Potencial neuroprotector dels isotiocianats en un model in vitro de neuroinfamació

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Rebut: 10 de juliol de 2020 / Acceptat: 25 d'octubre de 2020 / Publicat en línia: 16 de novembre de 2020

© L'autor(s) 2020

Funció de pols d'herbes Cistanche: té una molt bonaefecte neuroprotector

Resum

Els isotiocianats (ITC), presents com a precursors de glucosinolats en verdures crucíferes, han demostratantiinflamatori, activitats antioxidants i anticancerígenes. Aquí, vam comparar els efectes de tres ITC diferents sobre la producció de ROS i sobre l'expressió de la metaloproteinasa matricial (MMP)-2 i -9, que representen factors patogenètics importants de diverses malalties neurològiques. Els cultius primaris d'astròcits de rata es van activar per LPS i es van tractar simultàniament amb diferents dosis d'isotiocianat d'alil (AITC), 2-isotiocianat de fenetil (PEITC) i 2-sulforafan (SFN). Els resultats van mostrar que SFN i PEITC van ser capaços de contrarestar la producció de ROS induïda per H2O2. L'anàlisi zimogràfica dels sobrenedants de cultiu cel·lular va evidenciar que PEITC i SFN eren els inhibidors més efectius de la MMP-9, mentre que només SFN va inhibir significativament l'activitat de la MMP-2. L'anàlisi de PCR va mostrar que tots els ITC utilitzats inhibien significativament tant l'expressió de MMP-2 com de MMP-9. La investigació sobre la via de senyalització de la proteïna quinasa activada per mitògens (MAPK) va demostrar que les ITC modulen la transcripció de MMP mitjançant la inhibició de l'activitat de la proteïna cinasa regulada per l'extracel·lular (ERK). Els resultats d'aquest estudi suggereixen que les ITC podrien ser agents nutracèutics prometedors per a la prevenció i el tractament complementari de malalties neurològiques associades a la implicació de MMP.

Paraules clauAntioxidant · Antiinflamatori · Isotiocianat · Metaloproteinases de matriu · Malalties neurodegeneratives

Introducció

La neuroinflamació és una resposta complexa a una lesió cerebral que implica una cascada d'esdeveniments bioquímics que condueixen a l'activació de cèl·lules residents del sistema nerviós central (SNC). L'activació aberrant dels astròcits compromet el seu paper neuroprotector provocant l'alliberament de mediadors inflamatoris, com les espècies reactives d'oxigen (ROS), l'òxid nítric (NO), les citocines, les quimiocines i les metaloproteinases de la matriu.

(MMPs).

Les MMP són una gran família d'endopeptidases neutres dependents de Zn2 més que tenen com a objectius principals els components de la matriu extracel·lular (ECM) com la fibronectina, el col·lagen, l'elastina i la laminina (Latronico i Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Departament de Biociències, Biotecnologies i Biofarmacèutica, Universitat de Bari "Aldo Moro",

Bari, Itàlia

Departament de Ciències, Universitat de Basilicata, Potenza,

Itàlia

Al SNC, les MMP estan implicades en diverses respostes fisiològiques, com ara la morfogènesi, la rotació i la remodelació de l'ECM, l'embriogènesi i la reparació de ferides; tanmateix, quan les MMP escapen dels mecanismes reguladors es tornen perjudicials (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

En aquest sentit, se sap que les alteracions en l'expressió i l'activitat de MMP són esdeveniments patogenètics clau en diversos trastorns neurològics (Latronico i Liuzzi 2017; Mastroianni i Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). L'evidència experimental ha suggerit que entre les MMP, les gelatinases A (MMP-2) i B (MMP{-9) estan especialment implicades en la neuroinflamació, ja que la seva regulació pot comprometre la integritat de la barrera hematoencefàlica (BBB). Això condueix a un augment del reclutament i la infiltració de cèl·lules de la sang perifèrica immune al parènquima cerebral perpetuant el procés inflamatori que és la causa de la pèrdua neuronal progressiva i la funció neuronal deteriorada (Rivest 2009). Diversos estudis in vitro i in vivo han demostrat que la producció de ROS és un dels factors implicats en la regulació positiva de l'expressió de MMP-9 a les cèl·lules cerebrals mitjançant mecanismes de senyalització de la proteïna cinasa activada per mitògens (MAPK) (Hsieh i Yang 2013).

A partir d'aquesta evidència, és evident que la regulació a la baixa dels factors neurotòxics, que resulta en respostes neuroinflamatòries reduïdes, pot representar una estratègia terapèutica eficaç per prevenir l'aparició o alleujar la progressió de les malalties cerebrals.

En els darrers anys, l'interès biomèdic en l'àmbit neurològic està cada cop més centrat en la recerca de compostos naturals capaços de modular els processos associats a les respostes neuroinflamatòries. En aquest sentit, diversos estudis han demostrat que els compostos fitoquímics, com els polifenols, els isotiocianats (ITC) i altres, tenen un potencial neuroprotector que també es deriva de la seva capacitat per inhibir l'expressió de MMP i contrarestar la producció de ROS (Dinkova-Kostova i Kostov). 2012; Liuzzi et al 2007, 2011).

Els isotiocianats són metabòlits produïts per diverses plantes de les famílies Brassicaceae com a sistema de defensa contra l'atac de patògens (Bones i Rossiter 2006). S'originen a partir de la degradació enzimàtica dels glucosinolats (GSL) per l'enzim mirosinasa. Les ITC estan presents a les verdures crucíferes de consum habitual com el bròquil, les cols de Brussel·les, la col, el nap, el rave picant, el col-rave, la mostassa, el rave, els créixens i la col. Les seves quantitats en els aliments són molt variables i depenen del processament i preparació dels aliments.

Recentment, s'ha demostrat que les ITC posseeixen una varietat d'efectes terapèutics, incloent acció antioxidant, antibacteriana, antiinflamatòria i quimiopreventiva (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

L'activitat protectora de les ITC es realitza mitjançant la modulació de diferents vies de senyalització implicades en la desintoxicació, la inflamació, l'apoptosi i la regulació del cicle cel·lular. Diverses evidències indiquen que les propietats anticancerígenes i antiinflamatòries dels ITC es podrien atribuir principalment a la seva capacitat d'activar la via del factor 2 relacionat amb el factor eritroide 2-nuclear (Nrf2). Nrf2 és un factor transcripcional redox-sensible que en presència d'agents electròfils i condicions d'estrès oxidatiu es trasllada al nucli on s'uneix als elements de resposta antioxidant (ARE), induint l'expressió de gens citoprotectors implicats en la desintoxicació i en la modulació de les condicions oxidatives i processos inflamatoris (Heiss et al 2001). En aquest sentit, s'ha informat que les ITC són capaços d'augmentar la capacitat antioxidant de les cèl·lules humanes induint l'expressió d'enzims desintoxicants de fase II i mitjançant la regulació de la producció de GSH (Wagner et al 2010). A més, s'ha informat de l'existència d'una conversa creuada entre Nrf2 i la via del factor nuclear (NF)-κB que dóna lloc a la modulació de la inflamació (Sturm i Wagner 2017; Lee i Johnson 2004). En aquest sentit, diversos models experimentals in vitro i in vivo de neuroinflamació han demostrat que les ITC són capaços de disminuir significativament la translocació de NF-κB amb la consegüent inhibició de citocines proinflamatòries i MMP (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

En aquest article, hem investigat l'efecte de tres ITC, és a dir, isotiocianat d'alil (AITC), 2-isotiocianat de fenetil (PEITC) i 2-sulforafan (SFN) sobre l'alliberament de MMP-2 i -9 així com en la producció de ROS per astròcits activats per LPS. Els nostres resultats van demostrar que PEITC, SFN i AITC són capaços d'inhibir in vitro l'expressió de MMP-9 i MMP{-2 en astròcits activats per LPS i de contrarestar la producció de ROS induïda per H2O2. A més, vam demostrar que les ITC modulen la sobreexpressió de les MMP amb mecanismes relacionats amb la inhibició de l'activitat de la proteïna cinasa regulada extracel·lular (ERK). Aquests resultats suggereixen que una dieta rica en verdures crucíferes pot tenir beneficis potencials per a la prevenció i el tractament complementari de malalties neurològiques.

Materials i mètodes

Productes químics i reactius

El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum boví fetal (FBS), la penicil·lina i l'estreptomicina van ser proporcionats per GIBCO (Paisley, Escòcia). Gelatina, DNasa 1, poli-L-lisina

(PLL), tripsina, lipopolisacàrid (LPS), blau de tripà i 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){-2.5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) ), Isotiocianat d'alil (AITC) [cod. 377.430, puresa 95 per cent (HPLC)], 2-Isotiocianat de fenetil (PEITC) [cod. 253.731, puresa 99 per cent )], 2-sulforafan (SFN) [cod. S6317, puresa superior o igual al 95 per cent (HPLC)] es va proporcionar de Sigma (St. Louis, MO, EUA). El diacetat de 2′,7′-diclorofluoresceïna (DCFH-DA) es va comprar a Calbiochem. Les proteïnes estàndard i el R-250 Coomassie Brilliant Blue eren de Bio-Rad (Hèrcules, CA, EUA). Els anticossos de la proteïna àcida fibril·lar anti-glial (GFAP) (RRID: AB_2294571) es van comprar a Serotec (Oxford, Regne Unit). Els anticossos contra les proteïnes quinases regulades per extracel·lulars (ERK) 1/2 i l'ERK 1/2 fosforilat (p-ERK 1/2) eren de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Les membranes de PVDF Hybond-P, el sistema d'anàlisi de Western Blotting de quimioluminescència millorada (ECL) i l'anticossos secundaris anti-ratolí-HRP eren de GE

Ciències de la vida sanitàries (Little Chalfont, Buckinghamshire,

El Regne Unit). Els parells d'encebadors específics per a MMP-2, MMP-9 i ARNr 18S eren de Sigma Genosys (Cambs, Regne Unit). El mini kit RNeasy i el kit de transcripció inversa QuantiTect es van comprar a Qiagen (València, CA, EUA). Els reactius Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix per a PCR es van comprar a Lucigen Corporation (Middleton, WI, EUA).

Declaració ètica

Els experiments amb animals es van dur a terme d'acord amb les recomanacions de la Guia del NIH per a la cura i l'ús d'animals de laboratori i amb l'aprovació del Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Bari, Itàlia (número de permís: 23-98- A).

Preparació de cultius d'astròcits

Es van preparar astròcits a partir dels teixits neocorticals de rates Wistar d'un dia d'edat (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Itàlia). Per a la preparació d'astròcits es van utilitzar 6 camades de 12 cries, cadascun dels dos sexes. Els animals van ser sacrificats per exposició al diòxid de carboni (CO2) i matats per decapitació ràpida. Els teixits neocorticals es van disseccionar i es van utilitzar per a la purificació de cultius de cèl·lules glials primàries seguint el mètode informat per Latronico et al. (2018). Breument, després de la dissecció, els cervells de rata es van esgotar de meninges i vasos sanguinis, es van picar mecànicament i es van digerir amb 0, 25 per cent de tripsina en presència de 0, 01 per cent de DNasa. Després de la centrifugació i l'avaluació de la viabilitat cel·lular, les cèl·lules es van xapar en matràs recoberts de PLL (75 cm2) a una densitat d'1,5 × 107 cèl·lules/matràs en DMEM, 10 per cent de FBS, 100 UI mL -1 penicil·lina, 100 µg mL -1 streptomicina. , i es manté a 37 graus en un 5 per cent de CO2. Després de 7 dies, es van sacsejar els flascons per eliminar els oligodendròcits i la microglia. La puresa dels astròcits, obtinguda per tripsinització (0, 25 per cent de tripsina / 0, 02 per cent d'EDTA), es va avaluar mitjançant immunotinció per a GFAP.

Tractament d'astròcits activats per LPS amb isotiocianat d'alil, isotiocianat de fenetil o 2-sulforafan

Els astròcits confluents, sembrats en 96 plaques de pou, es van estimular amb 10 µg mL -1 de LPS i es van tractar simultàniament amb diferents concentracions d'isotiocianat d'al·lil (AITC), 2-isotiocianat de fenetil (PEITC) o 2- sulforafan. (SFN) en DMEM sense sèrum. Els astròcits en astròcits sense sèrum activats per DMEM i LPS van representar controls negatius i positius, respectivament. A més, com que les solucions stock d'AITC (100 µM), PEITC (67 µM) i SFN (56,4 µM) es van fer en DMSO, una corba dosi-resposta a DMSO, diluïda en medi de cultiu a la mateixa concentració de dissolvent present a les mostres analitzades, es van executar per estimar la toxicitat del compost. Després de 20 h d'incubació a 37 graus, 5 per cent de CO2, els sobrenedants es van recollir i emmagatzemar a -20 graus fins al seu ús, mentre que les cèl·lules es van sotmetre a un assaig MTT per avaluar la viabilitat cel·lular.

Assaig de viabilitat cel·lular MTT

La citotoxicitat d'AITC, PEITC i SFN en astròcits es va detectar mitjançant el MTT [{{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,{{5 }}assaig de bromur de difenil tetrazoli]. Aquest assaig es basa en la reducció de MTT per la succinat deshidrogenasa mitocondrial en cèl·lules viables, a un producte de formazà blau insoluble que es pot mesurar espectrofotomètricament. Breument, després del tractament durant 20 h amb AITC, PEITC o SFN, es va eliminar el medi de cultiu i es van carregar les cèl·lules amb 0, 5 mg mL-1 de MTT. Després d'incubació durant 2 h a 37 graus, es va eliminar el 5% del medi de CO2 i es van solubilitzar els cristalls de formazà a les cèl·lules amb etanol al 90%. Després de sacsejar les plaques durant 15 min per obtenir la solubilització completa dels cristalls, es va determinar la quantitat del producte formazà mitjançant absorbància òptica a 560 nm amb una longitud d'ona de referència de 690 nm. La viabilitat cel·lular es va expressar com a percentatge de control (CTRL), representat per cèl·lules no tractades, que es va establir al 100 per cent. Per a cada compost, es va obtenir una corba dosi-resposta de la viabilitat cel·lular.

Detecció d'espècies reactives d'oxigen

La detecció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) es va realitzar carregant astròcits amb 10 μM de diacetat de 2′,7′-diclorofluoresceïna (DCFH-DA) en DMEM sense vermell de fenol a 37 graus durant 30 min. A continuació, es va eliminar DCFH-DA dels pous i les cèl·lules es van tractar durant 1 h amb AITC (400 μM), PEITC (10 μM) o SFN (25 μM) en DMEM sense vermell de fenol en presència d'H2O2 a la concentració final de 100 μM. . Les cèl·lules tractades només amb DCFH-DA o amb H2O2 representaven els controls negatius (CTRL) i positius (H2O2), respectivament. Després de la incubació, les cèl·lules es van esbandir amb PBS i es van lisar amb

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Tritó X-100 0,5 per cent, pH 7,5,

després es centrifuga a 10,000×g, 4 graus durant 10 min. Es van recollir sobrenedants i la seva anàlisi espectrofluorimètrica es va realitzar a 525 nm amb excitació a 485 nm. Els resultats es van normalitzar al contingut total de proteïnes i la producció de ROS es va expressar com a percentatge relatiu d'intensitat de fotoluminescència (PL) versus control positiu.

Detecció de gelatinases

L'activitat de la gelatinasa en els sobrenedants cel·lulars (SN) es va detectar mitjançant anàlisi zimogràfica tal com va informar Latronico et al. (2013). Breument, es va solubilitzar una quantitat de SN, corresponent a uns 10 µg de proteïnes totals, amb 30 µl de tampó de mostra Laemmli sense mercaptoetanol. Les mostres es van executar en un gel de poliacrilamida al 7,5% copolimeritzat amb gelatina al 0,1% (pes/v). Després de la prova electroforètica, els gels es van esbandir dues vegades amb un 2,5 per cent de Tritó X-100/10 mM de CaCl2 en 50 mM de Tris–HCl, pH 7,4 i es van incubar durant 24 h a 37 graus en un 1 per cent de Tritó X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Els gels es van tenyir amb blau brillant de Coomassie R-250 i es van descolorir en metanol/àcid acètic/H2O (4:1:5 v/v). L'activitat de la gelatinasa es va visualitzar com una banda clara de digestió sobre un fons blau del gel i es va quantificar mitjançant anàlisi d'imatges densitomètriques informatitzades mitjançant el programari Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Gelatinasa

L'activitat es va expressar com a densitat òptica (OD) × mm2, que representa l'àrea d'escaneig sota les corbes que té en compte tant la brillantor com l'amplada de la zona de lisi del substrat. Les dades es van expressar mitjançant l'equació següent: percentatge d'inhibició=[100 - (mostra OD/control positiu OD) × 100].

Reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT-PCR)

Els astròcits, sembrats en plaques de 6 pous, es van activar amb LPS (10 µg mL-1) i es van tractar simultàniament amb ITC a la màxima concentració no tòxica. Després de 20 h d'incubació, es va extreure l'ARN total dels astròcits mitjançant el mini kit Qiagen RNeasy segons les instruccions del fabricant. L'ADN complementari (ADNc) es va sintetitzar a partir de 500 ng d'ARN mitjançant el kit de transcripció inversa QuantiTect segons les instruccions del fabricant. Es van utilitzar un total de 25 ng de productes de transcripció inversa per amplificar un fragment de 591 pb mitjançant cebadors específics (sentit 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisentit 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) per a la seqüència MMP-2 de rata i un fragment de 541 pb utilitzant cebadors específics (sentit 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; antisentit 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) per a la seqüència MMP-9 de rata. Paral·lelament, es va realitzar l'amplificació d'un fragment de 308 pb d'ARNr 18S de rata (sentit 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisentit 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), un gen de referència interna relativament invariant. . Els conjunts d'imprimadors, ja validats en altres estudis (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) reconeixen específicament només els gens d'interès tal com indica l'amplificació d'una banda única de la mida esperada de la PCR. productes. L'amplificació per PCR es va dur a terme durant 25 cicles cadascun consistent en desnaturalització a 94 graus, recuit a 59 graus i extensió a 72 graus. Després de l'amplificació, els productes es van analitzar en gels d'agarosa a l'1,5 per cent. Després de l'anàlisi densitomètrica dels gels, l'amplificació dels gens objectiu es va normalitzar a l'expressió d'ARNr 18S i els resultats es van expressar com a percentatge d'inhibició en comparació amb el control positiu tal com es va informar per a la quantificació de la gelatinasa.

Detecció de fosforilació ERK 1/2 mitjançant anàlisi de western blot

ERK 1/2 es va detectar mitjançant l'anàlisi d'immunoblot tal com es va informar a Latronico et al. (2018). En resum, primària confluent

els astròcits xapats en plaques de {{{0}}pous, que es van fer quiescents en medi sense sèrum durant 24 h, van ser pretractats durant 1 h amb AITC (4{00 μM), PEITC (10 μM), o SFN (25 μM) en DMEM sense vermell de fenol. Després de l'estimulació durant 2 h amb 10 ug mL-1 de LPS, les cèl·lules es van lisar amb 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 2,5 mM de Na-pirofosfat, 1 mM de glicerofosfat 1 per cent de Triton X-100, 1 mM. fenilmetilsulfonil forade, 20 ug/ml aprotinina, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuorur, 1 mM Na3VO4, pH 7,5. Seixanta ug de proteïnes totals de cada mostra es van resoldre mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida SDS al 10% i les proteïnes es van immunoblotar a membranes de difluorur de polivinilidè. Després de bloquejar durant la nit a 4 graus amb 0,05 per cent de Tween 20, 1 per cent de llet, 1 per cent d'albúmina sèrica bovina en 150 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), les membranes es van sondar durant la nit a 4 graus amb un anti-p- monoclonal. Anticòs ERK 1/2 (1:500). A continuació, les membranes es van rentar tres vegades amb Tween 20 al 0,05 per cent en solució salina tamponada amb Tris, es van sondar amb anticossos secundaris anti-ratolí-peroxidasa de rave picant (1:20,000) durant 2-h a 24 graus i es van detectar. amb quimioluminescència millorada. Per avaluar la quantitat total d'ERK, les membranes es van retirar i incubar amb un anticòs específic per a ERK 1/2 no fosforilat (1:500). Les intensitats de la banda es van quantificar mitjançant l'exploració densitomètrica de taques i els nivells de fosforilació d'ERK 1/2 es van normalitzar a ERK 1/2 no fosforilat i es van expressar com a percentatge en comparació amb el control positiu (astròcits tractats amb LPS), segons el equació següent:

percentatge de pERK 1/2=(mostra DO/control positiu DO) × 100.

Anàlisi estadística

L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Les dades es van expressar com a valors mitjans ± SD. L'anàlisi estadística es va dur a terme mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) seguida de la prova post hoc de comparació múltiple de Dunnett.

Resultats

Efecte dels compostos isotiocianats sobre la viabilitat dels astròcits

Es van realitzar experiments preliminars per avaluar la citotoxicitat d'AITC, PEITC o SFN. Amb aquesta finalitat, els astròcits purificats es van tractar durant 20 h amb els compostos ITC a concentracions que oscil·laven entre 5 i 400 µM o amb DMSO diluït en medi de cultiu tal com es descriu a la secció de mètodes. Com es mostra a la figura 1, el DMSO no era tòxic en totes les concentracions utilitzades que coincideixen amb les de les solucions ITC provades. Entre les ITC investigades, AITC

Fig. 1 Viabilitat cel·lular d'astròcits tractats amb compostos isotiocianats. Els astròcits primaris confluents es van tractar durant 20 h amb isotiocianat d'alil (AITC), 2-isotiocianat de fenetil (PEITC) o 2-sulforafan (SFN) a les concentracions indicades i després es van sotmetre a l'assaig MTT. A més, com que es trobava a les solucions d'emmagatzematge es van dissoldre en dimetil sulfòxid (DMSO), en cada experiment es va executar una corba dosi-resposta a DMSO, diluïda en medi de cultiu a la mateixa concentració de dissolvent (per cent) present a les mostres ITC. una estimació fiable de la toxicitat de l'ITC. El control (CTRL) va ser representat

perfumada d'astròcits no tractats en DMEM sense sèrum. Els gràfics representen les corbes dosi-resposta de la viabilitat cel·lular, expressades com a percentatge de supervivència cel·lular en comparació amb el control. Les dosis de compostos que determinaven la viabilitat cel·lular per sobre del 60% es van escollir com a concentracions màximes no tòxiques. Els valors són la mitjana ± SD de n=3 experiments realitzats en diferents poblacions cel·lulars. Les micrografies mostren resultats representatius de la morfologia cel·lular observada sota un microscopi de contrast de fase (augment de 50X) després del tractament amb els diferents compostos.

era el menys tòxic per als astròcits. En particular, l'AITC no era tòxic per a cèl·lules de fins a 400 µM mentre que PEITC i SFN eren tòxics a concentracions superiors a 10 i 25 µM, respectivament. L'observació microscòpica va confirmar els resultats de l'assaig MTT mostrant que a les concentracions tòxiques de PEITC i SFN, els astròcits es reduïen en nombre i els que quedaven mostraven canvis citotòxics en el seu citoplasma.

Efecte protector dels compostos ITC sobre la producció de ROS en astròcits tractats amb peròxid d'hidrogen

Per avaluar l'efecte protector de les ITC cap a l'estrès oxidatiu, els astròcits es van tractar prèviament amb PEITC, AITC i SFN a la màxima concentració no tòxica i després es van estimular amb H2O2. La producció intracel·lular de ROS, induïda per H2O2, va ser analitzada per DCFH-DA. Com es mostra a la figura 2, l'exposició a H2O2 va millorar el senyal fluorescent

Fig. 2 Producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) en astròcits tractats amb ITC. La presència de ROS es va analitzar mesurant els canvis del senyal fluorescent de 2′,7′-diclorofluoresceïna (DCFA) tal com es va informar a la secció Materials i mètodes. Els astròcits, sembrats en plaques de 6 pous, es van tractar prèviament durant 30 min amb DCFA i després es van tractar durant 1 h amb 10 μM PEITC, 400 μM AITC o 25 μM SFN en presència d'H2O2 a una concentració final de 100 μM. . Els astròcits tractats només amb DCFA (CTRL) o amb 100 μM H2O2 van representar un control negatiu i positiu, respectivament. El senyal fluorescent detectat en els lisats cel·lulars es va mesurar amb un fluoròmetre a 525 nm sota excitació a 485 nm. La producció de ROS es va expressar com a percentatge (per cent) d'intensitat de fotoluminescència (PL) en comparació amb el control positiu. Els valors són la mitjana ± SD de n=3 experiments realitzats en diferents poblacions cel·lulars. La disminució estadísticament significativa en comparació amb H2O2 s'indica amb asteriscs (ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de Dunnet; *p <>

astròcits en comparació amb el control (CTRL). Com ho demostra la disminució de la intensitat de fluorescència de DCF, el pretractament dels astròcits amb compostos ITC va contrarestar la generació de ROS induïda per H2O2. Entre les ITC provades, només PEITC i SFN van ser capaços de reduir significativament la producció de ROS en un 20 i 24 per cent, respectivament, en comparació amb un control positiu (H2O2).

Els compostos d'isotiocianat inhibeixen els nivells de MMP-2 i MMP-9 en astròcits activats per LPS

L'efecte dels compostos ITC sobre els nivells de MMP-2 i MMP{-9 es va avaluar en astròcits activats amb LPS, que se sap que indueix l'expressió de gelatinases (Gottschall i Deb 1996) i tractats simultàniament amb AITC, PEITC o SFN en el rang de concentracions que no eren tòxiques per a les cèl·lules. Com es mostra a la figura 3a, hi havia dues bandes clares de digestió de 72 i 92 kDa al gel corresponents, respectivament, a MMP-2 i MMP-9. L'activació d'astròcits amb LPS va augmentar els nivells de MMP-2 i va induir la síntesi de MMP-9. El tractament amb AITC (Fig. 3b), PEITC (Fig. 3c) o SFN (Fig. 3d) va determinar una dependència de la dosi.

reducció dels nivells de MMP-9, que variava segons el compost utilitzat. En particular, entre les ITC utilitzades, SFN va ser la més eficaç per inhibir la MMP-9, ja que va determinar un 70 per cent d'inhibició a la dosi de 10 μM i un 100 per cent d'inhibició a la dosi de 25 μM. A més, només SFN a la màxima concentració no tòxica va poder inhibir significativament la MMP -2 (figura 2d).

Els compostos d'isotiocianat inhibeixen l'expressió gènica de MMP-2 i MMP-9 en astròcits activats per LPS

Per determinar si els compostos ITC estudiats eren capaços d'inhibir l'expressió de MMP-2 i MMP-9, es va realitzar RT-PCR en astròcits activats per LPS tractats amb la màxima concentració no tòxica d'ITC. Com es mostra als gels representatius de la figura 4a, el tractament dels astròcits activats per LPS amb els ITC individuals va poder contrarestar l'augment de l'expressió de l'ARNm de MMP-2 i MMP-9. Tal com es mostra a la figura 4b, l'anàlisi quantitativa dels resultats va evidenciar que, a la màxima concentració no tòxica, els compostos ITC van determinar una inhibició estadísticament significativa de l'expressió de MMP-2 i MMP{-9 en comparació. a un control positiu (LPS). En particular, PEITC i SFN exerceixen el mateix percentatge d'inhibició sobre MMP-2 (85 per cent) i MMP-9 (100 per cent), mentre que l'AITC va ser menys efectiu que PEITC i SFN per inhibir la MMP{{17} } (65 per cent ) i expressió MMP-9 (90 per cent ).

ERK 1/2 està implicat en la inhibició de l'expressió de MMP per ITC

Atès que ERK 1/2 és la principal via de transducció de senyalització implicada en la regulació de l'expressió de MMP-2 i MMP{-9 en astròcits activats per LPS (Lee et al. 2003), l'efecte dels compostos ITC sobre el Es va provar l'activació de proteïnes quinases regulades extracel·lulars (ERK) 1/2.

Tal com es mostra a la figura 5, LPS va induir un augment estadísticament significatiu dels nivells d'ERK 1/2 fosforilat (p-ERK) que es va contrarestar amb el pretractament amb els compostos ITC.

Discussió

Es creu que les principals estratègies de defensa contra moltes malalties consisteixen principalment en evitar factors de risc i adoptar un estil de vida correcte. Hi ha nombroses evidències científiques que recolzen la hipòtesi que alguns metabòlits naturals, típicament produïts per diversos tipus de fruites i verdures, són capaços de modular fenòmens patològics com el càncer, les malalties neurològiques i altres malalties multifactorials. En aquest escenari, els isotiocianats (ITC) van despertar un gran interès donat el seu antifúngic, antibacterià,

Fig. 3 Efecte dels compostos d'isotiocianat sobre els nivells de MMP-2 i MMP{-9 en astròcits activats per LPS. En a s'informa d'un gel zimogràfic representatiu de l'anàlisi dels sobrenedants de cultiu d'astròcits activats amb LPS (10 ug mL-1) i tractats simultàniament durant 20 h amb AITC, PEITC o SFN a les concentracions indicades (μM). Es van obtenir controls negatius i positius d'astròcits no estimulats i no tractats en medi sense sèrum (CTRL) i LPS-

cèl·lules activades (LPS), respectivament. Els histogrames b–d representen els resultats (mitjana ± SD) de n {{0}} experiments realitzats en diferents poblacions cel·lulars, expressats com a percentatge d'inhibició de MMP en comparació amb LPS, calculats després de la densitometria d'escaneig i l'anàlisi informatitzada de gels . La disminució estadísticament significativa en comparació amb LPS s'indica amb asteriscs (ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de Dunnet; *p <0,05, **p=""><>

propietats biològiques anticancerígenes, antimutagèniques, antioxidants i antiinflamatòries (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay i Fahey 2001). Els isotiocianats s'originen a partir de la degradació enzimàtica dels glucosinolats (GSL) que són metabòlits secundaris presents en 15 famílies botàniques de l'ordre de Capparales i que són molt abundants a la família de les Brassicaceae (Fahey et al. 2001). Els GSL són hidrolitzats per la mirosinasa (-tioglucòsid glucohidrolasa e; EC 3.2.3.147) en una varietat de components com ara ITC, nitrits, tiocianats, epitionitrils, SFGate, glucosa i oxazolidines (Li i Kushad 2005). Tot i que les ITC s'han estudiat àmpliament en l'àmbit quimioterapèutic (Grundemann i Huber 2018), s'han fet poques investigacions sobre el seu potencial terapèutic en malalties neurològiques, tot i que s'ha demostrat la capacitat de SFN i AITC per creuar la BHE i acumular-se al parènquima cerebral. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). En aquest article, hem comparat els efectes de tres ITC,

present en diverses verdures crucíferes de consum habitual, en la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i en l'expressió de metaloproteinasa matricial (MMP) en un model in vitro de neuroinflamació representat per astròcits activats amb lipopolisacàrids (LPS) o tractats amb H2O2. Els astròcits, el tipus de cèl·lules glials més abundants del SNC, tenen un paper crucial en el manteniment de l'homeòstasi cerebral i són els distintius de diferents malalties neurològiques (Cekanaviciute i Buckwalter 2016; Colombo i Farina 2016). Es consideren reguladors crucials de la resposta immune innata i la seva resposta a insults nocius, com l'estrès oxidatiu, pot agreujar les reaccions inflamatòries i el dany dels teixits o promoure la reparació dels teixits. És ben sabut que els astròcits activats produeixen factors neurotòxics com les MMP que tenen un paper clau en la promoció de la neuroinflamació i la pèrdua neuronal progressiva en malalties neurològiques (Hsieh i Yang 2013). Per tant, la modulació de la

Fig. 4 Efecte dels compostos ITC sobre l'expressió de MMP-2 i MMP-9 en astròcits activats per LPS. Els astròcits, sembrats en plaques de 6 pous, es van activar amb LPS (10 µg mL-1) i es van tractar simultàniament durant 20 h amb AITC (400 µM), PEITC (10 µM) o SFN (25 µM), després es van sotmetre a RT-PCR. Els gels d'agarosa representatius de l'expressió MMP-2 i MMP-9 es mostren a (a). Els histogrames de (b) representen els resultats (mitjana ± SD) d'n=3 experiments realitzats en cèl·lules diferents

Els esdeveniments que es produeixen després de l'activació dels astròcits podrien mitigar la resposta inflamatòria i el dany neuronal.

Els resultats d'aquest estudi van indicar que entre les ITC estudiades, l'AITC era menys tòxica, ja que no va provocar cap reducció de la viabilitat cel·lular a totes les concentracions utilitzades. Per contra, de manera similar al que han observat altres autors en diverses línies de cèl·lules glials, PEITC i SFN van mostrar toxicitat cel·lular a concentracions superiors a 10 i 25 µM, respectivament (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. 2018; Su et al. .2015).

A la literatura científica actual, hi ha moltes dades controvertides sobre els mecanismes moleculars subjacents als efectes de les ITC sobre la viabilitat cel·lular. En aquest sentit, la majoria dels estudis han suggerit que les ITC inhibeixen l'apoptosi que indueix el creixement cel·lular, l'aturada del cicle cel·lular, la generació de ROS a les cèl·lules cancerígenes però no a les cèl·lules normals (Fofaria et al. 2015; Qin et al. al. 2018; Sestili i Fimognari 2015). Vam trobar que SFN i PEITC, però no AITC, tenen un paper protector contra l'estrès oxidatiu en els astròcits, de fet, a les màximes concentracions no tòxiques van ser capaços de contrarestar la producció de ROS induïda per l'exposició a H2O2. El SNC és especialment vulnerable a l'estrès oxidatiu a causa del seu alt consum d'oxigen, sistemes antioxidants febles i alt contingut de biomacromolècules susceptibles a l'oxidació. Es creu que la generació de ROS i el dany oxidatiu està implicada en la patogènesi de trastorns neurològics com la malaltia d'Alzheimer (MA), la malaltia de Parkinson (EP), l'esclerosi lateral amiotròfica (ELA) i l'esclerosi múltiple (EM) (Lee et al. 2015). Per tant, tot i que en els nostres experiments in vitro SFN i PEITC van contrarestar la producció de ROS en una mesura moderada, podríem suposar que in vivo una administració prolongada d'ITC pot conduir a una reducció més significativa de les ROS que, amb el temps, pot donar lloc a una reducció significativa de les ROS. per a poblacions expressades com a percentatge d'inhibició de MMP en comparació amb el control positiu (LPS), calculat després de la densitometria d'escaneig i l'anàlisi informatitzada de gels. La disminució estadísticament significativa de l'expressió MMP-2 i MMP-9 en comparació amb LPS s'indica amb asteriscs (ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de Dunnet; *p <>

la prevenció i la modulació de les malalties del cervell. ROS actua com una molècula de senyalització crítica per desencadenar la cascada de resposta inflamatòria al SNC. En aquest sentit, és ben sabut que les ROS regulen l'expressió de molts gens implicats en la neuroinflamació mitjançant l'activació de factors de transcripció proinflamatoris com el factor nuclear-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). En aquest escenari, les MMP tenen un paper important l'expressió de les quals està regulada per ROS mitjançant l'activació de NF-κB (Yan i Boyd 2007).

Com que la desregulació de la MMP contribueix a la patogènesi de nombroses malalties neuroinflamatòries i neurodegeneratives, la seva inhibició representa una estratègia terapèutica important. Per aquest motiu, l'interès creixent s'ha centrat en l'última dècada en el potencial dels fàrmacs i compostos naturals per inhibir les MMP. Nombrosos estudis in vitro han demostrat que l'acció antiinflamatòria i antioxidant de diversos fàrmacs i compostos bioactius presents en vegetals i organismes marins s'associa amb la seva capacitat per inhibir l'expressió de MMP (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. .2015). En aquest estudi, vam demostrar que entre els ITC provats, SFN i PEITC eren els més efectius per inhibir els nivells de MMP-2 i MMP{-9 i l'expressió en astròcits activats per LPS. La inhibició de les MMP per part de les ITC s'ha informat en altres estudis in vivo i in vitro. En particular, Li et al. (2013) van demostrar que SFN és capaç de mitigar el dany de la BBB inhibint l'expressió de MMP-9 en un model in vivo d'encefalomielitis autoimmune experimental. Altres autors van informar que SFN va poder atenuar l'expressió de MMP-9 després de lesions de la medul·la espinal en ratolins (Mao et al. 2010a). A més, estudis in vitro van demostrar que la supressió per part de les ITC de la migració cel·lular i

Fig. 5 La quinasa extracel·lular regulada per senyal 1/2 (ERK 1/2) està implicada en la inhibició de l'expressió de MMP pels compostos ITC. Pel·lícules autoradiogràfiques representatives de l'anàlisi de western blotting de lisats d'astròcits pretractats durant 1 h amb AITC (400 μM), PEITC (10 μM) o SFN (25 μM) i després activats durant 2 h amb LPS (10 ug ml{{ 13}}). Les cèl·lules no tractades i no estimulades representen el control negatiu (CTRL). L'histograma de (b) representa que la invasió dels nivells de pERK1/2 a les cèl·lules del glioma C6 es va associar amb la inhibició de l'expressió de MMP-9 mediada per NF-κB (Lee et al. 2015).

Els mecanismes moleculars pels quals les ITC inhibeixen les MMP no estan clars i no hi ha estudis que investiguin les propietats antioxidants i antiinflamatòries de les ITC en cultius d'astròcits primaris. Diversos estudis donen suport a la hipòtesi que l'efecte inhibidor de les ITC és conseqüència de la seva capacitat per bloquejar NF-κB per la via de senyalització Nrf2. En aquest sentit, un estudi in vivo demostra que els ratolins eliminadors de Nrf2 eren més susceptibles a la resposta inflamatòria de la medul·la espinal mediada per NF-κB i a l'augment de l'expressió de gens dependents de NFκB, inclòs MMP-9 (Mao et al. 2010b). ). Tot i que les vies NF-κB i Nrf2 podrien interactuar, vam demostrar que la regulació de NF-κB es produeix també mitjançant la modulació de mecanismes moleculars independents de Nrf2. De fet, vam trobar que l'AITC, el PEITC i l'SFN van inhibir l'activació d'ERK1/2, que juga un paper fonamental en la cascada d'esdeveniments de transducció del senyal que finalment regulen la transcripció del gen MMP.

No obstant això, l'evidència experimental que SFN a la màxima concentració no tòxica va inhibir completament tant l'expressió com els nivells de MMP-9, mentre que l'AITC i el PEITC van inhibir fins al màxim l'expressió de MMP-9 però només van deixar caure la MMP{{3} } al voltant del 50 per cent, podria suggerir que aquests compostos modulen la transcripció de MMP-9 amb diferents mecanismes d'acció. En aquest sentit, s'ha informat que SFN, a més de la inhibició de l'activació induïda per LPS de NF-κB, interfereix amb la unió de LPS al receptor TLR4 (Koo et al 2013). L'efecte inhibidor de SFN sobre TLR4 podria prevenir l'activació dels astròcits per part de LPS i això pot provocar la inhibició aigües amunt de l'expressió de MMP-9 amb una consegüent manca de producció de MMP-9.

obtingut després de l'exploració densitomètrica de pel·lícules autoradiogràfiques i la normalització a ERK 1/2 no fosforilada. Les dades representen mitjans ± SD d'n=3 experiments realitzats en diferents poblacions cel·lulars. Els asteriscs representen valors estadísticament diferents del control positiu (astròcits activats per LPS), que es va establir en un 100 per cent (ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de comparació múltiple de Dunnett; *p <>

Conclusions

En resum, les nostres dades indiquen que el tractament d'astròcits amb ITC redueix la formació de ROS i inhibeix l'alliberament de MMP-2 i MMP{-9, proporcionant nous coneixements sobre les propietats antioxidants i antiinflamatòries de les ITC en glial. cèl · lules. Aquests resultats suggereixen que les ITC podrien ser agents nutracèutics prometedors per al desenvolupament d'intervencions de neuronutrició, basades en l'ús d'aliments saludables, per a la prevenció i tractament complementari de malalties neurològiques.

Finançament Finançament d'accés obert proporcionat per la Università Degli Studi di Bari Aldo Moro dins de l'Acord CRUI-CARE.

Compliment de les normes ètiques

Conflicte d'interessos Els autors declaren no conflicte d'interessos.

Accés obert Aquest article té una llicència Creative Commons Attribution 4.0 International License, que permet l'ús, la compartició, l'adaptació, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà o format, sempre que doneu el crèdit adequat a l'autor original. (s) i la font, proporcioneu un enllaç a la llicència Creative Commons i indiqueu si s'han fet canvis. Les imatges o altres materials de tercers d'aquest article s'inclouen a la llicència Creative Commons de l'article tret que s'indiqui el contrari en una línia de crèdit del material. Si el material no està inclòs a la llicència de Creative Commons de l'article i el vostre ús previst no està permès per la normativa legal o supera l'ús permès, haureu d'obtenir el permís directament del titular dels drets d'autor. Per veure una còpia d'aquesta llicència, visiteu http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.