Quina diferència hi ha entre el Cistanche de cultiu salvatge i el cistanche cultivat artificialment sobre l'activitat que millora la immunitat

Contacte: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Abstracte:

Objectiu:Comparar els efectes de millora immune de la cistanche en creixement salvatge i els polisacàrids cistanche cultivats artificialment del cistanche (a partir de llavors: el WCDPS i ccDPS respectivament).

Mètodes:Diferents dosis (baixes, mitjanes i altes) de WCDPS i CCDPS i ovalbumin (OVA) van ser immunitzades per via subcutània amb ratolins ICR, IgG d'anticossos específics de L'OVA i els subtipus d'anticossos IgGl i IgG2a van ser detectats per ELISA, i pel mètode MTT. Activitat de proliferació de limfòcits específics de LOV, citometria de flux per detectar el nivell d'expressió de les cèl·lules CD4 + T i els limfòcits CD8 + T.

Resultats:Tant el WCDPS com el CCDPS poden augmentar significativament els nivells d'expressió d'anticossos específics de l'OVA IgG i la mecanografia d'anticossos IgG1 i IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS i CCDPS pot promoure significativament la proliferació de limfòcits específics de l'OVA, i la diferència entre la mateixa dosi no és estadísticament significativa (P> 0,05); El WCDPS i el CCDPS també poden augmentar significativament el percentatge de sub-contingut de les cèl·lules CD4 + T i CD8 + T (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), el WCDPS i el CCDPS no van tenir cap efecte sobre el pes dels ratolins immunitzats.

Conclusió:Tant el WCDSP com el CCDPS poden millorar significativament les respostes immunitàries humorals i cel·lulars específiques de l'OVA, i no hi ha diferències estadísticament significatives entre els dos, i tenen una bona seguretat.

Paraules clau: cistanche; polisacàrids de cistanche; ovalbumin; adjuvant

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),Cunyun i Dayun és una planta herbàcia paràsita de les Lydanaceae durant molts anys. És un rar i preuat material medicinal xinès. Els seus ingredients principals inclouen polisacàrids de cistanche, compostos de glicosids fenil·losoïdals Cistanche, àcids orgànics, alcaloides, etc.(4), tenen múltiples funcions com ara nodrir l'essència i la sang, ajudar al yang i tonificar el ronyó, i alleujar l'envelliment(5). A causa de l'altíssim valor medicinal del cistanche, la sobreexplotació d'espècies silvestres està a punt de l'extinció, i la cistanche cultivada artificialment ha tingut èxit. Els investigadors nacionals i estrangers han fet una gran quantitat d'investigacions sobre els components químics i els ingredients actius de cistanche en creixement salvatge i cistanche cultivat artificialment, però hi ha pocs informes sobre la comparació de polisacàrids cistanche silvestres i cultivats de l'activitat adjuvant de cistanche (WCDPS / CCDPS). Un gran nombre d'estudis han demostrat que els polisacàrids vegetals del cistanche com a adjuvant poden regular la resposta immunitària del cos. Molts investigadors han utilitzat la medicina a base d'herbes xinesa com a adjuvant vacuna i han fet un bon progrés ".

Aquest estudi es basa en la recerca prèvia (6) per comparar laimmuno-potenciadoractivitats del WCDPS de Xinjiang i el CCDPS. Principalment a través d'experiments d'immunització amb ratolins de ratolí, diferents dosis de WCDPS i CCDPS es van immunitzar subcutàniament amb OVA en ratolins ICR, i els seus efectes sobre el nivell d'humor.Immunitati la immunitat cel·lular induïda per LVA després de la immunització. Compararcistanche de creixement salvatgeicistanche cultivat artificialmentL'activitat de millora immune dels polisacàrids en els cítrics pot proporcionar una referència per al millor desenvolupament i utilització de cistanche cultivat artificialment a Xinjiang.

Materials i mètode

Materials experimentals:

Creix salvatgement cistanche i cistanche cultivat (disponible comercialment). RPMI 1640 mitjà de cultiu va ser comprat a GIBCO; El sèrum boví fetal va ser comprat a Israel Bioind; Anticossos citomètrics de flux: PE rat-anti mouse CD3, APC rat-anti mouse CD4, FITC rat-anti mouse CD8a es van comprar a l'empresa nord-americana BD, el producte Sigma de proteïna clara d'ou (Ovalbumin, OVA), IgG de cabra etiquetada amb peròxid de rave picant, IgG, IgGl i IgG2a a Southbiotech, EUA. Els altres reactius químics experimentals són tots reactius analítics domèstics.

Animals d'experimentació:

Els ratolins femelles ICR de grau net (6-8 setmanes, 18-22 g) van ser comprats al Centre Animal Experimental de la Universitat Mèdica de Xinjiang. Els animals van ser mantinguts a la sala d'animals del nostre laboratori, i l'experiment es va iniciar 7 dies després que els animals fossin aclimatats.

Preparació del WCDPS i ccdps:

La referència [17] utilitza el mètode d'extracció d'aigua i precipitació d'alcohol. Els breus passos són els següents: Prendre Xinjiang sec cultivat i pols de cistanche salvatge, afegir 10 vegades el volum de gelea de petroli i etanol absolut a ultrasons durant 1 h; després de la filtració de succió, retenir el residu medicinal i sec, afegir 10 vegades el volum d'aigua destil·lada 37T Ultrasò dues vegades, centrifugació a 4 000 r / min durant 10 min, combinar els supernatants, evaporar-se i concentrar-se rotatius, i precipitar durant la nit amb alcohol; després de la filtració al buit i l'assecat, s'obté l'extracte cru en pols; El mètode Savage (8) elimina proteïnes del WCDPS i el CCDPS. El contingut de polisacàrids de cistanche en WCDPS i CCDPS determinat pel mètode d'àcid ceba-sulfúric va ser del 76,82% i 59,58%, respectivament.

Immunització del ratolí i recollida de sèrums:

Els ratolins femelles de 6-8 setmanes d'edat es van utilitzar com a models animals experimentals. L'experiment es va dividir en 9 grups, 5 en cada grup: 0,9% NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA-WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Dissoldre amb 0.9% NaCl abans de la immunització, i immunitzar els ratolins per via subcutània dues vegades amb un interval de 2 setmanes. La sang es recull abans de la immunització, i el sèrum-80Y es prepara i s'emmagatzema per al seu ús posterior.

Els efectes del WCDPS i el CCDPS en el creixement dels ratolins:

Per observar els efectes del WCDPS i el CCDPS en el creixement de ratolins, els pesos dels ratolins de cada grup es van pesar a 0 d abans de la immunització inicial, 14 d, i 21 d després de la immunització.

Detecció d'anticossos sèrics de ratolí IgG i mecanografia després de la immunització WCDPS i CCDPS:

El mètode elisa indirecte es va utilitzar per determinar anticossos sèrics. Recoberta la placa ELISA amb 2.5 jig / ml OVA, 4Y durant la nit; rentat amb PBST 3 vegades i després afegit 5% llet no greix en pols 37L per al bloqueig durant 1 h; rentat 3 vegades amb PBST, i afegit l'anticòs primari als ratolins després de la immunització en cada grup Sèrum, la relació de dilució d'anticossos primaris és 1: 100, 100 píndola per pou, 37Tl h; després de rentar 3 vegades amb PBST, afegir anticossos secundaris: cabra anti-ratolí IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) etiquetat amb HRP 37 Incubar el drac durant 1 h; després de rentar 4 vegades amb PBST, afegir tetrametilbenzidina (TMB) solució de substrat per evitar la llum durant 15 min. Afegiu 50 a cada pou per aturar la reacció amb 2 mol /L H2SO4 i mesureu el valor A45O/655. Comparar els nivells d'anticossos de cada grup.

Detecció de la proliferació de limfòcits esplènics de ratolí després de la immunització WCDPS i CCDPS:

El mètode MTT es va utilitzar per detectar la proliferació de limfòcits a la melsa de ratolins immunitzats amb CCDPS i WCDPS. La melsa dels ratolins es va aïllar en condicions asèptiques 21 dies després de la immunització inicial i les cèl·lules de melsa es van diluir amb un 10% de mitjana RPMI 1640 que conté FBS per fer cèl·lules individuals Suspensió, recompte i ajust de les cèl·lules (cèl·lules r / ml es van estendre en una placa de cultiu cel·lular de 96 pous, afegir 20 OVA (concentració final 10 |xg / ml) i ConA (concentració final 5 porc / ml) respectivament Estimular, establir un control de cel·la buida i un control sèric buit al mateix temps, posar-lo en una incubadora de cèl·lules 37Y durant 48 hores, afegir 20 MTT a cada pou, 37^ i continuar incubant durant 4 hores, afegir 100|±1 DMSO a cada pou per dissoldre i provar el cor 0/63。 Valor, calcular l'índex d'estimulació (SI) de cada grup de ratolins.

L'expressió de CD4 i CD8 en els limfòcits T CD3 + després de la immunització WCDPS i CCDPS:

La citometria de flux es va utilitzar per detectar l'expressió de les cèl·lules CD4 + T i CD8 * T a la superfície dels limfòcits T CD3 +. La melsa del ratolí va ser aïllada en condicions asèptiques 21 dies després de la immunització primària, i la melsa va ser tractada amb RPMI 1640 mitjà que contenia 10% FBS. Prepareu una sola suspensió de cèl·lules, compteu i ajusteu el nombre de cèl·lules a 1x106 cèl·lules / mostra, realitzeu la tinció CD4 i CD8 a la superfície de les cèl·lules CD3 + T, protegiu de la llum a temperatura ambient durant 25 minuts i utilitzeu 10 ml d'una solució amortidora de fosfat que conté 0,5% FBS (solució amortida de fosfat). salina, PBS) 1 200 r / min 7 min rentar una vegada, afegir 250 |jil PBS, passar malla de coure de malla 200, citometria de flux per detectar l'expressió de CD4 i CD8 a la superfície de les cèl·lules CD3 * T.

Mètodes estadístics:

Flowjo 7.6 processos de programari resultats de proves de citometria de flux; GraphPad Prism 5.0 s'utilitza per a l'anàlisi de dades, i totes les dades es basen en la mitjana ± desviació estàndard. Utilitzeu Student i test per comparar les dades entre els grups experimentals. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Resultat

1. L'efecte del WCDPS i el CCDPS en el creixement de ratolins: Després de la co-immunització amb WCDPS i CCDPS i OVA, pesa el pes dels ratolins (Taula 1). No hi va haver diferències estadísticament significatives en el pes corporal dels ratolins en cada grup durant el mateix període de creixement (P>0,05).

2. L'efecte del WCDPS i el CCDPS sobre l'anticòs específic de l'OVA IgG: els WCDPS i el CCDPS es van immunitzar per via subcutània amb OVA per detectar l'expressió d'anticossos específics de l'OVA IgG al sèrum després de 14 dies i 21 dies d'immunització. Els resultats es mostren a la figura 1, WCDPS i CCDPS va promoure l'expressió d'anticossos IgG en el sèrum d'una manera dependent de la dosi; OVA + WCDPS 50 p,g en comparació amb OVA + CCDPS 50 |xg pot promoure significativament anticossos específics de l'OVA en comparació amb OVA + CCDPS 50 |xg. L'expressió d'IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); la diferència entre el WCDPS i el CCDPS a la mateixa dosi no va ser estadísticament significativa (P>0,05).

3. L'efecte del WCDPS i el CCDPS sobre la mecanografia d'anticossos específics de l'OVA: 21 dies després de la immunització, es va detectar l'expressió d'anticossos específics de L'OVA IgG1 i IgG2a en sèrum. Els resultats es mostren a la figura 2. OVA-WCDPS 50 jig i OVA-WCDPS 100 |xg Mumu va promoure significativament l'expressió d'anticossos IgG2a en sèrum que el grup OVA només (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. L'efecte del WCDPS i el CCDPS sobre la proliferació de limfòcits específics de l'OVA de ratolí: Per detectar l'efecte del WCDPS i el CCDPS sobre els limfòcits esplènics, els polisacàrids del cistanche es van immunitzar subcutàniament amb OVA, i les cèl·lules de melsa es van separar 21 dies després de la immunització, i es va utilitzar el mètode MTT per detectar-los Promoure la proliferació de limfòcits específics de l'OVA. Els resultats es mostren a la figura 3. WCDPS i CCDPS van millorar la proliferació de limfòcits específics de l'OVA d'una manera dependent de la dosi. La combinació de WCDPS i CCDPS amb el grup OVA pot promoure significativament la proliferació de limfòcits específics de l'OVA en comparació només amb el grup OVA. Proliferació de limfòcits (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. L'efecte de WCDPS i CCDPS en les cèl·lules T CD3+ CD4+ CD4+ CD3+CD8+: 21 dies després que WCDPS i CCDPS fossin immunitzats subcutàniament amb OVA, l'expressió de CD4 i CD8 en les cèl·lules T CD3+ es va detectar mitjançant citometria de flux, com es mostra a la figura 4A Es mostra que les cèl·lules T OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 i OVA-WCDPS 100 poden promoure significativament la proliferació de cèl·lules CD3 +CD4+ T (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); no hi va haver diferències significatives entre WCDPS i CCDPS i OVA en comparació amb un grup adjuvant d'alumini (P>0,05).

Discussió

Nombrosos estudis han demostrat que la medicina a base d'herbes xinesa té funció immunomoduladora "Da",i també hi ha un gran nombre d'informes que demostren que els polisacàrids de la medicina a base d'herbes xineses de cistanche es poden utilitzar com a adjuvant per millorar l'efecte immune de les vacunes"3], i la carn del desert de Xinjiang de Congrong seleccionada en aquest estudi és un material medicinal únic a Xinjiang, i les espècies silvestres estan a la vora de l'extinció, combinades amb el seu major valor medicinal, el cultiu d'espècies cultivades és particularment important per al desenvolupament i la utilització dels recursos de les plantes medicinals. Les noves vacunes en el mercat actual tenen una bona especificitat d'antígens, però una mala immunogenicitat. Els polisacàrids vegetals del cistanche poden compensar aquesta deficiència. el meu país té un gran avantatge en la investigació de la medicina a base d'herbes xinesa. Examinem els adjuvants de vacunes de medicaments a base d'herbes xineses naturals. Alta viabilitat. Els estudis han demostrat que els polisacàrids herbacis xinesos de cistanche tenen diferents graus de regulació sobre la immunitat específica i la immunitat no específica, com ara els polisacàrids de Ganoderma de cistanche, Radixisatidis polysacàrids de cistanche, Poria cocos polisacàrids de cistanche koji, polisacàrids d'inulina de cistanche 27], etc. Pot millorar l'efecte immunitari de la vacuna.

A causa del ràpid augment de la demanda de cistanche, les seves espècies silvestres s'han extingit i ara estan catalogades com a plantes amenaçades i protegides al meu país. Basant-se en l'èxit de la plantació artificial del desert de Caulis Carlsbad, s'espera que les espècies cultivades substitueixin les espècies silvestres. En aquest experiment, el cistanche cultivat salvatgement i els polisacàrids de cistanche cultivats artificialment es van utilitzar com a adjuvants OVA per dur a terme experiments d'immunització de ratolí in vivo. Mitjançant la prova de diversos indicadors, es va avaluar inicialment l'efecte immune de la cistanche silvestre i cultivada, que va proporcionar una referència per a l'ús efectiu de cistanche cultivat a Xinjiang.

Per tal d'entendre la seguretat del cistanche salvatgement conreat i cultivat artificialmentcistanche saccharidesA partir del cistanche, els experiments d'immunització animal in vivo han observat les característiques d'aparença dels ratolins i han trobat que els ratolins no tenen diarrea, cabell erecte o llàgrimes després de la immunització, i les seves activitats i respiració són normals, i no hi ha contracció muscular. No hi va haver diferències significatives en el pes corporal dels ratolins de cada grup a causa del fenomen del trastorn, el que indica que la immunització WCDPS i CCDPS no va afectar el creixement dels ratolins i tenen un cert grau de seguretat. Els resultats de les proves d'anticossos IgG i mecanografia mostren: WCDPS i CCDPS poden augmentar significativament l'expressió d'anticossos específics de l'OVA IgG després de la co-immunització amb OVA, i l'efecte és equivalent a l'adjuvant d'alumini; pot millorar significativament l'expressió d'anticossos específics de L'OVA tipus IgG2a i IgGl, Mostra que els polisacàrids del cistanche milloren la resposta immune Th1 i Th2 al mateix temps, i no hi ha cap diferència significativa entre WCDPS i CCDPS. Els resultats de la mecanografia d'anticossos IgG2a van trobar que el grup de co-immunització WCDPS i CCDPS i OVA pot millorar significativament l'expressió d'IgG2a en comparació amb el grup adjuvant d'alumini, un adjuvant d'alumini és més feble en la promoció de l'expressió de les cèl·lules T, que demostra que WCDPS i CCDPS s'utilitzen com a adjuvants La capacitat de promoure la immunitat cel·lular és significativament superior a la dels adjuvants d'alumini.

Els resultats de la detecció de la proliferació de limfòcits pel mètode MTT van mostrar que les cèl·lules de melsa de ratolins de cada grup van ser estimulades per LVA. L'índex d'estimulació (SI) de proliferació de limfòcits en el WCDPS i ccdps combinat amb OVA va ser significativament superior al del grup d'immunització només OVA. OVA- L'índex d'estimulació del grup WCDPS 50 Ah i OVA-CCDPS 50 jig va ser significativament superior al del grup adjuvant d'alumini; indica que el WCDPS i el CCDPS combinats amb el grup OVA poden augmentar significativament la proliferació de limfòcits específics de l'OVA en comparació amb el grup OVA i el grup adjuvant d'alumini.

Hi ha diferents subgrups de limfòcits T. CD3 és la molècula superficial de tots els limfòcits T. Segons diferents fenotips, es poden dividir en limfòcits T CD8 + i limfòcits T CD4. Les molècules CD4+ es poden formar sota l'acció de les molècules de MHC fl, que s'utilitzen principalment com a cèl·lules ajudants (Th) després de l'activació. Les molècules CD8+ s'han de formar sota l'acció de les molècules de L'MHC I. Després de l'activació, es converteixen en cèl·lules assassines (TC o CTL), que juguen un paper important en la immunitat contra les infeccions virals i la immunitat tumoral. 3". La citometria de flux detecta l'expressió de les cèl·lules CD3PD4 + T i CD3 + CD8 + T, els resultats mostren que WCDPS i CCDPS poden promoure significativament la proliferació de cèl·lules CD4 + T i CD8 + T dins d'un determinat rang de dosis, i no hi ha cap diferència significativa entre WCDPS i CCDPS a la mateixa dosi. La combinació de CCDPS i OVA pot estimular l'expressió de cd3 + CD4 + T i CD3 + CD8 + T, i els dos efectes són equivalents.

En resum, el WCDPS i el CCDPS són segurs com a adjuvants. Després d'haver estat immunitzats amb OVA, poden millorar simultàniament la immunitat humoral específica i la immunitat cel·lular. En comparació amb els adjuvants d'alumini, WCDPS i CCDPS tenen millors efectes sobre la millora de la immunitat cel·lular, i no hi ha diferència en els efectes de millora dels dos polisacàrids del cistanche. Aquests resultats de recerca proporcionen referències materials per a Xinjiang polisacàrids cistanche cultivats artificialment de cistanche com a adjuvants i també proporcionen la base material per al cribratge d'adjuvants immunes segurs i eficients del desert de Xinjiang.cistanche.

Referències

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. La resposta adjuvant immune dels polisacàrids de la macrocefàlia d'Atractylodis Koidz en pollastres vacunats contra la malaltia de Newcastle (ND) [J]. Polim de Carbohid, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. carb pop. 2016. 01.033.

[2] Li J, Wang X, Wang W, et al. L'extracte d'aigua pleurotus ferulat millora la maduració i la funció de les cèl·lules dendrítiques derivades de la medul·la òssia murina a través de la via de senyalització TLR4 [ J ]. Vacuna, 2015, 33(16) : 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vacuna.2015.02. 063.

[3] Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. La resposta immunitària de la mucositat entèrica podria desencadenar l'activitat d'immunomodulació del polisacàrid de Ganoderma en ratolins. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.