Efecte neuroprotector de l'extracte de Bu-Shen-Huo-Xue contra l'apoptosi induïda per glucosa alta a les cèl·lules PC12

Per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Estudi de recerca d'integració de la medicina tradicional i occidental, primer hospital, Universitat de Pequín, Beijing, Xina.

2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Escola de Ciències Farmacèutiques, Universitat de Pequín, Beijing, Xina.

Destacats

La neurotoxicitat induïda per glucosa alta (HG) està implicada en la patologia dediabèticencefalopatia (DE). En el nostre estudi, l'extracte de Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), una fórmula poliherbal, presentaneuroprotectorL'activitat a les cèl·lules PC12 induïdes per HG i els possibles mecanismes poden estar associats a la supressió de la generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS), així com a les vies de senyalització de la caspasa i JNK/p38 MAPK mediades per mitocondris. Aquest estudi proporciona un agent prometedor per al tractament de la DE en aplicacions clíniques.

Feu clic als beneficis de l'extracte de cistanche i Cistanche per al ronyó

Cistancheés una herba tònica coneguda que pot nodrir i protegirronyons. En la teoria de la medicina tradicional xinesa,Cistancheés la millor herba per aronyons.Cistancheés ric en equinacòsid, acteòsid i flavonoides. Aquests ingredients efectius enCistanchepot reduirronyóapoptosi cel·lular i augmentronyóproliferació cel·lular. Per tant,Cistancheés unsuplement de ronyó natural.

Resum

Objectiu: investigar l'efecte neuroprotector de l'extracte de Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), una fórmula poliherbal, contra la neurotoxicitat induïda per la glucosa alta (HG) a les cèl·lules PC12. Mètodes: Assaig de viabilitat cel·lular, assaig de lactat deshidrogenasa (LDH), detecció d'espècies reactives d'oxigen (ROS), Hoechst 33258, doble tinció de taronja d'acridina (AO)/bromur d'etidi (EB) i assaig de potencial de membrana mitocondrial (MMP). A més, es van detectar per western blot Bax, Bcl-2, caspasa-3, caspasa escindida-3, PARP, PARP escindida, citocrom c i proteïnes cinases activades per mitogens (MAPK). Resultats: l'extracte de BSHX va augmentar la viabilitat cel·lular i va disminuir la fuita de LDH de manera dependent de la concentració a les cèl·lules PC12 induïdes per HG. A més, l'extracte de BSHX va disminuir el nivell de ROS intracel·lular, va augmentar el potencial de membrana mitocondrial, va regular les expressions de Bax i Bcl-2 i va inhibir l'alliberament del citocrom c dels mitocondris. A més, l'extracte de BSHX va atenuar l'activació de la caspasa-3 i la PARP i va inhibir les fosforilacions de la cinasa N-terminal c-Jun (JNK) i les MAPKs p38. Conclusió: l'extracte de BSHX va mostrar un efecte neuroprotector significatiu sobre l'apoptosi induïda per HG a les cèl·lules PC12. Aquest efecte pot estar associat amb la supressió de la generació de ROS, així com amb les vies de senyalització de la caspasa mediada per mitocondris i JNK/p38 MAPK.

Paraules clau:encefalopatia diabètica, medicina tradicional xinesa, extracte de Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotector, glucosa alta

Abreviatura: AO: taronja d'acridina; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Encefalopatia Diabètica; DM: Diabetis mellitus; DMSO: dimetil sulfòxid; EB: Bromur d'etidi; ERK: Proteïnes Kinases Extracel·lulars Regulades; HG: glucosa alta; JNK: quinasa N-terminal c-Jun; LDH: lactat deshidrogenasa; MAPKs: Proteïnes Kinases activades per mitògens; MWP: Prescripció Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-bromur de difeniltetrazoli; PBS: Solució Salina Tampó Fosfat; PBST: solució salina tamponada amb fosfat, 0,1 per cent Tween 20; ROS: espècies reactives d'oxigen; DM2: diabetis mellitus tipus 2; MTC: Medicina tradicional xinesa

Fons

En els darrers anys, l'encefalopatia diabètica (DE), una complicació de la diabetis mellitus (DM) que es produeix al sistema nerviós central (SNC), ha rebut una atenció generalitzada. La DE pot estar associada a diversos factors de risc com l'edat, la durada i el control glucèmic de la diabetis [1, 2]. Les manifestacions clíniques de la DE són canvis morfològics i fisiològics en el cervell i la disfunció cognitiva resultant. La hiperglucèmia, l'estrès oxidatiu i la inflamació crònica poden ser les causes patògenes importants de la DE [3]. Tot i que un nombre creixent d'experiments han demostrat que la hiperglucèmia sostinguda a llarg termini pot accelerar l'envelliment del cervell, la patogènesi precisa de la DE no s'explora.

L'apoptosi és una mort cel·lular programada controlada per gens per mantenir l'estabilitat del microambient. Les proteïnes implicades en l'apoptosi inclouen la família Bcl-2, caspases, p53, etc. La família Bcl-2 es divideix en dues categories, una que promou la mort cel·lular, com Bax, i l'altra resisteix l'apoptosi, com ara Bcl-2. Poden regular l'apoptosi mitjançant la via de senyalització de la caspasa, que és una reacció d'amplificació en cascada del substrat d'hidròlisi finita irreversible de la caspasa [4-6]. A més, els estudis han demostrat que l'apoptosi induïda per la glucosa alta (HG) s'associa amb la disfunció mitocondrial, el dany de l'ADN i la producció excessiva d'espècies reactives d'oxigen (ROS) [7]. Un estudi de ratolins diabètics va demostrar que la proteïna cinasa (AMPK) activada per l'adenosina 5'-monofosfat (AMP), un receptor d'energia intracel·lular i d'estrès, podria inhibir l'apoptosi mediada per ROS. A més, l'evidència creixent ha demostrat que la inhibició de les proteïnes quinases activades per mitogens (MAPK) podria ser beneficiosa per a la inhibició de l'apoptosi neuronal. Un altre informe va demostrar que la cinasa N-terminal de c-Jun (JNK), les proteïnes cinases regulades extracel·lulars (ERK), les vies de senyalització p38 MAPK poden regular l'apoptosi neuronal [8,9].

Basat en la teoria de la medicina tradicional xinesa,ronyóLa deficiència d'essència i l'estasi de la sang es consideren patogènesi bàsica de la DE. Per tant, l'estratègia de nodrirronyonsi l'activació de la sang s'utilitza habitualment en aplicacions clíniques per a la DE. Estudis anteriors podrien confirmar que la prescripció modificada de Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), una recepta destinada a nodrirronyons, pot millorar el deteriorament cognitiu i protegir les neurones reduint la toxicitat A [10, 11]. La recepta de Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), en la qual s'afegeix la sangonera a partir de MWP, està específicament formulada pernodrirronyonsi activar la sang. Estudis recents han demostrat que la prescripció de BSHX pot millorar la síndrome de deteriorament de la memòria dels pacients amb DM, cosa que suggereix potents propietats neuroprotectores [12]. Tanmateix, el mecanisme farmacològic detallat per a BSHX encara no està clar. En aquest estudi, pretenem observar l'efecte protector de l'extracte de BSHX sobre cèl·lules PC12 induïdes per HG i explorar possibles mecanismes moleculars.

Mètodes

Materials i reactius

Totes les herbes es van comprar a Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, Xina) i van ser autenticades pel Dr. PF Tu, farmacognòstic, segons la Farmacopea Xinesa (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) era de Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, EUA). Es va comprar un kit d'assaig de lactat deshidrogenasa (LDH) al Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, Xina). El kit de doble taca de taronja d'acridina (AO)/bromur d'etidi (EB) i Hoechst 33258 es van obtenir de Solar Co., Ltd. (Beijing, Xina). Es va comprar un kit d'assaig de potencial de membrana mitocondrial amb JC-1, 2, 7-diacetat de diclorofluoresceïna (DCFH-DA) al Beyotime Institute of Biotechnology (Xangai, Xina). Anticossos primaris per a caspasa-3, caspasa escindida-3, PARP, PARP escindida, citocrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK i -tubulina es van obtenir de Cell signaling Technology (Boston, MA, EUA).

Preparació de l'extracte de BSHX

BSHX consta de set components medicinals (taula 1). Per a la preparació d'extracte de BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) i Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) es van barrejar en la proporció de 8:8:4:1:2:1:8 i es van submergir en un volum total de 10 vegades (v/p) d'aigua destil·lada durant 30 minuts , després es va bullir durant 1 h i es va tornar a bullir durant 1 h en un volum total de 5 vegades (v/p) d'aigua destil·lada. Els sobrenedants es van combinar i assecar per liofilització. L'extracte sec final va ser el 25 per cent (p/p) del pes de les herbes crues i es va dipositar un exemplar de val al Centre de Recerca Moderna de Medicina Tradicional Xinesa, Centre de Ciències de la Salut de la Universitat de Pequín, Pequín, Xina.

Cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars de feocromocitoma de rata (cèl·lules PC12) es van obtenir del Banc de cèl·lules del Peking Union Medical College (Beijing, Xina) i es van cultivar al Mitjà Àguila Modificat (DMEM) de Dulbecco (Macgene, Pequín, Xina) complementat amb sèrum boví fetal al 10% (Biowest, França). ) i 1 per cent de penicil·lina-estreptomicina (100 ×, Macgene, Pequín, Xina) en una incubadora humidificada que conté un 95 per cent d'aire i un 5 per cent de CO2 a 37 graus.

Tractament de mostra

A la prova preliminar, les cèl·lules PC12 es van tractar només amb extracte de BSHX (20, 50, 100 mg/L) durant 48 h per avaluar la citotoxicitat. Per a l'anàlisi de l'efecte neuroprotector de l'extracte de BSHX contra la neurotoxicitat induïda per alta glucosa (HG), les cèl·lules PC12 es van cotractar amb extracte de BSHX (20, 50, 100 mg/L) i HG (75 mM) durant 48 h, seguit d'un assaig MTT. per a la viabilitat cel·lular. Tots els altres assajos es van fer en les mateixes condicions amb el rang de concentració d'extracte de BSHX de 20 a 100 mg/L.

Assaig de viabilitat cel·lular

Les cèl·lules PC12 es van sembrar en plaques de 96-pous a una densitat de 3,5 × 103 cèl·lules per pou. Després de la incubació amb extracte de BSHX (amb o sense HG) durant 48 h, es va eliminar el sobrenedant i es va afegir una solució MTT (0, 5 mg/ml). Després de la incubació a 37 graus durant 4 hores, es va eliminar la solució de MTT i les cèl·lules es van dissoldre en dimetilsulfòxid (DMSO) per agitar 5 min. La densitat òptica (OD) es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de microplaques. Viabilitat cel·lular (per cent)=[DO (tractament) – DO (en blanc)]/ [OD (control no tractat) – DO (blanc)] × 100 per cent.

Assaig de LDH

Les cèl·lules PC12 es van cultivar i es van estimular per al tractament amb extracte de HG i BSHX tal com es va descriure anteriorment. A continuació, es va detectar la LDH alliberada de les cèl·lules mitjançant un kit de LDH comercial segons les instruccions del fabricant. L'absorbància es va mesurar a 450 nm. LDH (U/L)=[OD (tractament) - OD (en blanc)] / [OD (estàndard) - OD (blanc)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Tinció Hoechst 33258 i tinció AO/EB

Per a la tinció de Hoechst 33258, les cèl·lules es van fixar amb un 4% de paraformaldehid durant 30 min. A continuació, les cèl·lules es van rentar amb solució salina tampó fosfat (PBS) 3 vegades i es van incubar amb una solució de treball Hoechst 33258 (1 ug/ml) a la foscor durant 30 min a temperatura ambient. Les imatges es van capturar mitjançant un microscopi de fluorescència (IX73, Olympus, Japó) amb una longitud d'ona d'excitació de 352 nm/longitud d'ona d'emissió de 461 nm. Per a la tinció d'AO/EB, traieu el medi de les plaques de 96-pous i afegiu-hi la barreja AO/EB (100 ug/ml AO i 100 ug/ml EB barrejats) durant 5 minuts a la foscor a temperatura ambient. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS 3 vegades. Les cèl·lules es van visualitzar mitjançant un microscopi de fluorescència amb una longitud d'ona d'excitació de 490 nm/longitud d'ona d'emissió de 530 nm per a la tinció d'AO i una longitud d'ona d'excitació de 520 nm/longitud d'ona d'emissió de 590 nm per a la tinció d'EB.

Detecció intracel·lular de ROS

Per a la detecció intracel·lular de ROS, les cèl·lules PC12 es van sembrar en plaques de 6-pous a una densitat de 5 × 105 i es van sotmetre a tractament amb extracte de HG i BSHX durant 24 h. Després d'incubació 24 h, les cèl·lules PC12 es van rentar amb medi d'àguila modificat de Dulbecco sense sèrum durant 3 vegades i es van afegir a 10μΜ 2', 7'-diacetat de diclorofluoresceïna (DCF-DA), que s'oxida a 2', 7'-diclorofluoresceïna fluorescent. (DCF) per hidroperòxids, a 37 graus durant 30 min a la foscor. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS fred 3 vegades i es van tornar a suspendre en PBS. El nivell intracel·lular de ROS es va detectar mesurant la intensitat mitjana de fluorescència mitjançant citometria de flux (BD FACSCaliburTM, EUA). Les longituds d'ona d'excitació/emissió eren de 488/525 nm. Es van comptar un mínim de 10,000 esdeveniments per mostra. Els valors es van expressar com a absorbància mitjana normalitzada al percentatge del valor de control.

Assaig del potencial de membrana mitocondrial

La despolarització mitocondrial es va avaluar mitjançant un kit d'assaig JC-1 comercial. Després de ser tractades amb extracte de HG i BSHX, les cèl·lules es van incubar amb una solució de treball JC-1 (1 ×) a 37 graus durant 15 min a la foscor. A continuació, traieu el sobrenedant i renteu les cèl·lules 2 vegades amb una solució tampó JC-1 (1 ×). Les cèl·lules es van visualitzar mitjançant un microscopi de fluorescència amb una longitud d'ona d'excitació 460 nm/longitud d'ona d'emissió 530 nm per al monòmer JC-1 (detectat en cèl·lules amb mitocondris despolaritzats) i una longitud d'ona d'excitació 520 nm/longitud d'ona d'emissió 590 nm per a JC{{13} }} polímer (present als mitocondris polaritzats). Es considerava que les cèl·lules amb fluorescència verda (monomèrica) tenien mitocondris despolaritzats; es va considerar que les cèl·lules amb fluorescència vermella (polimèrica) tenien mitocondris normals.

Anàlisi Western blot

Les cèl·lules PC12 es van recollir i es van lisar en tampó RIPA fred amb un inhibidor de proteasa còctel 1 ×. El sobrenedant es va recollir per centrifugació a alta velocitat a 12 000 rpm durant 10 min a 4 graus. Les concentracions de proteïnes es van determinar mitjançant l'assaig de Bradford. Les fraccions enriquides amb citosols i mitocondris es van aïllar amb el kit d'aïllament de mitocondris (Pierce, Rockford, EUA) per a l'anàlisi del citocrom c. Per a altres proteïnes, els lisats cel·lulars totals es van separar per SDS-PAGE (10 per cent -15 per cent) i es van transferir a membranes de fluorur de polivinilidè (PVDF). A continuació, es van bloquejar les membranes de fluorur de polivinilidè amb un 5% de llet sense greix i es van incubar amb els anticossos primaris indicats a 4 graus durant la nit. Les membranes es van rentar amb PBST (solució salina tamponada amb fosfat, 0, 1 per cent de Tween 20) tres vegades i es van incubar amb anticossos secundaris a temperatura ambient durant 2 h. A continuació, es van rentar les membranes amb PBST tres vegades més i es van visualitzar amb un substrat quimioluminiscent millorat i es van escanejar amb el sistema d'imatge digital Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, EUA).

Anàlisi estadística

Tots els valors s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard (DE). La importància de les diferències entre els valors mitjans es va determinar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) mitjançant el programari Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0). P < 0,05="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" control="" es="" va="" considerar="" estadísticament="">

Resultats

L'extracte de BSHX protegeix les cèl·lules PC12 contra lesions cel·lulars induïdes per HG

Per investigar si l'extracte de BSHX podria protegir les cèl·lules PC12 de l'insult HG, vam tractar les cèl·lules PC12 amb un rang de concentracions d'extracte de BSHX (20, 50 i 100 mg/L) durant 48 h en condicions HG (75 mM). L'avaluació de la viabilitat cel·lular mitjançant l'assaig MTT va demostrar que l'insult de HG va provocar una disminució significativa de la viabilitat de les cèl·lules PC12 (la viabilitat cel·lular era d'aproximadament un 56,9 ± 6,7 per cent) i que el tractament amb extracte de BSHX va prevenir significativament la mort cel·lular de manera dependent de la concentració. La viabilitat cel·lular va augmentar fins al 87, 8 ± 9, 2 per cent quan les cèl·lules van ser cotractades amb extracte de BSHX (100 mg/L) (Figura 1A). La lactat deshidrogenasa (LDH) s'allibera de les cèl·lules danyades i, per tant, també es pot utilitzar com a indicador de toxicitat cel·lular. D'acord amb els resultats de l'assaig MTT, vam trobar que l'insult de HG va augmentar significativament l'alliberament de LDH de les cèl·lules PC12 i que el tractament amb extracte de BSHX va evitar l'alliberament de LDH de manera dependent de la concentració (Figura. 1B). Aquests resultats suggereixen que l'extracte de BSHX augmenta la viabilitat cel·lular. en cèl·lules PC12 induïdes per HG.

L'extracte de BSHX inhibeix l'apoptosi de les cèl·lules PC12 mitjançant la via depenent de la caspasa-9/3-

Per determinar l'efecte de l'extracte de BSHX sobre l'apoptosi cel·lular, hem utilitzat el colorant d'ADN Hoechst 33258 com a assaig sensible per a l'apoptosi. Els nuclis de cèl·lules normals tacades per Hoechst 33258 mostraven una fluorescència blava uniforme, mentre que les cèl·lules apoptòtiques amb picnosi del núvol de cromatina nuclear mostraven partícules fluorescents hipercromàtiques i denses. El percentatge d'apoptosi es va calcular segons el nombre de cèl·lules apoptòtiques enfront del nombre total de cèl·lules. Les nostres dades van revelar que l'insult de HG (75 mM) va augmentar dràsticament la proporció de cèl·lules apoptòtiques (51, 7 ± 4, 3 per cent) i el tractament amb extracte de BSHX va protegir significativament contra l'apoptosi induïda per HG a les cèl·lules PC12 (Figura.2A). Aquests resultats van ser recolzats a més per l'anàlisi de doble tinció AO/EB. L'AO entra tant a les cèl·lules normals com a les apoptòtiques i emet fluorescència verda, mentre que EB només entra a les cèl·lules apoptòtiques i emet fluorescència vermella [13]. L'assaig AO/EB va demostrar que el percentatge de cèl·lules apoptòtiques va augmentar significativament després de l'insult de HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 per cent) i va disminuir amb el tractament amb extracte de BSHX a les cèl·lules PC12 (figura 2B), cosa que suggereix que l'extracte de BSHX podria eficaçment. inhibir l'apoptosi de les cèl·lules PC12 induïda per HG.

A continuació, vam investigar l'efecte de l'extracte de BSHX sobre la via de la caspasa-3/PARP, una via important per a l'apoptosi relacionada amb els mitocondris [14]. Western blot va revelar que l'insult de HG (75 mM) va augmentar significativament les expressions de les formes actives de caspasa-3 i PARP i va disminuir les expressions de caspasa total-3 i PARP a les cèl·lules PC12, i aquest efecte es va invertir notablement. mitjançant el tractament amb extracte de BSHX (Figura.2C), cosa que suggereix que l'extracte de BSHX va protegir eficaçment les cèl·lules PC12 contra l'apoptosi mitjançant la regulació de la via de la caspasa-3/PARP depenent dels mitocondris.

L'extracte de BSHX inhibeix la producció intracel·lular de ROS a les cèl·lules PC12 induïdes per HG

Com que HG podria millorar la formació de ROS intracel·lular [15], vam provar el nivell de ROS intracel·lular per determinar si l'extracte de BSHX podria inhibir la generació de ROS. Es va observar un augment de 3,23- vegades en la intensitat mitjana de fluorescència observada a les cèl·lules PC12 que van estar exposades a 75 mM HG durant 48 h en comparació amb el control. En canvi, el cotractament amb extracte de BSHX va disminuir significativament la intensitat de fluorescència mitjana a aproximadament 0.76-, 0.{{10}} i 0.{ {12}}plegament del grup model, respectivament, indicant que l'extracte de BSHX podria inhibir la producció de ROS induïda per HG (figures.3A, B).

L'extracte de BSHX manté l'homeòstasi mitocondrial a les cèl·lules PC12 induïdes per HG mitjançant la regulació de l'expressió Bax i Bcl-2

El potencial de membrana mitocondrial és un paràmetre important de la funció mitocondrial utilitzat com a indicador de la salut cel·lular. JC-1 és un colorant lipòfil i catiònic que pot entrar selectivament als mitocondris i canviar de color de manera reversible de verd a vermell a mesura que augmenta el potencial de membrana. En cèl·lules sanes amb un alt potencial de membrana mitocondrial, JC-1 forma espontàniament complexos coneguts com a agregats J amb una fluorescència vermella intensa. D'altra banda, a les cèl·lules apoptòtiques amb baix potencial de membrana mitocondrial, JC-1 es manté en forma monomèrica, que només mostra fluorescència verda [16, 17]. Per tant, la proporció de fluorescència verda a fluorescència vermella pot reflectir la despolarització mitocondrial. En el nostre estudi, el nombre de cèl·lules amb mitocondris despolaritzats (fluorescència verda) va augmentar significativament després de HG (75 mM) durant 48 h, i aquest augment es va revertir mitjançant el tractament amb extracte de BSHX de manera dependent de la concentració (Figura.4A).

A continuació, vam detectar les distribucions mitocondrials i citoplasmàtiques del citocrom c, un actor clau en la via d'activació de l'apoptosi dependent de la caspasa. Vam trobar que l'insult de HG (75 mM) durant 48 h va induir una translocació dramàtica del citocrom c des dels mitocondris al citoplasma, i aquesta reubicació es va prevenir significativament amb el tractament amb extracte de BSHX (Figura 4B), cosa que indica que l'extracte de BSHX podria inhibir l'alliberament de citocrom c dels mitocondris.

A més, les proteïnes de la família Bcl-2 són reguladors importants de diverses vies apoptòtiques. Bcl-2 pot inhibir l'apoptosi cel·lular causada per una varietat de factors citotòxics i és l'inhibidor de l'alliberament del citocrom c dels mitocondris al citoplasma. Tanmateix, Bax, com a membre de la família Bcl-2, és un factor pro-apoptosi. Quan s'indueix l'apoptosi, Bax migra des del citoplasma als mitocondris i destrueix la integritat mitocondrial [5, 18]. En el nostre estudi, el nivell de proteïna de Bcl-2 es va regular a la baixa i Bax va ser regulat per HG (75 mM) durant 48 h, aquest efecte es va revertir depenent de la concentració mitjançant l'extracte de BSHX (Figura.4C). Tots aquests resultats anteriors van suggerir que l'extracte de BSHX protegia les cèl·lules PC12 contra la despolarització mitocondrial induïda per HG mitjançant la regulació de l'expressió de Bax i Bcl-2.

Efecte de l'extracte de BSHX sobre l'apoptosi cel·lular mitjançant vies de senyalització MAPK JNK/p38

Alguns estudis han demostrat que l'augment de la producció de ROS s'ha associat amb l'activació de les vies MAPK, per desencadenar l'apoptosi cel·lular9 [19, 20]. Així doncs, vam investigar l'efecte de l'extracte de BSHX sobre la via de senyalització de la proteïna quinasa activada per mitogens (MAPK) per determinar si l'extracte de BSHX podria atenuar l'apoptosi induïda per HG. Tal com es mostra a la figura 5, l'insult de HG (75 mM) durant 48 h va augmentar les fosforilacions de la quinasa terminal c-Jun NH2-terminal (JNK) i p38 a les cèl·lules PC12, que van ser inhibides significativament per l'extracte de BSHX en una concentració- manera dependent. Tanmateix, no es va observar un resultat similar amb MAPK de proteïna quinasa regulada extracel·lular (ERK). Els resultats suggereixen que l'extracte de BSHX podria inhibir l'apoptosi cel·lular induïda per HG mitjançant les vies de senyalització MAPK JNK/p38.

Discussió

L'encefalopatia diabètica (DE) és una complicació freqüent de la diabetis mellitus tipus 2 (DM2). Pot causar deteriorament cognitiu del cervell i és un factor de risc important de mortalitat i discapacitat en pacients amb diabetis mellitus tipus 2 a tot el món [3]. Per tant, és fonamental estudiar el mecanisme de la DE, així com les seves estratègies de prevenció i tractament.

A la Xina, les medicines tradicionals xineses (MTC) s'han utilitzat per al tractament de la DM durant molts anys i han demostrat un efecte curatiu. Alguns estudis clínics suggereixen que els TCM basats en la nutrició dels ronyons i les estratègies d'activació de la sang poden reduir la glucosa en sang, promoure la circulació i millorar la disfunció cognitiva cerebral. La recepta de BSHX és un representant d'aquests TCM. El nostre estudi clínic preliminar va demostrar que la prescripció de BSHX podria millorar eficaçment la glucosa en sang, l'homocisteïna (HCY) i la proteïna C reactiva d'alta sensibilitat (hs-CPR) en sèrum i millorar la funció cognitiva dels pacients diabètics amb deteriorament cognitiu lleu (MCI) [12]. Tanmateix, hi ha una manca d'evidència que demostri l'eficiència i el mecanisme farmacològic fins ara.

En aquest estudi, vam trobar que l'extracte de BSHX podria atenuar la reducció de la viabilitat cel·lular induïda per HG, tal com es mesura mitjançant l'assaig MTT, LDH. Per explorar encara més l'efecte protector de l'extracte de BSHX sobre la viabilitat cel·lular, vam estudiar l'apoptosi mitjançant l'anàlisi de tinció de Hoechst 33258 i AO/EB. Els resultats van mostrar que l'extracte de BSHX podria reduir significativament l'apoptosi induïda per HG. Com a marcador de l'apoptosi, la caspasa-3 i el PARP van augmentar significativament després del tractament amb HG, però l'activació d'aquests factors pro-apoptòtics va ser inhibida per l'extracte de BSHX de manera dependent de la concentració. Els resultats anteriors van indicar que l'extracte de BSHX tenia un efecte protector sobre el dany cel·lular PC12 induït per HG.

Les ROS es formen durant el procés de fosforilació oxidativa de les cèl·lules, i el seu augment de la producció o el dany dels sistemes antioxidants pot provocar estrès oxidatiu a les cèl·lules [21]. Els estudis han demostrat que la glucosa alta podria donar lloc a l'acumulació de ROS intracel·lular i, finalment, a una via de senyalització apoptòtica activa. I el mecanisme comú de les complicacions de la diabetis és l'estrès oxidatiu [22, 23]. Els nostres resultats van mostrar que la glucosa alta podria provocar un augment de ROS a les cèl·lules PC12, que era coherent amb estudis anteriors [24]. S'especula que la toxicitat de la glucosa alta per a les cèl·lules es pot aconseguir mitjançant l'apoptosi induïda per ROS. Els mitocondris són els principals llocs de producció intracel·lular de ROS i també l'òrgan diana principal per a l'atac de ROS [25]. En condicions patològiques, el ràpid augment de ROS pot provocar una disfunció mitocondrial, un col·lapse potencial de la membrana mitocondrial i, finalment, conduir a l'apoptosi cel·lular [26]. Així que vam detectar la integritat dels mitocondris. Els nostres resultats van mostrar que la glucosa alta va disminuir significativament el potencial de la membrana mitocondrial, va augmentar la proporció de Bax/Bcl-2 que controlava el canvi del porus de transició de la permeabilitat mitocondrial (MPTP) i va promoure la fuita del citocrom c, mentre que l'extracte de BSHX podria revertir aquests canvis. Aquests suggereixen que el neuroprotector de l'extracte de BSHX contra les cèl·lules PC12 induïdes per HG pot resultar del manteniment de la integritat dels mitocondris.

La via de senyalització MAPK també té un paper important en l'apoptosi cel·lular. JNK, ERK i p38 MAPK són els membres més estudiats de la família MAPK. La seva principal forma d'acció és fosforilar els seus llocs específics, regulant així l'apoptosi cel·lular [8, 27, 28]. A més, els estudis han demostrat que la producció excessiva de ROS pot desencadenar la fosforilació de p38MAPK [29-31], i les ROS poden induir o mediar l'activació de les vies MAPK [32]. Diversos estímuls cel·lulars que indueixen la producció de ROS també en paral·lel poden activar les vies MAPK en diversos tipus de cèl·lules [32, 33]. Els mecanismes potencials per a l'activació de MAPK per ROS poden incloure la inactivació i degradació de les fosfatases MAPK que mantenen la via en estat inactiu [19]. D'altra banda, per confirmar encara més si les vies MAPK es van activar per la generació de ROS, les cèl·lules van ser pretractades amb antioxidants (per exemple, NAC, un eliminador de ROS) per evitar l'acumulació de ROS. I els resultats van mostrar que l'activació de MAPK gairebé es va inhibir després de l'estimulació cel·lular amb estímuls cel·lulars [32, 33], cosa que indica la implicació de la inactivació de ROS de les vies MAPK. A més, els estudis van demostrar que quan es tractaven les cèl·lules amb l'inhibidor específic de JNK SP600125, es podria bloquejar l'apoptosi induïda per la Cardiotoxina III [34]. El nostre estudi anterior va trobar que la recepta modificada de Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) podria inhibir l'activació d'ERK/p38 MAPK a la microglia BV2 activada per A [10]. Tanmateix, en aquest estudi, vam trobar que l'extracte de BSHX podria inhibir la fosforilació de JNK i p38 MAPK i no vam aconseguir el mateix resultat amb p-ERK. Especulem que les sangoneres tenen un paper diferent en l'extracte de BSHX. Els resultats suggereixen que un altre mecanisme protector de l'extracte de BSHX contra l'apoptosi a les cèl·lules PC12 induïdes per HG pot ser mitjançant la regulació de les vies de senyalització MAPK JNK/p38.

Conclusió

L'extracte de BSHX, una fórmula poliherbal, mostra efectes neuroprotectors sobre les cèl·lules PC12 contra l'insult HG. L'extracte de BSHX va inhibir eficaçment l'apoptosi de cèl·lules PC12 induïda per HG mitjançant la disminució de la generació de ROS intracel·lular, el manteniment de la integritat de la membrana mitocondrial i el bloqueig de les vies de senyalització de la caspasa -3 i JNK/p38 MAPK (Figura.6). Col·lectivament, els nostres resultats suggereixen que l'extracte de BSHX és un agent prometedor per al tractament de la DE en aplicacions clíniques.

Aportacions de l'autor

Va concebre i dissenyar els experiments: Zeng KW, Wang XM. Va realitzar l'experiment: Zhao SY. S'han analitzat les dades: Zhao SY, Zeng KW i Wang XM. Reactius/materials/eines d'anàlisi aportades: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW i Wang XM. Va escriure el pater: Zhao SY.

Referències

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. El cervell diabètic i la cognició. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Lesió cerebral amb diabetis mellitus: evidència, mecanismes i implicacions del tractament. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. La teoria de la "memòria metabòlica" i el tractament precoç de la hiperglucèmia en la prevenció de complicacions diabètics. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. El potencial de membrana mitocondrial (Δψm) en apoptosi; una actualització. Apoptosi 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Connecting mitocondrial dynamics and life-or-dead events via Bcl-2 family proteins. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitocondris i mort cel·lular. Aspectes mecànics i qüestions metodològiques. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. 1, 25-(OH)2D3 inhibeix l'apoptosi alta induïda per la glucosa i la producció de ROS a les cèl·lules mesotelials peritoneals humanes mitjançant la via MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. El pretractament del factor de creixement nerviós atenua l'activació de la cinasa 1 aminoterminal c-Jun induïda per la privació d'oxigen i glucosa i l'activació de les cinases p38 i p38 activades per l'estrès i confereix neuroprotecció en el model PC12 de feocromocitoma. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et al. Implicació de la caspasa-3 i la proteïna quinasa activada per mitogen p38 en l'apoptosi induïda pel clorur de cobalt a les cèl·lules PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Efectes antineuroinflamatoris de la prescripció modificada de Wu-Zi-Yan-Zong a la microglia BV2 estimulada amb amiloide mitjançant les vies de senyalització MAPK NF-κB i ERK/p38. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. La recepta modificada de Wu-Zi-Yan-Zong, una fórmula poliherbal xinesa tradicional, suprimeix els processos neuroinflamatoris induïts per lipopolisacàrids en astròcits de rata mitjançant vies de senyalització MAPK NF-κB i JNK/p38. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Efecte de la prescripció de Bushen Huoxue en el tractament del deteriorament cognitiu lleu de la diabetis tipus 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Anàlisi de l'apoptosi induïda per cicloheximida en leucòcits humans: microscòpia de fluorescència mitjançant annexina V / iodur de propidi versus taronja d'acridina / bromur d'etidi. Biol cel·lular. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Les caspases connecten la senyalització de la mort cel·lular amb l'homeòstasi de l'organisme. Immunitat 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Òxid nítric: un factor clau darrere de la disfuncionalitat de les cèl·lules progenitores endotelials en la diabetis mellitus tipus-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: les longituds d'ona d'excitació alternatives faciliten la citometria del potencial de membrana mitocondrial. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Sondes de potencial de membrana mitocondrial i el gradient de protons: una guia pràctica d'ús. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green DR. Com indueixen les proteïnes BCL-2 la permeabilització de la membrana externa mitocondrial? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Proteïnes quinases activades per mitogens i espècies reactives d'oxigen: com pot ROS activar les vies MAPK? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Els èsters heterocíclics aromàtics de la podofilotoxina exerceixen activitat anti-MDR a les cèl·lules K562/ADR de leucèmia humana mitjançant la via de senyalització ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Orientació de la glicogen sintasa quinasa-3 per obtenir un benefici terapèutic contra l'estrès oxidatiu en la malaltia d'Alzheimer: implicació de la via Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. El paper de l'estrès oxidatiu en la neuropatia diabètica: generació d'espècies de radicals lliures en la reacció de glicació i polimorfismes genètics que codifiquen enzims antioxidants per a la susceptibilitat genètica a la neuropatia diabètica en la població de pacients diabètics tipus I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Mort cel·lular, espècies reactives d'oxigen (ROS) i complicacions de la diabetis. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. El ginkgolide B inhibeix l'apoptosi a les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana estimulades amb glucosa alta. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Paper perjudicial de la superòxid dismutasa a l'espai intermembrana mitocondrial. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Pis KB. Proteïnes quinases activades per mitògens: noves vies de senyalització que funcionen en les respostes cel·lulars a l'estrès ambiental. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. MiR-125b actua com a oncogen a les cèl·lules del glioblastoma i inhibeix l'apoptosi cel·lular mitjançant vies independents de p53 i p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Els productes finals de glicació avançada indueixen l'apoptosi de les cèl·lules epitelials de la còrnia humana mitjançant la generació d'espècies reactives d'oxigen i l'activació de les vies JNK i p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. La grelina inhibeix l'apoptosi a les cèl·lules neuronals hipotalàmiques durant la privació d'oxigen i glucosa. Endocrinologia 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A alteren les proteïnes reguladores del cicle cel·lular i indueix l'apoptosi mitjançant l'activació de p38MAPK depenent de l'espècie d'oxigen reactiva a la línia cel·lular de càncer de mama humà MCF-7. Biologia del tumor 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. Lesió oxidativa induïda per ROS implicada en la patogènesi de la queratitis fúngica mitjançant l'activació de p38 MAPK. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Activació induïda per espècies reactives d'oxigen de les vies de senyalització de la MAP cinasa. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. La senyalització redox i les vies de la cinasa MAP. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. La cardiotoxina III indueix apoptosi dependent de la cinasa N-terminal c-jun a les cèl·lules de leucèmia HL-60 humanes. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.