Complexos de proteïnes i mucílags de nano llet: caracterització i efecte anticancerígen Part 2

Per a més informació, contacteutina.xiang@wecistanche.com

Feu clic a l'enllaç per aprendre la part 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Materials i Mètodes

3.1. Materials

La closca de Plantago ovata (subobjectiu) i el fruit madur de Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) es van comprar a Gizeh, Egipte; El concentrat de proteïna de la llet (MP, 81,3 per cent de proteïna) es va comprar a l'empresa Fonterra (Auckland, Nova Zelanda). La caseïna i les proteïnes del sèrum de llet en MPC es troben en gran part en la seva forma nativa i semblant, micel·lar, a les que es troben a la llet. Tots els productes químics utilitzats eren de puresa analítica.

3.2.Preparació de mucílag de closca d'Isabgol (IHM) i mucílag de Nabeg (NabM)

El mucílag de closca Isabgol (IHM) i el mucílag Nabeq (NabM) es van preparar segons el mètode descrit per El-Maksoud et al. [5]. Breument, es va preparar una suspensió de closca d'isabgol dissolent 1,2 g en 100 ml d'aigua destil·lada i purificada amb solució d'acetona. El gel resultant es va guardar a la nevera (4-5 graus) fins que s'ha utilitzat.

Per a NabM, els fruits Nabeq madurs es van rentar a fons amb aigua de l'aixeta per eliminar la brutícia. Les fruites fresques es van separar de les llavors i es van barrejar amb aigua destil·lada en una proporció d'1:10 (p/v) després de ser tallades en trossos petits. La barreja es va barrejar amb una batedora de laboratori (Toshiba Mixie, Japó) i es va deixar reposar durant 12 h a la nevera.

L'extracte mucilaginós es va centrifugar a 2000 rpm durant 30 min i es va filtrar a través d'un drap de muselina. El mucílag viscós soluble resultant es va precipitar amb acetona. El mucílag brut obtingut es va guardar a la nevera fins al seu ús.

Amb finalitats analítiques, el mucílag es va assecar en un forn d'aire a 40 graus i es va triturar amb un molí de boles MM4{00 (Retsch, Alemanya). S'ha mesurat la composició química de la pols de mucílag de closca de psyllium (PHMP) i la pols de mucílag de Nabeq (NabMP). La humitat, proteïnes, greixos, cendres, fibra bruta i contingut total d'hidrats de carboni eren 8,49, 0,34, 0,21, 2,13, 1,53 i 87,44 per cent per a PHMP i 9,18, 4,72, 2,05, 2,69, 1,70 i 78,26 per cent per a NabMP. , respectivament. La pols resultant es va emmagatzemar a una temperatura fresca (4-5 graus) fins a una anàlisi posterior.

Feu clic per obtenir més informació

3.3. Preparació de complexos proteïnes-mucílags de la llet (MPMC)

Els complexos de proteïnes de la llet (MP) amb IHM i NabM es van preparar segons Morr et al. amb algunes modificacions [44]. El concentrat de proteïnes de la llet es va reconstituir en aigua destil·lada (10 per cent). El col·loide de proteïna de la llet resultant es va barrejar amb IHM i NabM en una proporció 1:3 (o/o). El pH de la mescla es va ajustar a 10 i es va deixar reposar durant 10 min. Després d'això, el pH es va reduir a 3,5 amb HCl 0,1 N i es va deixar durant 10 minuts més. A continuació, el pH es va ajustar a pH 4,6 amb NaOH 0,5 M per recollir MPMC mitjançant la filtració en un paper de filtre: MP, així com el MPMC resultant, es van assecar per liofilització a -45 graus C durant 24 hores amb el liofilitzador Novalyphe-NL500. , Savant Instruments, Holbrook, NY, EUA.

3.4. Característiques fisicoquímiques i funcionals

3.4.1.Mesura del pH

El pH dels productes resultants a una solució al 10 per cent es va mesurar mitjançant un mesurador de pH calibrat (HANNA, HI 902 m, Alemanya).

3.4.2.Determinació de la densitat a granel (BD), la densitat tapeada (TD) i l'índex de Carr

La pols MPMC es va abocar en un cilindre mesurador de 50 ml fins a 25 ml, corresponent al volum sense aprofitar, i després toqueu 5-10 vegades fins que no es va notar cap canvi més en el volum de la pols corresponent al volum tocat.

La densitat aparent, la densitat presa i l'índex de Carr es van determinar aplicant les equacions següents [45]:

(1) BD=massa/volum sense aprofitar

(2)TD=massa/volum pres

(3)Índex de Carr (percentatge)= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Índex d'absorció d'aigua (WAI) i índex de solubilitat en aigua (WSD)

La solubilitat en aigua i els índexs d'absorció d'aigua de MP i MPMC es van examinar segons el mètode descrit per Yagc i Gogus amb algunes modificacions [46]. Les mostres (0,5 g) es van dispersar en 10 ml d'aigua destil·lada a 25 graus en un tub de centrífuga. Després de reposar durant 30 min, amb inversió del tub cada 5 min, les mostres es van centrifugar a 3500 rpm durant 15 min. El filtrat es va transferir a una placa d'alumini i es va assecar durant 3 hores a 105 graus. Es va registrar el pes del gel restant i es van determinar WSI i WAI de la següent manera:

(4)WAI(g/g)= Guany de pes del gel/pes sec de la mostra

(5) Percentatge WSI=Pes dels sòlids secs en el sobrenedant × 100/Ps sec de la mostra

3.4.4. Digestibilitat de les proteïnes de la llet

La digestibilitat de les proteïnes es va determinar segons Abd El-Ghany et al. [47]. Breument, les mostres de MP i MPMC es van dispersar en aigua destil·lada a una concentració de 6,38 mg/mL i el pH es va ajustar a 8.0. Un mil·lilitre de solució enzimàtica acabada de preparar (1,6 mg/mL de tripsina, 3,1 mg/mL de quimotripsina i 1,3 mg/mL d'ER aminopeptidasa1)

(ERAP1) es va barrejar amb suspensió de proteïnes a 37 graus. El pH es va registrar després de 10 min i es va determinar l'activitat de l'enzim utilitzant la caseïna com a referència. Es va utilitzar l'equació següent per calcular la digestibilitat de les proteïnes [47]:

(6) per cent de digestibilitat=210.46-18,10 (pH)

3.5.Fraccions fenòliques de PHM i NabM

Els compostos fenòlics de mostres de mucílag mitjançant anàlisi HPLC es van realitzar mitjançant el protocol descrit per Elsayed et al. [48]. Breument, l'extracte de mucílag es va analitzar mitjançant un sistema HPLC de la sèrie Agilent 1260 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA). La separació es va passar mitjançant la columna C18 (100 mm × 4,6 mm id, 5 um). La fase mòbil contenia (A) aigua 0,2% H3PO4, (B)metanol i (C) acetonitril a un cabal de 0,6 ml/min. El gradient d'elució va ser segons el següent esquema: 0-11 min (96 per cent A., 2 per cent B);11-13 min (50 per cent A, 25 per cent B);13-17min (40 per cent) per cent A, 30 per cent B);17-20,5 min (50 per cent B, 50 per cent C); i 20,5-30 min (96 per cent A, 2 per cent B). La longitud d'ona de detecció (UV detector, 284 nm) es va establir a 284 nm. La mida d'injecció era de 20 μL i la temperatura de la columna es va mantenir a 30 graus. Els compostos es coneixien comparant el seu temps de retenció amb els dels estàndards autèntics. Es van utilitzar corbes de calibratge per avaluar les quantitats de compostos.

3.6.Contingut total de fenòlics i flavonoides de MP i MPMC

El contingut polifenòlic es va determinar pel mètode Folin-Ciocalteu amb algunes modificacions [5]. En resum, es van barrejar 2,8 ml d'aigua milli-Q que contenia 10 mg de MP o MPMC amb 2 ml de carbonat de sodi al 2% i 0,1 ml de reactiu Folin-Ciocalteau al 50%. Després de 30 min d'incubació a temperatura ambient, es va mesurar l'absorbància de la barreja de reacció a 750 nm contra aigua desionitzada com a blanc mitjançant un espectrofotòmetre (Hitachi, Model 100-20). L'àcid gàl·lic (GA) es va utilitzar com a compost fenòlic estàndard i es va construir una corba estàndard de set punts (0-200 mg/L). Els resultats es van expressar en mil·ligrams d'equivalents d'àcid gàlic per gram de proteïna (GAE/g).

FlavonoidesEl contingut es va determinar mitjançant el mètode del clorur d'alumini tal com es va descriure anteriorment per Abedelmaksoud et al. amb algunes modificacions [5]. En resum, es va barrejar 2,8 ml d'aigua milli-Q que contenia 10 mg de MP o MPMC amb 0,1 ml d'hexahidrat de clorur d'alumini al 10% i 0,1 ml d'acetat de potassi 1 M. Després d'incubar a temperatura ambient durant 40 min, es va mesurar l'absorbància de la mescla de reacció a 415 nm contra aigua desionitzada com a blanc. La quercetina es va utilitzar com a estàndard utilitzant una corba estàndard de set punts (0-50 mg/L). El contingut total de flavonoides es va expressar com a equivalents de quercetina en mil·ligrams (QE/g).

3.7. Activitat antioxidant de MP i MPMC

La capacitat total d'eliminació de radicals lliures de MP i MPMC es va avaluar mitjançant tres assaigs antioxidants diferents: estable 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), azino-bis (3-etilbenzotiazolina{{5 }} Àcid sulfònic (ABTS) i radicals hidroxil (HS) tal com han descrit anteriorment El-Maksoud et al [5].

3.8. Perfil d'aminoàcids de MP i MPMC

Les mostres de proteïnes es van hidrolitzar àcidment amb HCl 6 N segons Peksa et al. [49. Es va utilitzar un analitzador d'aminoàcids automatitzat (AAA 400, INGOs Ltd.) per determinar els aminoàcids.

3.9. Propietats reològiques

Les mostres es van preparar tal com descriu Barnes [50] amb algunes modificacions. La viscositat de la solució al 2,5 per cent (p/p) a pH7 es va determinar a 25 ± 1 grau mitjançant un viscosímetre Brookfield (DV-II més Pro, Rheocalc Software, Alemanya). L'esforç （σ） i la viscositat （n） es van representar en funció de la velocitat de cisalla. Es van calcular l'índex de consistència (K) i l'índex de comportament del flux (n) del model de llei de potència:

El valor de n és igual a 1 per als fluids newtonians i varia de 0 a 1 per als fluids que s'apriman per cisalla i més gran que 1 per als fluids que s'espesseixen [51].

3.10. Calorimetria d'escaneig diferencial (DSC)

Les propietats tèrmiques de MP i MPMC es van mesurar mitjançant un calorímetre d'exploració diferencial (PerkinElmer, EUA). Les mostres (4-6 mg) es van col·locar en una placa d'alumini i es van segellar. A continuació, es va escalfar cada cassola a 350 graus amb un flux de gas nitrogen sec a 20 ml min-I a una velocitat d'escalfament de 10 graus min-1. A partir del pic endotèrmic del termograma DSC, es va estimar la temperatura d'inici de la desnaturalització, la temperatura màxima de transició i el punt de degradació [52]. Es va determinar el valor d'entalpia de transició (AH) de l'àrea sota el pic endotèrmic de la corba DSC i es va utilitzar la paella d'alumini buida com a referència.

3.11. Espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR)

Els espectres infrarojos entre 600 i 3500 cm-I es van mesurar a 25 graus mitjançant un espectrofotòmetre FTIR (QFA Flex, EUA) pel mètode de reflexió total atenuada amb una resolució de 4 cm-I i adquirint 10 exploracions per segon.

3.12. Microscòpia electrònica de transmissió

La microestructura de MP i MPMC es va visualitzar mitjançant un microscopi electrònic de transmissió (JEOL, JEM 1400 Flash, Japó) a 80 kV. Es va aplicar la crio-etapa del mètode de tinció negativa [53].

3.13.Estudis biològics sobre MP i MPMC

3.13.1.Activitat anticancerígena in vitro

Totes les línies cel·lulars utilitzades en aquest experiment es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). En aquest assaig es van utilitzar dues línies cel·lulars canceroses humanes: adenocarcinoma mamari (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) i carcinoma hepatocel·lular (HepG2, ATCC4 HB{-8065TM). També es van provar les línies cel·lulars de fibroblast de pell no cancerígena BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) i epitelials de mama MCF-12F (ATCC CRL-10782TM) per a la seva comparació. Les línies cel·lulars es van cultivar en el medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM/glucosa alta, HyCloneTM, EUA) complementat amb sèrum boví fetal al 10% (FBS, Gibco, Brasil), 100 U/mL de penicil·lina, 100 ug/mL d'estreptomicina i 25 ng/ mL d'amfotericina B (Sigma, Oakville, ON, Canadà) i cultivada a 37 graus amb un 5 per cent de CO, en una incubadora humidificada. El medi de cultiu es va substituir cada dos dies per un medi nou. Quan les cèl·lules van arribar al 70 per cent de confluència, es van separar amb un 0,25 per cent de tripsina-EDTA (1X) Gibco, Canadà, i es van transferir a un nou matràs de cultiu. Després del segon pas, les cèl·lules es van tripsinitzar i es van xapar en una placa 96-pou a una concentració de 2 × 10* cèl·lules/pou. Després de 24 h d'incubació, el medi es va decantar i les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i després es van tractar amb 200 μL de medi de cultiu que contenia diferents concentracions de mostres de proteïnes (1, 5, 10 i 20 ug/mL). La doxorubicina HCl (4 ug/mL) es va utilitzar com a control positiu, mentre que les cèl·lules tractades amb un medi no suplementat es van prendre com a control negatiu. Les plaques es van incubar a 37 graus C durant 24 h ianticancerígensL'activitat de les mostres es va determinar mitjançant un assaig d'absorció de vermell neutre segons Repetto et al. [54]. Breument, després del període d'incubació, el medi es va substituir per 150 uL de colorant vermell neutre (100 mg/ml) dissolts en un medi sense sèrum, i les cèl·lules es van incubar a 37 graus C durant 3 h. A continuació, es van esbandir les cèl·lules amb PBS i es van afegir 150 μL de medi d'elució (EtOH/AcCOOH, 50∶1) seguit d'una agitació suau durant 10 min per garantir la dissolució completa. L'absorbància es va mesurar a 540 nm mitjançant un lector de plaques de microtitulació (BioTek, 96 Well Plates, ELX808, EUA).

on Ac és l'absorbància del control i As és l'absorbància de la mostra. Per a cada mostra es va calcular el percentatge de mort cel·lular presentat com a citotoxicitat (per cent) i la concentració que mata el 50 per cent de les cèl·lules (IC50).

3.13.2. Determinació del nivell de proteïnes p53, Bax, caspasa-3 i Bcl-2

Els nivells cel·lulars dels marcadors clau de proteïnes d'apoptosi es van determinar després de 24 h després del tractament amb l'ICso de MP i MPMC. Breument, les cèl·lules Hep G-2, MCF-7, Bj-1 i MCF{-12F es van sembrar a 5 × 10* cèl·lules/pou en 6-pou plaques. Després de 24 h d'incubació amb les mostres a 37 graus, es van recollir les cèl·lules i es van lisar i després es van centrifugar a 10 000rpm durant 20 min a 4 graus. La concentració de proteïnes es va quantificar al sobrenedant mitjançant un assaig de Bradford [55]. L'activitat de la caspasa-3 es va analitzar mitjançant un kit d'assaig colorimètric (Abcam, ab39401) segons les instruccions del fabricant [56]. En resum, es van afegir 10 mg de proteïna a 50 uL de substrat de caspasa i el volum final es va ajustar a 200 μl mitjançant el tampó de reacció a 37 graus, i la barreja es va incubar durant 1 h a la foscor i es va mesurar la caspasa {{24} } concentració a 405 nm.

El nivell de marcador pro-apoptòtic p53, X (Bax) associat i el marcador anti-apoptòtic de limfoma de cèl·lules B-2(Bcl{-2) es va determinar en el lisat cel·lular mitjançant l'assaig immunoabsorbent lligat a enzims Pas simple ELISA segons les instruccions del fabricant (ab207225, ab119506 i ab199080; Abcam, EUA), respectivament [57,58].

3.13.3.Dany a l'ADN induït per la protecció contra l'estrès oxidatiu

L'assaig de danys a l'ADN es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment per Leba et al. [59] amb una lleugera modificació. En resum, es van barrejar 3 μL del plasmidi inhibidor de la ribonucleasa RNH1 (NM_203387) Clon ORF etiquetat humà 10 ug/μL amb el reactiu de Fenton (5 mM de H2O2 i 0,3 mM). de FeSO4 i 0,6 mM d'EDTA) i el volum final es va ajustar a 25 μL mitjançant tampó fosfat (H2POA, 8,3 mM, pH 7,4). A continuació, la solució es va incubar durant 20 minuts a 37 graus. Per avaluar la capacitat de protecció antioxidant de MP i MPMC contra el dany a l'ADN induït pel reactiu de Fenton, es van afegir 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM i MP abans de la incubació. L'ADN plasmidi RNH1 (3 μL, 10 ug/μL) es va utilitzar com a control de protecció de l'ADN.

3.13.4.Assaig de danys a l'ADN genòmic basat en PCR

El gen de la metilentetrahidrofolat reductasa (MTHFR) de l'Homo sapiens es va amplificar mitjançant PCR de la sang genòmica extreta prèviament de mostres de sang sana mitjançant un kit d'extracció d'ADN estàndard [60]. L'ADN es va incubar durant 10 minuts amb o sense el reactiu de Fenton suplementat amb MP o MPMC. Es va amplificar un fragment de 198-bp utilitzant primers forward5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' i inversos 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'. Utilitzant 50 ng d'ADN tractat, es va realitzar l'amplificació per PCR després del següent termociclador (94 graus durant 5 min, seguit de 25 cicles de desnaturalització, els 30 s a 94 graus; recuit, 30 s a 60 graus; i extensió, 30 s a 72 graus) per 25 cicles i 1 cicle final d'extensió a 72 graus durant 5min. Les mostres de reacció de PCR es van aplicar per a l'electroforesi en gel d'agarosa (2 per cent).

3.13.5. Perfil d'expressió gènica per RT-qPCR

Les anàlisis de l'expressió gènica de gens marcadors clau pro i anti-apoptòtics es van realitzar amb cèl·lules HepG-2, MCF-7, Bj-1 i MCF{-12F exposades a IC50 obtingudes dades (taula 3) durant 72 h. Breument, l'ARN total es va extreure mitjançant el kit de purificació d'ARN total (QIAGEN., Thorold, ON, Canadà) segons les instruccions del fabricant. cDNA

la síntesi es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment per Aboul-Sound et al. [61]. Els programes d'amplificació i l'especificitat de l'amplicó de PCR es van realitzar i es van avaluar mitjançant l'ús d'un termociclador Rotor-Gene O 5-Plex HRM (Qiagen, Alemanya) amb el kit Quanti-Tect SYBR-Green PCR (Qiagen, Alemanya), tal com es va documentar anteriorment. seguint protocols estàndard [61]. Es van utilitzar els següents primers: Hs_P{53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); Limfoma de cèl·lules B 2 Hs_BCL{2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011);Bcl-2-com la proteïna Hs{_BAX{_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); i 18S rDNA housekeeping (HK) gen Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay (QT00199367). El programa de ciclisme tèrmic de PCR i l'anàlisi de l'expressió gènica per determinar el canvi de plec en relació amb el gen 18S es van realitzar essencialment tal com es va informar anteriorment [61].

3.14.Anàlisi estadística

Els resultats obtinguts es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard. Les estadístiques es van aconseguir mitjançant el programari SPSS 11.5 (SPSS, Inc. Chicago, IL, EUA). La prova de rang múltiple de Duncan es va utilitzar per determinar les diferències significatives entre totes les mostres, i les diferències es van considerar significatives a p<>

4. Conclusions

En conclusió, aquest estudi va revelar que barrejar proteïnes de la llet ambpolisacàridsmitjançant la diferenciació del pH de la solució és una tècnica adequada per a la complexació. Els complexos de mucílag de proteïnes de la llet (MPMC) resultants tenen fenòlics i fenòlics significativament més altsflavonoidescontinguts que la proteïna de la llet (MP). Els resultats del DSC van mostrar que la complexació de MP amb polisacàrids augmentava significativament l'estabilitat tèrmica amb un canvi en la temperatura de desnaturalització. Es van realitzar anàlisis FTIR per identificar els grups funcionals i es va investigar el comportament del flux dels complexos preparats. El WSI i el WAI de la proteïna de la llet es van augmentar per complexació amb NabM o IHM. Es va utilitzar TEM per visualitzar la microestructura dels complexos preparats. D'altra banda, s'espera que els complexos de proteïnes de la llet resultants amb mucílag de closca d'isabgol (HM) o mucílag Nabeq (NabM) superin les proteïnes natives de la llet en l'efecte antioxidant i anticancerígen. En resum, el MPMC va expressar propietats anticancerígenes úniques contra el càncer de mama model i les línies cel·lulars de carcinoma hepàtic (MCF7 i HEPG2, respectivament) com es va demostrar amb un assaig d'absorció de vermell neutre.

MPMC va millorar tots dosantioxidanti l'activitat contra la proliferació. Les caspases són proteïnes reguladores clau que estan implicades en la inducció de l'apoptosi. La regulació de la proteïna de la caspasa 3 i les transcripcions d'ARNm (figura 9A, B) controlen altres proteïnes en la via de l'apoptosi, que es caracteritza pel col·lapse de la membrana mitocondrial amb l'alliberament del citocrom c induït per Bax i l'activació de la caspasa 9 que condueix al posterior compromís de caspasa 3. La regulació a l'alça de Casp3, p53 i Bax, juntament amb la reducció de l'expressió de Bcl-2, va revelar que la inducció de l'apoptosi induïda per MPMC, on la regulació de p53 estimularà l'expressió de Bax, que, al seu torn, induirà el citocrom c. llançament, seguit de la caspasa-9 i-3 activació. A més, se sap que Bcl-2 inhibeix l'alliberament del citocrom c. En el nostre estudi, es va demostrar que la baixada de Bcl-2 induïda per MPMC facilita l'alliberament del citocrom c induït per Bax sense oposició i l'apoptosi posterior.

L'efecte anticancerígen dels complexos proteïna-polisacàrid proporciona més il·luminació sobre l'aplicabilitat d'aquests complexos per utilitzar-los en el desenvolupament de teràpies contra el càncer assequibles i eficients amb efectes secundaris mínims.