,inactivat per calor plasma (1 h a56 grausC) era diluït 1/100 en PBS-BSA1 per centtret ques'indica el contrari. 50 µl de dilucióed plasma eren incubat amb 50 µl de el ABCORAantigen taló còctel per 30 minuts a habitació temperatura en 96-plats ben rentats tres vegades amb PBS-BSA 1 per cent, i incubat en reaccions separades wila ficoeritrina (PE)-etiquetat detector anticossos per IgG, IgA o IgM a a ficoncentració final de 1/500 en PBS-BSA 1 per cent. Aquesta dilució es va definir prèviament pervaloració dels anticossos del detector per produir senyals MFI òptimes. Després de 45 minutes deincubació a temperatura ambient, les perles es van rentar tres vegades amb PBS-BSA1 per centi analitzat en 96-bé plaques al lector FlexMap 3D (Luminex Corporation, Austin, TX). A mínim de 50 taló llegeix per antigen era adquirit.

Per controlar els anticossos de reacció creuada genuïnaies, cadascun plasma mostra eraavaluat amb beads sense antigen (buit taló control) en combinació quincada detector aanticos. Per anàlisi, crua IMF valors eren transformat a IMF-enemic a correcte per fons enquadernació.Vam establir la mitjana de perles buides MFI-FOE per a IgG, IgA i IgM de donants sans pre-pandèmia (N=1016) i set la mitjana IMF-enemicmésDesviació estàndard 4x com a llindar per al control de taló buit.En absolut nivells, aquests llindars ascendit a IMF-FOE 41,58 (IgG), 55,91 (IgA), i 269,47 (IgM).Mmesuraments per quin el buit taló control gravat valors above això llindar eren considerat invàlid i repetida.

Cada placa de pou 96-d'anàlisi Luminex es va configurar per contaen el mateix conjunt decontrol mostres, és a dir 7 sèrie 4-plegar dilucions d'un control positiu del SARS-CoV-2donant piscina (N = 20 donants, començant dilució 1/100, Suplementària Fig. 1f) i un pre-pandèmia saludable donant piscina (dilució 1/100, N =20 donants, complementarisFig. 1f). Aquests controls positius i negatius permeten controlar el rendiment de l'assaigncea través de mesures independents i, a més, habilitarretrospectivaestandardització contra controls externs si calded.

Definició de SARS-CoV-2 seropositivitat en ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0. Adistingir SARS-CoV-2-específics dels anticossos de reacció creuada, defined IMF- Llindars FOE per a cadascun dels 12 antígens SARS-CoV-2 i la combinació de classes d'Igs basat en anticossos plasmàtics reactivitat en formació cohorts (Suplementària Taules 3 i 4). Aquests incloïen donant sans pre-pandèmia plasma (Formació I, N = 573),donants amb recent VHC infecció (Formació II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63 (N = 22), 229E (N=9)) i donants amb infecció confirmada per SARS-CoV-2 (Formació III, N = 175). Llindars eren conjunt a minimitzarfalsos positiusmentre assegurant sensibilitat per SARS-CoV-2detecció d'anticossos i arribar a unespecificitat general a dalte99 per centi inclòs nivells per frontera-línia reactivitat per IgGRBD,IgG S1, i IgG N a permetre també Modest anticossos reactivitat a aquests antígens to ser examinat. IMF-enemic llegeix de individual mostres eren transformat avalors de tall de senyal (SOC) (MFI-FOE/llindar). SOC valures són utilitzat perculscantar positiu reactivitat per cadascun individual antigen-anticossos classe combinació, amb SOC > 1 que denota reactivitat positiva i SOC < 1 que denota reactivitat negativa.Quan configuració individual llindars, això haver de ser considerat això per cadascun de el 12 sondat activitats es poden produir reactivitats creuades. Amb 12 paràmetres SOC individuals enregistrat, spe generalcificiutat voluntat disminuir si cap positiu SOC independentment suffices a taxa a mostra en general com SARS-CoV-2 anticossos positiu. A exemplificar:Assumint respostes independents, fins i tot una alta especificitat del 99 per cent per a cada antigen sumarà to una especificitat general baixa del 88 per cent en tot l'assaig. Vam requerir així for SARS-CoV-2 positiu trucant en ABCORA 2.0 a mínim de dos específiquesficiutats a arribaractivitat a daltelllindar. Els valors SOC combinats utilitzats per definir el globall'estat serològic d'una mostra determinada es detalla a la taula complementària 5. Per a IgG RBD, S1, i N,per a la qual també vam registrar l'activitat SOC fronterera, vam permetre acombinació d'1 reactivitat antigen SOC > 1, la segona reactivitat SOC > límit. El final llindar i positiu anomenada criteris permès per diferenciació de parcial (d'hora seroconversió amb només IgM i IgA respostes) a ple ser-          conversió (incjugant IgG respostes) (Suplementària Taula 5). En addició, els criteris denoten mostres amb reactivitat feble i/o reactivitat indeterminada(Taula complementària 5).

Per facilitar la comparació entreeen ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0 el mateixllindar es van utilitzar els límits per a ABCORA 5.0. Hem escollit no crear un tall específicllindars per a la reactivitat dels anticossos del VHC com an precís definició de a negatiuLa resposta és complexa a causa de l'exposició generalitzada als HCoV i considerablereacció creuada d'anticossostivitat entre ells. VHC respostes eren malgrat això inclòs a les estadístiquescal anàlisis com IMF-enemic valors.

Definició de SARS-CoV-2 seropositivitat utilitzant logística regressió classificació.

Classificatió de seropositiu contra seronegatiu mostres en ABCORA 2. 1 es va realitzarutilitzantlogística regressió. El idèntics formació i validació dades utilitzat per el establiment de ABCORA 2.0 eren utilitzat. Com el ABCORA 2.0 reactivitats d'unió estaven altament correlacionats, vam incloure les variables següents al model (complementari Fig. 6a): el significar valor de totes les respostes IgG MFI-FOE (RBD, S1, S2, N), el significar valor de les respostes IgA MFI-FOE contra RBD, S1 i S2, i la mitjana valor de les respostes IgM MFI FOE contra RBD, S1 i S2. Resposta IgA i IgMs a N es van excloure perquè no s'agrupaven amb les altres respostes del mateix Ig classe (Suplementària Fig. 6a). La regressió logística es va utilitzar per estimar i predir la probabilitat d'una mostra donadae a ser positiu (p) com descrit en equació (1).

Paràgrafmetres  0, G, A, i  M eren estimat activat el formació conjunt de dades. A mostra aleshores es va definir com a positiu si la seva probabilitat prevista de ser positiva era superiora llindar c/. Aquest llindar es va definir per obtenir una especificitat d'almenys 0,99 i sensibilitat màxima al conjunt de dades d'entrenament (de la mateixa manera que to c per el aleatòria bosc). Enresum, en ABCORA 2. 1, qualsevol mostra nova es defineix com a seropositiva si la seva probabilitat de ser seropositiu segons l'estimació de la regressió logística és superior a c/. Analitzem nosaltresre realitzat en versió Rn 3.6.3. Definició de SARS-CoV-2 seropositivitat utilitzant aleatòria bosc classificació.  Classificació de seropositius versus seronegatiu mostres enelcontext de ANCORA 2.0 i ABCORA 5.0 va ser realitzat utilitzant a aleatòria bosc enfocament següent elconfiguració bàsica de random boscos com descrit en57. El aleatòria bosc mateix era construït d'un conjunt de 1000 arbres de classificació utilitzant respostes MFI-FOE (IgA, IgG,iIgM contra RBD, S1, S2,N). El probabilitat de a mostra ser positiu com pre-  dictada pel bosc aleatori és la mitjana de la probabilitats acabat tots 1000 arbres. Finalment, es defineix una mostraned com positiu si la seva probabilitat de ser positiu és a dalt a llindarld c, quin és defined com a obtenir a específiquesficiutat de a almenys 0.99 i a màxima sensibilitat al trening conjunt de dades. En resum, cap nou mostra és defined comseropositiu si its probabilitat de ser seropositiu com estimat per el aleatòriabosc està per sobre del thresguard c. Nosaltres realitzat a sèrie de aleatòria bosc anàlisis que va considerar només les respostes SARS-CoV-2 o SARS-CoV-2 i el VHC   respostes en ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0: ABCORA 2.2 i ABCORA 2.3 erenentrenat i utilitzat per predicció activat ABCORA 2.0 dades i inclòs només SARS-  CoV-2 respostes o SARS-Respostes CoV-2 i HKU1, respectivament. ANCORA 5.4 (només respostes SARS-CoV-2) i ABCORA 5.5 (SARS-CoV-2 i VHCrespostes) eren entrenat activat ABCORA 5.0 dades. Detalls sobre la inclusió de dades per al respectives models són enumerat en Suplementària Taula 3 i Suplementària Taula 10. Les anàlisis es van realitzar a la versió R 3.6.3 mitjançant packages randomForest i     guardabosques58–61.

Per garantir la robustesa de les nostres troballes, vam realitzar un sensitivitat anàlisi per aleatorització els conjunts de dades d'entrenament i validació mitjançant una validació creuada 5-foldmètode. Tots dos conjuntsde positiu i negatius mostres eren dividit a five igualparts i nosaltres defined això manera five validació conjunts (consistent de el i-th conjunt depositius iel i-th conjunt de negatius, i = 1.5). El descans de el dades era utilitzat performació el ABCORA 2.3 bosc a l'atzar. Per a cada conjunt de validació, l'especificitat isensibilitat de el aleatòria bosc eren calculat activat el formació, validació, i formaciómésvalidació conjunts (Suplementària Taula 6).

Validació i verificació utilitzant extern controls. Nosaltres utilitzat el Anti-SARS-  Panell de verificació de CoV-2 per a assaigs de serologia (NIBSC codi: 20/B770, NIBSC) averifiqueu el rendiment de la prova ABCORA 2.0 i ABCORA 2.3. Sèrumsamplesde el verificatió panell mesurat per ABCORA 2.0/2.3 tal com es descriu i resultatsen comparació amb els resultats dels assajos disponibles comercialment informats pel NIBSC (32 i Taula complementària 7). Nosaltres furtella verified el sensibilitat de el ABCORA 2 prova en detectant SARS-CoV-2 infecció en una comparació directa amb comercialproves. Antibodi estat de plasma des de SARS-CoV-2 positiu individus (N = 171) va ser analitzatd amb el següent prova sistemes: Inclòs prova sistemes objectiu el N proteïna (Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 (Roche Diagnostics GmbH)), la regió RBD de el S proteïna (Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 assaig S (Roche Diagnostics GmbH)),i el S1 subunitat (EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG)) (ComplementàriaTaula 8). Tots els assajos es van realitzar segonsel fabricant'instruccions s en el diagnòstics unitat de el Institut de Medicina Virologia, Universitat de Zuric, Suïssa.