L'obacunona atenua la fibrosi hepàtica amb la millora dels efectes antioxidants de GPx-4 i la inhibició de l'EMT

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:L'obacunona, un triterpenoide de limonina extret de la planta Phellodendronchinense Schneid o Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, provoca una varietat d'efectes farmacològics com ara antiinflamatoris, antineoplàstics, antioxidants i antifibrosi pulmonars. No obstant això, l'efecte antifibròtic de l'obacone i el mecanisme subjacent detallat de la fibrosi hepàtica encara no està clar. La fibrosi hepàtica és una malaltia debilitant que amenaça la salut humana. El factor de creixement transformador (TGF)- /P-Smad és una via important de fibrosi que presenta transformacions epitelial-mesenquimals (EMT) i deposicions de col·lagen, acompanyades d'excés de radicals lliures d'oxigen. Nrf-2 actua com un regulador antioxidant clau que impulsa les expressions de diversos gens relacionats amb antioxidants. La glutatió peroxidasa-4(GPx{-4) és un membre de la família de la glutatió peroxidasa que inhibeix directament l'oxidació dels fosfolípids per alleujar l'estrès oxidatiu. En el present estudi, hem volgut explorar el paper de la columna vertebral en el model de fibrosi hepàtica del ratolí induït per tetraclorur de carboni (CCl4) i en cèl·lules estelades hepàtiques (línia cel·lular LX2) desafiades amb TGF-. L'obacunona va demostrar potents efectes millorants sobre la fibrosi hepàtica tant en LX2 activat com en teixits hepàtics de ratolins amb nivells reduïts de -SMA, col·lagen1 i vimentina. Obacunone també va suprimir notablement els senyals TGF-/P-Smad i el procés EMT. Mentrestant, l'obacunona va exercir un potent efecte anti-oxidació reduint els nivells d'espècies reactives d'oxigen (ROS) en ambdós models. L'efecte antioxidant de la columna vertebral es va atribuir a l'activació de GPx-4 i Nrf-2. A més, l'efecte terapèutic de la columna vertebral a les cèl·lules LX2 es va eliminar significativament in vitro més amb l'antagonista de GPx-4 RSL3, en paral·lel amb els nivells reelevats de ROS.puritans vitamina cAixí, demostrem que la columna vertebral és capaç d'atenuar la fibrosi hepàtica mitjançant la millora del senyal GPx-4 i la inhibició de la via TGF-/P-Smad i el procés EMT.

Paraules clau:columna vertebral; fibrosi hepàtica; EMT; cèl·lules estelades hepàtiques; GPx-4;TGF-;estrès oxidatiu

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

L'hepatitis crònica sol ser causada per hepatitis viral, esteatosi no alcohòlica, hepatitis alcohòlica i hepatitis autoimmune. La lesió hepàtica persistent pot acabar en fibrosi hepàtica, o fins i tot càncer de fetge, que va afectar mortalment la salut humana [1]. La fibrosi hepàtica és un tipus de resposta no curativa de la ferida sota els factors de lesió contínues caracteritzats per l'acumulació exagerada de matriu extracel·lular (ECM) i la formació de cicatrius [2]. Les cèl·lules estel·lades hepàtiques (HSC) solen estar en estat de repòs en condicions normals, es van activar de manera aberrant sota una lesió hepàtica crònica i presentaven una gran proliferació i secrecions d'ECM [3], denominades miofibroblasts [4]. Entendre el mecanisme d'activació de l'HSC és de gran valor per al desenvolupament de noves terapèutiques per al tractament de la fibrosi hepàtica.

El factor de creixement transformador (TGF-) promou respostes inflamatòries estimulant l'expressió de la interleucina-1 (IL-1) i la interleucina-6(IL{-6) als monòcits [5]. A més, indueix metàstasi del càncer mitjançant la transformació epitelial-mesenquimal (EMT) i l'escapament immune del tumor [6-8]. L'EMT es refereix a un procés fisiològic dinàmic en què les cèl·lules epitelials perden la seva polaritat i es transformen en cèl·lules mesenquimals com fibroblasts i miofibroblasts, donant lloc així al desenvolupament de fibrosi [9]. L'aparició d'EMT sempre s'associa amb la regulació a la baixa de la cadherina E i la regulació a l'alça dels marcadors de cèl·lules mesenquimals, com ara la N-cadherina i el cargol[10]. L'activació de TGF- -Smad és una de les principals vies intracel·lulars de l'EMT, així com la formació de miofibroblasts [11].

L'estrès oxidatiu es considera una de les principals causes de fibrosi amb la sobreproducció d'espècies reactives d'oxigen (ROS)[12]. L'alt nivell de ROS causa danys estructurals a les biomolècules, com ara proteïnes, lípids i ADN, que eventualment condueix a lesions cel·lulars i la promoció de la fibrosi [13]. Sota estrès oxidatiu, el dímer de Nrf-2-Keep-1 està dissociat, el factor respiratori nuclear-2(Nrf{-2) es transporta al nucli i indueix l'expressió de diversos Els enzims antioxidants en unir-se amb els elements de resposta antioxidant (ARE) redueixen els nivells de ROS [14]. La glutatió peroxidasa-4 (GPx{-4) ​​actua com una proteïna antioxidant amb activitat glutatió peroxidasa, sent la principal responsable de la inhibició de l'oxidació de fosfolípids i la producció de ROS en el procés de ferroptosi [15].resistènciaEls estudis amb ratolins han demostrat que la fibrosi s'agreuja després de la pèrdua de Nrf-2 o GPx{-4 [16,17].

Cistanche pot anti-envelliment

Actualment, hi ha diversos fàrmacs disponibles per al tractament de la fibrosi hepàtica, inclosos els que tenen propietats antiinflamatòries [18], antioxidants [19] i agonistes dels receptors activats per proliferadors de peroxisomes (PPAR) [20]. En un estudi recent, el professor Yu va trobar que els pacients amb cirrosi hepàtica tenen nivells d'oxidació de lípids més alts en comparació amb els controls sans en mostres clíniques [21]. Diversos fàrmacs antioxidants com el resveratrol[19] i l'àcid ursòlic |13]han demostrat bons efectes sobre la fibrosi. Aquesta evidència suggereix acumuladament que l'antioxidació és una estratègia prometedora per tractar l'antifibrosi.

La pirfenidona (PFD) és un fàrmac de piridina per a la fibrosi pulmonar idiopàtica (IPF), mentre que també manifesta un bon efecte terapèutic sobre la fibrosi hepàtica en múltiples estudis [22,23]. Per tant, PFD es selecciona com a medicament de control positiu en aquest estudi. L'obacunona (Oba) és un compost limonoide natural extret de plantes rutàcies com Phellodendri i Dictamnus-dasycarpus [24], que posseeixen diverses propietats biològiques com ara antiinflamatòria |25, antioxidant [26] i antitumorals [27]. Informes recents han revelat que Oba és un fort agonista de Nrf-2, que va alleujar eficaçment la fibrosi pulmonar mitjançant la inducció de CCL4 i el dany oxidatiu a les cèl·lules MDA-MB{-231 causades per H,O2. Més important encara, Oba no és tòxic per als ratolins [28]. Tanmateix, no s'informen sobre l'efecte de l'Oba en la fibrosi hepàtica, especialment sobre l'oxidació antifosfolípid que media GPx-4, els senyals TGF- -Smad i el procés EMT. Aquí, pretenem explorar els efectes d'Oba sobre la fibrosi hepàtica i definir els mecanismes moleculars subjacents.

2. Resultats

2.1. Activació de TGF- -Lx induïda-2 inhibida per Oba

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Curiosament, amb l'augment de la concentració d'Oba, l'efecte d'inhibició de a-SMA no va augmentar significativament (figura 1B).què és cistancheAixí, vam seleccionar una concentració de 20 μM per a l'experiment següent, amb PFD com a control positiu. Oba va inhibir eficaçment els nivells de proteïnes de -SMA, col·lagen -1, vimentina i factor de creixement del teixit connectiu (CTGF) (Figura 1C), en aHSCs [3, 4]. A més, Oba va reduir els nivells d'expressió d'ARNm de -SMA, col·lagen -1 i vimentina (figura 1D). Els resultats de la immunofluorescència van comprovar a més que els senyals de tinció positius de -SMA es van reduir òbviament per Oba (en relació amb el del grup TGF-, ja que el recompte de glòbuls vermells es va reduir després del tractament amb Oba) a Lx -2 (Figura 1E). Aquests resultats suggereixen que Oba exerceix un bon efecte inhibidor sobre l'activació de Lx-2.

2.2. Senyals TGF/Smad inhibits d'Oba, procés EMT i efecte antiinflamatori exercit

Per definir els mecanismes moleculars subjacents als efectes anti-fibrosi anteriors, es van observar els nivells d'expressió de proteïnes del receptor TGF, P-Smad i -SMA, que van ser inhibits significativament per Oba en aHSC (figura 2A). A més, la proteïna es van reduir els nivells d'expressió de N-cadherina i cargol, mentre que es va promoure el nivell d'expressió de proteïnes d'E-cadherina (figura 2B), cosa que indica que també es va bloquejar la via EMT [3]. A més, vam trobar que Oba va induir un nivell reduït d'IL-6 (figura 2C).Cistanche anti-envellimentPer avaluar encara més l'efecte de l'Oba sobre la inflamació, primer vam estimular les cèl·lules HepG-2 (un tipus de línia cel·lular de carcinoma hepatocel·lular humà) amb 20 nmol de CCl4, seguit del tractament amb 20 uM d'Oba. Aquests resultats van mostrar que Oba podria reduir els nivells d'expressió d'ARNm i proteïnes d'IL-6 a l'hepG-2 estimulada per CCl4-(figura 2D). En conjunt, oba va mostrar múltiples efectes anti-fibrosi mitjançant la inhibició dels senyals TGF-/Smad i el procés EMT, així com antiinflamatoris.

2.3. Els efectes anti-fibrosi d'Oba depenien de la capacitat antioxidant millorada mitjançant l'activació de GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}},75 μM, la viabilitat cel·lular de Lx-2 es va reduir significativament; per tant, es va seleccionar 0.75-μM RLS per intervenir en l'expressió de GPx-4. Els resultats de Western blot van mostrar que quan es va afegir RSL3 als aHSC, l'expressió de la proteïna GPx{-4 es va reduir i els marcadors profibròtics, inclosos -SMA i vimentina, es van invertir significativament, cosa que indica la importància de GPx -4 en la mediació dels efectes anti-fibrosi d'Oba (figura 3D). Mentrestant, Oba, òbviament, va reduir el nivell de ROS dels aHSC mitjançant detectors fluorescents de ROS, i aquest efecte va ser aparentment bloquejat per RSL3 (figura). Aquestes dades van indicar que el nivell més baix de fosfolípids ROS mediat per GPx-4 era el principal anti-fibrosi. senyal d'Oba.

2.4. Oba atenua la fibrosi hepàtica del ratolí induïda per CCl4-

La fibrosi hepàtica induïda per CCl4- és un dels models de ratolí més utilitzats per estudiar la fibrosi hepàtica [3]. A nivell histològic, Oba va alleujar significativament la patologia hepàtica, evidenciada per les deposicions de col·lagen millorades indicades amb la tinció de Masson i la tinció anti-SMA. (Figura 4A-D). Aleshores, es van determinar els nivells sèrics d'alanina transaminasa (ALT)/aspartat transaminasa (AST) per provar els nivells de dany del fetge, en comparació amb els ratolins CCL4, el grup Oba de dosis baixes i el grup PFD van disminuir significativament els nivells d'ALT (p).<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba va millorar l'expressió de GPx-4, va disminuir la inflamació, les expressions de proteïnes relacionades amb EMT i va reduir els nivells d'oxidació de lípids en la fibrosi hepàtica induïda per CCl4-

Tal com es mostra a la figura 5A, Oba va inhibir les expressions de proteïnes d'IL-6 i l'aparició d'EMT al fetge fibròtic de ratolins amb nivells reduïts de cargol i N-cadherina però nivells més alts d'E-cadherina. A més, les expressions de proteïnes de Nrf-2 i GPx{-4 òbviament es van augmentar després del tractament amb dosis mitjanes i altes d'Oba (figura 5B).cistanche beneficisEls resultats de la tinció immunohistoquímica (IHC) van demostrar que, en comparació amb el grup model, el nombre de cèl·lules positives GPx-4 (marrons) als grups d'Oba de dosis alta i mitjana es va incrementar significativament (figura 5C, E). A continuació, vam provar els nivells d'estrès oxidatiu en fetges de ratolins i vam trobar que, en comparació amb el control, la intensitat de fluorescència ROS del grup model era aparentment més alta. D'altra banda, el nivell de ROS es va reduir significativament després del tractament amb Oba (figura 5D, F).

3. Discussió

La fibrosi és una malaltia intima al món. Sigui quina sigui l'etiologia, inclosa la infecció per virus, l'hepatitis alcohòlica o no alcohòlica i les respostes autoimmunes, totes acaben amb fibrosi a causa d'una lesió hepàtica crònica [1]. L'activació dels HSC és l'esdeveniment central subjacent a la fibrosi hepàtica. Els HSC s'activen amb produccions aberrants d'una varietat de factors fibrogènics i deposicions d'ECM [2, 3]. S'ha informat que la senyalització canònica d'activació Smad relacionada amb TGF- -, el procés EMT i la inflamació crònica relacionada amb IL-6- estan implicats en els processos anteriors [3,4]. Per avaluar els efectes anti-fibrosi d'Oba sobre la fibrosi hepàtica, en primer lloc ens centrem a definir els seus efectes sobre l'activació de Lx-2 induïda pel TGF- , i després verificant els seus efectes anti-fibrosi in vivo mitjançant l'ús Model de ratolins de fibrosi hepàtica induïda per CCl4-al final.

Oba és un compost limonoide natural [24] i els seus efectes biològics inclouen principalment funcions antiinflamatòries [25], antioxidants [26] i antitumorals [27]. Recentment, s'ha trobat que Oba és un agonista Nrf-2 fort i eficaç i exerceix efectes anti-fibrosi pulmonar en ratolins [28]. No obstant això, encara falta l'evidència dels seus efectes contra la fibrosi hepàtica i dels mecanismes moleculars relacionats. Aquí, les sobreexpressions de -SMA, col·lagen 1 i CTGF van ser inhibides per Oba en models Lx-2 estimulats amb TGF-. La senyalització EMT millorada també és suprimida efectivament per Oba.

S'ha confirmat que l'estrès oxidatiu és un contribuent important a la fibrosi [12]. Les espècies reactives d'oxigen (ROS) és un terme paraigua per a les molècules o ions oxidats amb activitat biològica i les sobreproduccions de diversos ROS als hepatòcits poden provocar la seva mort i provocar fibrosi hepàtica [13]. Per contra, els HSC en repòs s'activen després d'una lesió de les cèl·lules hepàtiques i l'excés de ROS amplifica l'activació de més HSC i acaba amb fibrosi hepàtica [12]. Per tant, amortir l'estrès oxidatiu exagerat es converteix en un tractament eficaç per a la fibrosi.

Nrf-2 és un regulador crític de l'estrès antioxidant, el Nrf-2 fosforilat activat es trasllada al nucli per impulsar la regulació a l'alça de les proteïnes antioxidants aigües avall, GST, HO1[15]. S'informa que molts activadors químics naturals de Nrf2 posseeixen efectes anti-fibrosi, com la tert-butilhidroquinona i la curcumina. Entre totes les proteïnes antioxidants, la glutatió peroxidasa-4(GPx-4) és membre de la família de la glutatió peroxidasa (GPx{1-8) i facilita l'equilibri redox reduint el glutatió [ 30-32]. Està demostrat que les expressions més altes de la glutatió peroxidasa -7 van inhibir la malaltia del fetge gras no alcohòlic disminuint la producció de ROS [33]. GPx-4 va reduir el peròxid de fosfolípids a la membrana lipídica per protegir les cèl·lules de lesions oxidatives J15]. Kazuya Tsubouchi et al. va trobar que l'expressió de GPx-4 es redueix als teixits de fibrosi pulmonar del ratolí induïda per la bleomicina, i que la fibrosi és més greu quan el gen GPx-4 és noquejat. A més, la peroxidació lipídica i la via TGF-/P-Smad es milloren significativament en el fibroblast pulmonar quan el gen GPx-4 s'esgota [17]. Recentment, més evidències van donar suport que les ROS derivades de fosfolípids estan implicades en la mort cel·lular especial, anomenada ferroptosi. L'inhibidor de GPx-4, RSL3, també s'aplica com a inductor de ferroptosi [21, 34].

En els nostres experiments, vam trobar que Oba va exercir la capacitat antioxidant augmentant Nrf-2 i GPx{-4 i regulant a la baixa Nox-2. En particular, l'efecte anti-fibrosi d'Oba es va afeblir significativament quan el gen GPx-4 va ser inhibit per RSL3, l'inhibidor de GPx-4. De manera consistent, també es va il·lustrar el nivell de ROS reduït pel tractament amb Oba. Aquestes observacions in vitro van recolzar molt que les ROS antifosfolípids mediades per GPx-4- eren crítiques per als efectes protectors d'Oba.

Per validar els resultats anteriors del tractament anti-fibrosi d'Oba a les cèl·lules LX2, també es va examinar la fibrosi hepàtica de ratolins induïda per CCl4-. CCl4 és un tipus de verí hepatotròpic, la degradació mediada per l'enzim microsòmic P450 va produir radicals lliures altament reactius per destruir la integritat de la membrana cel·lular, al seu torn, desencadenant una sèrie de disfuncions i lesions hepàtiques, que finalment van evolucionar cap a fibrosi hepàtica [35]. En el nostre experiment, Oba va mostrar bons efectes curatius sobre la fibrosi hepàtica induïda per CCl. Va alleujar el dany hepàtic amb un nivell més baix d'AST, l'àrea dels feixos de fibres de col·lagen es va reduir i les expressions de proteïnes d'a-SMA, CTGF, col·lagen-1, cargol, N-cadherina i IL{{10} }} es van reduir tots. Tot i que la senyalització antioxidant, les expressions de proteïnes de Nrf-2 i GPx{-4 també es van elevar, els nivells més alts de ROS van disminuir. Aquests resultats van confirmar encara més els efectes anti-fibrosi in vitro d'Oba i la senyalització relacionada, especialment la inhibició de l'EMT i els efectes antioxidants per Nrf-2 i GPx{-4.

En resum, vam concloure que Oba va alleujar l'activació d'HSC induïda per TGF- -i la fibrosi hepàtica induïda per CCl4-a través de diversos mecanismes. En primer lloc, Oba va inhibir la producció clàssica de TGF-/Smad, EMT i IL-6. En segon lloc, va mostrar una excel·lent capacitat antioxidant millorant les expressions de Nrf-2 i GPx{-4. Les ROS antifosfolípids mediades per GPx-4estaven contribuint principalment als seus efectes anti-fibrosi. Per tant, Oba pot servir com a regent químic candidat per a la prevenció i el tractament de la fibrosi.

Oba va mostrar algun efecte curatiu sobre la fibrosi hepàtica induïda per CCl4-en ratolins C57. Oba podria regular a la baixa l'expressió de biomarcadors de proteïnes de fibrosi, com ara: -SMA, CTGF, etc. Mentrestant, Oba va reduir l'expressió de proteïnes de I-6, E-cadherina, etc. Va ser interessant que Mid-Oba mostra signes de millors resultats respecte a Oba baix i Oba alt en termes d'expressió relativa d'aquestes proteïnes, tot i que no és estadísticament significatiu. Tanmateix, va indicar que la dosi òptima podria ser un factor crític en aquest procés, i explorarem aquest fenomen en el proper experiment. A més, vam trobar que la ROS i el grau de fibrosi hepàtica redueixen amb expressions de regulació positiva de Nrf-2 i GPx-4. Per tant, creiem que Oba podria alleujar la fibrosi hepàtica regulant el Nrf-2 i GPx-4. Tanmateix, el PFD podria tenir una millor acció terapèutica que l'Oba tant in vivo com in vitro. No obstant això, Oba va ser millor que PFD en l'efecte antioxidant, és propici per augmentar la possibilitat de trobar un nou fàrmac per a l'efecte anti-fibrogènic del fetge des del costat antioxidant i fer una petita contribució a la salut humana.

4. Materials i Mètodes

4.1. Productes químics i reactius

Oba (núm. B20553, puresa superior o igual al 98 per cent) i RSL3 (núm. S81241, puresa superior o igual al 98 per cent) es van comprar a YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Xangai, Xina) i es van dissoldre. en sulfòxid de dimetil (DMSO) (núm. R21950; YUANYE) a una concentració de 72,64 mg/mL i 6 mmol, respectivament. Després de l'esterilització del filtre, la solució resultant es va conservar a -20 graus C. La solució es va afegir al medi de cultiu per aconseguir una concentració final de DMSO de<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Cultius cel·lulars i disseny experimental

La línia cel·lular estelada hepàtica humana Lx-2 i la línia cel·lular de càncer de fetge humà Hepg-2 (totes procedents del Departament de Farmàcia, The Fourth Military Medical University, Xina) es van cultivar al medi d'àguila modificat de Dulbecco ( DMEM) complementat amb un 10 per cent de sèrum fetal boví i un 1 per cent de penicil·lina (Thermo Fisher Scientific) i estreptomicina (Thermo Fisher Scientific), i després es va mantenir a 37 °C en una atmosfera humidificada d'un 5 per cent de CO2 i un 95 per cent d'aire. Per avaluar l'efecte d'Oba sobre la viabilitat de les cèl·lules Lx-2, Lx-2 es va planejar amb 1 × 10* cèl·lules/pou en una placa de 96-pou i es va incubar durant 24 h abans de l'addició. d'Oba. A continuació, es van tractar Lx-2 amb diferents concentracions d'Oba (10,20, 40,80 i 160 wM i es van cultivar durant 24,48 o 72 h. La viabilitat cel·lular va ser provada pel CCK8. Per avaluar la efecte d'Oba sobre l'activació de Lx-2, Lx-2 es va pre-cultivar amb un medi sense sèrum durant 12 h, seguit d'estimulació amb TGF- (10ng/mL, 24 h) i tractament amb Oba o PFD. Per avaluar l'efecte de l'Oba sobre la inflamació, l'hepg-2 va ser estimulada per CCl4 (20 nm, 8 h) i es va tractar amb 20 μM d'Oba. Al final del cultiu, les cèl·lules es van recollir i es van sotmetre a Western blotting i anàlisi de qPCR en temps real.

4.3. Animals i disseny experimental

Els ratolins C57 mascles amb un pes de 20± 0,5 g (El Centre d'Animals de Laboratori de la Quarta Universitat Mèdica Militar) es van allotjar en condicions adequades de temperatura de 25 graus ± 2 graus i un cicle de llum/foscor de 12- h amb accés gratuït a aigua i menjar. Tots els experiments d'aquest estudi es van realitzar d'acord amb els protocols aprovats pel Quart Comitè de Cura dels Animals de la Universitat Mèdica Militar. Els ratolins c57 es van distribuir aleatòriament en 6 grups (n=6 a cada grup) de la següent manera: i) grup de control simulat, i) grup model, ii) grup d'Oba alt (CCl4 més 6 mg/kg Oba), io )grup d'Oba mitjà (CCl4 més 3 mg/kg d'Oba）, ø）grup d'Oba baix （CCl4 més 1,5 mg/kg d'Oba） i vi） grup PFD (CCl4＋ PFD). El grup model es va tractar amb CCl4 (30 per cent CCl4/oli d'oliva, 5 ml/kg d'injecció intraperitoneal) tres vegades per setmana durant un període de 6-setmana per induir fibrosi hepàtica. Els altres grups van ser alimentats amb diferents dosis d'Oba o PFD i volums iguals d'infecció intraperitoneal per CCil4 per un període de 6-setmana. Es va administrar un volum igual d'oli d'oliva en lloc de CCl4 a C57 mitjançant un control simulat ipas. Tots els experiments d'aquest article es van realitzar d'acord amb els protocols aprovats pel Quart Comitè d'Animals de la Universitat Mèdica Militar. Cura.

4.4.Western Blotting

Els fetges C57 o les cèl·lules cultivades es van homogeneïtzar o lisar en tampó RIPA mitjançant l'aparell de lligadura de teixits o el raspat cel·lular (Service, KZ-2). La concentració de proteïnes es va mesurar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes BCA. El lisat es va centrifugar (4 graus, 12, 000 rpm, 5 min) i es va recollir el sobrenedant. Els passos operatius es van seguir tal com es va informar anteriorment [14]. Les mostres es van escanejar amb un sistema d'anàlisi i imatges quimioluminiscents (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Anàlisi qPCR en temps real

Els fetges C57 o les cèl·lules cultivades es van homogeneïtzar o lisar en el reactiu Trizol amb l'ajuda de l'aparell de lligadura de teixits per extreure l'ARN total. L'ARN total es va transcriure inversament a l'ADNc mitjançant el kit de síntesi d'ADNc RevertAid First Strand. -L'actina es va utilitzar com a referència interna. La RT-qPCR es va realitzar al sistema qPCR en temps real 7500 (Applied Biosystems) amb els reactius SYBR Premix Ex Taq. Els cebadors dels gens humans utilitzats es van enumerar a la taula 1.

Aquest article està extret de Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules