Les nanofibres d'àcid oleanòlic atenuen l'estrès oxidatiu induït per partícules en els queratinòcits

Contacteu amb oscar.xiao@wecistanche.com per obtenir més informació

Resum:Les partícules atmosfèriques (PM) són minerals dels indicadors de contaminació de l'aire i també són el principal factor que causa estrès oxidatiu a la pell. L'àcid oleanòlic (OA), un compost terpenoide natural, va inhibir eficaçment l'envelliment de la pell induït per PM; tanmateix, l'OA té poca solubilitat en aigua i absorció de la pell, que limiten la seva aplicació en medicaments i cosmètics. L'objectiu d'aquest estudi era preparar nanofibres d'àcid oleanòlic (OAnf) i avaluar els efectes de l'OA i OAnf en queratinòcits tractats amb PM. Els resultats van demostrar que (OA dissolt en dimetil sulfòxid (DMSO) atenuava la sobreproducció d'espècies reactives d'oxiger induïda per PM, l'activació de la proteïna cinasa activada per l'estrès/Jun-amino-cinasa terminal (SAPK/JNK) i les expressions de la inflamació i la pell. -proteïnes relacionades amb l'envelliment. A més, el procés de nanofibres de l'OA va millorar eficaçment la solubilitat en aigua de l'OA més de 99,000-modificant les seves propietats fisicoquímiques, com ara un augment de la superfície, reducció de la mida de partícules, transformació amorfa i formació d'enllaços d'hidrogen amb excipients. La capacitat de penetració de la pell de l'OAnf era constantment més de 10- vegades superior a la de l'OA. A més, quan es va dissoldre en PBS, l'OAnf mostrava activitats antioxidants, antiinflamatòries i anti-envelliment de la pell superiors en PM. queratinòcits tractats que l'OA. En conclusió, els nostres resultats suggereixen que l'OAnf podria ser una formulació antioxidant tòpica per atenuar els problemes de la pell causats per PM.

Paraules clau:matèries particulades; àcid oleanòlic; nalnofibra; antioxidant; antiinflamatori; anti edat

1. Introducció

La contaminació de l'aire és ara un problema de salut pública a tot el món. Amb el desenvolupament de la tecnologia, diverses substàncies nocives, com ara gasos, substàncies químiques, contaminants biològics i partícules, s'acumulen a l'atmosfera i afecten greument la vida i la salut de les persones. La matèria particulada (PM), un indicador dels contaminants atmosfèrics, és una combinació de diversos compostos orgànics, materials derivats biològicament i nuclis de carboni en partícules[1]. El PM entra als pulmons per inhalació i entra a la circulació sanguínia causant perills per a la salut sistèmica com la inflamació d'òrgans i malalties cardiovasculars i respiratòries [2,3]. A més, el PM pot travessar la barrera cutània i acumular-se als fol·licles pilosos i fins i tot penetrar a la dermis amb contactes repetits; per tant, la sobreexposició de la pell a PM s'ha associat amb l'envelliment extrínsec de la pell, canvis en la pigmentació, dermatitis atòpica, acne i psoriasi [2,4]. El contacte prolongat amb PM indueix la sobreproducció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) als queratinòcits, que desencadena diverses vies de senyalització, com ara la via de l'apoptosi, les vies de la proteïna cinasa activada per mitògens (MAPK) i la inflamació. L'expressió elevada de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), el factor de necrosi tumoral (TNF-a) i la interleucina-1 (IL{-1) s'observa habitualment als queratinòcits exposats a PM. A més, el PM també activa les metaloproteinases de la matriu (MMP) i provoca la pèrdua d'elasticitat de la pell i l'envelliment [5].

Feu clic aquí per saber-ne més

Els productes naturals s'han utilitzat durant molt de temps com a ingredients cosmecèutics eficaços. L'àcid oleano-lic (OA, 3 -hydroxyolean-12-en-28-oicacid), un compost triterpenoide de cinc anells, està àmpliament present en plantes, fruites i verdures [6]. L'OA és ben coneguda pels seus efectes protectors hepàtics, com ara reduir el dany hepàtic agut induït per productes químics i la fibrosi/cirrosi en malalties hepàtiques cròniques [6,7]. A més, estudis anteriors han revelat que l'OA té efectes antioxidants, anticancerígens, antiinflamatoris, antidiabètics i antimicrobians [8]Kim et al. va revelar que l'OA podria disminuir l'expressió de la citocina proinflamatòria (TNF-a, IL-6) i la proteïna de l'envelliment de la pell (MP{-1) als queratinòcits tractats amb PM [9]. Tanmateix, les propietats fisicoquímiques de l'OA dificulten la seva dissolució en aigua, la qual cosa limita la seva aplicació en medicaments, aliments i cosmètics.

Els dissenys de formulació de lliurament de fàrmacs com nanoportadors basats en polímers, li. posomes i nanofibres s'utilitzen normalment per millorar les propietats fisicoquímiques dels ingredients actius. L'encapsulació d'ingredients actius amb excipients en aquestes formulacions farmacèutiques podria millorar la seva solubilitat en aigua i l'absorció de la pell i reduir la toxicitat potencial i la irritació de la pell. Entre elles, les nanofibres són una formulació emergent de mida nanomètrica, amb una gran superfície, baixa densitat i un volum de porus elevat, i ja s'utilitzen àmpliament en biomedicina, que pot reduir el volum de fàrmacs orals, augmentar l'estabilitat dels ingredients actius, controlar alliberar, millorar la biodisponibilitat i fer teixits artificials [10]. L'electrospinning és una tecnologia comuna utilitzada per produir nanofibres i és altament compatible amb la producció en massa [1]. Per tant, la preparació de nanofibra mitjançant el procés d'electrospinning pot millorar simultàniament la biodisponibilitat. i l'eficiència de producció d'un ingredient actiu amb poca solubilitat en aigua. La polivinilpirrolidona (PVPK90) i la 2-hidroxipropil- -ciclodextrina (HPBCD) són compostos aprovats per la FDA per solubilitzar i lliurar ingredients farmacèutics actius hidrofòbics en humans.colesterol de cistancheEstudis anteriors van demostrar que les nanofibres preparades amb HPBCD i PVPK90 van millorar significativament la solubilitat en aigua i la penetració a la pell del resveratrol [12] i l'oli de plai [13]. Així, l'objectiu d'aquest estudi era utilitzar PVPK90 i HPBCD com a transportadors de lliurament per preparar les nanofibres d'àcid oleanòlic (OAnf) i avaluar els efectes de l'OA i l'OAnf en queratinòcits tractats amb PM.

Cistanche pot anti-envelliment

L'objectiu del present estudi era avaluar l'efecte biològic de l'OA dissolt en DMSO en el dany dels queratinòcits induïts per PM. Per superar la mala solubilitat en aigua de l'OA, vam utilitzar PVPK90 i HPBCD com a transportadors de lliurament per preparar nanofibres d'àcid oleanòlic (OAnf) mitjançant un procés d'electrofilat i després vam determinar els canvis de propietats fisicoquímiques entre OA cru i OAnf per dilucidar la millora de la solubilitat en aigua i penetració de la pell. Per comparar l'efecte biològic després del procés de nanofibres de l'OA, es va utilitzar un model de dany dels queratinòcits induït per PM per avaluar l'activitat antioxidant, antiinflamatòria i anti-envelliment d'OAnf i OA.

2. Materials i Mètodes

2.1.Materials

L'hidrat d'àcid oleanòlic (OA) es va comprar a Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tòquio, Japó). La polivinil pirrolidona (Luviskol" K90 Powder, PVP) es va comprar a Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Taiwan). La hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPBCD) es va obtenir de Zibo Qianhui (Zibo, Xina). Metanol i dimetil El sulfòxid (DMSO) es va comprar a Aencore Chemical (Surrey Hills, Austràlia) Tots els productes químics o reactius per a cultius cel·lulars eren de grau biològic i altres productes químics de determinació fisicoquímica eren de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC).

2.2.Assaig de viabilitat cel·lular

La determinació de la viabilitat cel·lular d'un ingredient actiu és un mètode comú que s'utilitza per triar els intervals de concentració adequats dels ingredients actius per avaluar la seva activitat biològica. Els queratinòcits HaCaT es van comprar a l'Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Itàlia). Les cèl·lules HaCaT es van cultivar a DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, Índia) que contenia un 10 per cent de sèrum boví fetal (Hazelton Product, Denver, PA, EUA) amb un 1% de penicil·lina-estreptomicina (Biological Indus-tries, Connecticut, NE). , EUA), i les cèl·lules HaCaT es van incubar en una incubadora (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) amb les condicions establertes a 37 graus amb un 5% de COz. Per a la preparació de les mostres de prova, OA i OAnf es van dissoldre en DMSO i PBS, respectivament, i després cada mostra es va diluir en DMEM sense sèrum boví fetal per a la determinació de la viabilitat cel·lular. Les cèl·lules HaCaT es van sembrar en plaques de 96-pous a una densitat d'1 × 104 cèl·lules/100 μL/pou durant 24 h. A continuació, es va eliminar el medi de cultiu i les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions d'OA i OAnf que van des de 5 a 80 uM en DMEM sense sèrum durant 24 h. En el moment de l'assaig, es va eliminar el medi de tractament i es van afegir 150 μL de solució MTT de 0, 5 mg/mL a cada pou. Després de 3 h d'incubació, es va eliminar la solució MTT i es van dissoldre els cristalls de formazan morats de cada pou en 100 uL de DMSO. A continuació, es va mesurar l'absorbància a 550 nm de cada pou mitjançant un espectrofotòmetre de microplaques (BioTek uQuant, Winoski, VT, EUA). La viabilitat cel·lular es va calcular mitjançant la fórmula següent:

2.3.Determinació del contingut d'espècies reactives d'oxigen (ROS).

PM (Standard Reference Material, SRMB1649b) es van comprar a l'Institut Nacional d'Estàndards i Tecnologia. Aquest producte es va recollir el 1976 i el 197 a Washington, DC Made. Es van suspendre un total de 10 mg/mL de PM en PBS i després es van sonicar durant 10 min abans de l'ús. Es van cultivar un total d'1 × 10 més queratinòcits HaCaT en plaques de 96-pous durant 24 h en condicions de 37 graus i un 5% de CO2. Les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions d'OA en DMSO, OA en PBS i OAnf en PBS durant 24 hores, respectivament. A continuació, es van incubar amb una solució de diacetat de diclorodihidrofluoresceïna 20 uM (DCFH-DA; Sigma, Tòquio, Japó) durant 30 min. A continuació, es van afegir 50 ug/cm² PM a cada pou i es van incubar durant 1 h. Després d'això, es van rentar les cèl·lules. dues vegades amb PBS, i la intensitat de fluorescència de cada mostra es va analitzar mitjançant el lector de plaques fluorescents (excitació: 485 nm; emissió: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, EUA) Es va utilitzar l'equació següent per calcular el percentatge d'inhibició de Producció de ROS:

2.4. Anàlisi Western Blot

Es van cultivar un total de 4 × 105 queratinòcits HaCaT en plaques de 6-pous durant 24 h. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb OA o OAnf en un medi sense sèrum durant 24 hores seguit de l'addició de PM. Després de diversos punts de temps, les cèl·lules es van lisar amb tampó RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington, MA, EUA), després es van centrifugar a 12, 000 rpm durant 10 min. Es va utilitzar un kit d'assaig de proteïnes BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) per determinar la concentració de proteïnes. Aleshores, les proteïnes es van separar mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de poliacrilamida (SDS-PAGE) i després es van passar sobre membranes de difluorur de polivinilidè (PVDF) (Merck Millipore). Les membranes es van bloquejar durant 1 h i es van rentar amb solució salina tamponada amb Tris ( TBS) amb un 1% de Tween-20. Les membranes es van incubar amb anticossos primaris a 4 graus durant la nit. Els anticossos primaris utilitzats en aquest estudi van incloure la ciclooxigenasa-2 (COX-2), la metaloproteinasa de la matriu-9 (MMP{-9), un inhibidor tissular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1), proteïna quinasa activada per l'estrès/cinasa amino-terminal de Juny (SAPK/JNK) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), GAPDH (Santa Cruz Bi-otechnology, Dallas, TX, EUA), metaloproteinasa de matriu-1 (MMP{-1) (Grup Proteintech, Rosemont, IL, EUA), p380, proteïnes quinases regulades extracel·lulars (ERK) i factor nuclear kappa-cadena lleugera- potenciador de cèl·lules B activades (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, EUA). A continuació, es van afegir anticossos secundaris durant 1 h a temperatura ambient i van reaccionar amb reactius de quimio-minescència millorats (ECL; Thermo Fisher Scientific). Els anticossos contra GAPDH es van utilitzar com a controls interns. L'expressió de cada proteïna es va analitzar mitjançant un Touch Imager (e-BLOT; Xangai, Xina) i l'expressió es va quantificar mitjançant ImageJ.

2.5.Preparació de nanofibres d'àcid oleanòlic (OAnf)

Els OAnfs es van electrofilar amb diferents proporcions d'OA:PVP:HBPCD (1:8:5,1:8:10 i 1:8:20). La solució electrospun es va preparar de la següent manera: es van dissoldre 25 mg d'OA en 5 ml de metanol i es va afegir HPBCD i es va agitar amb un agitador imant per obtenir una solució clara; després, es va afegir immediatament PVPK90 i la mescla es va agitar durant 1 h.efectes secundaris de cistanche deserticolaLes nanofibres es van teixir amb equips de filatura elèctrica FES-COS (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Taiwan) en les condicions següents: una xeringa d'10 ml amb una agulla de diàmetre intern de 0. Es van utilitzar 22 mm per a l'electrofilatura; el cabal es va ajustar a 0,2 ml/h; la tensió aplicada es va establir en 12 KV; la distància punta-col·lector era de 10 cm. Després del procés d'electrofilat, les nanofibres es van recollir amb paper d'alumini. Les nanofibres recentment sintetitzades es van col·locar en una bossa de plàstic segellada i es van emmagatzemar en un recipient a prova d'humitat.

2.6. Anàlisi de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) de l'àcid oleanòlic

El sistema d'anàlisi HPLC (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tòquio, Japó) constava d'una bomba L-2130, un mostreig automàtic L{-2200 i un L{{3 }} detector ultraviolat-visible (UV-vis). La columna d'anàlisi era una columna Mightysil RP-18 GP (250×4,6 mm id., 5 um). La fase mòbil estava composta per metanol i una solució d'àcid acètic glacial al 0,1 per cent en una proporció fixa (95:5; p/v). El cabal de la fase mòbil era d'1 ml/min i la longitud d'ona de detecció del detector UV es va establir en 215 nm. El pic d'absorció de l'àcid oleanòlic va aparèixer als 7,5 min. La corba de calibratge de l'àcid oleanòlic va mostrar una bona lineal （r =0.999） dins del rang 0.01-100 ug/mL.

2.7.Morfologia, diàmetre de la fibra i mesura de la mida de les partícules d'OAnf

Es van xapar diferents mostres de nanofibres amb platí amb un recobridor d'ions (E{{0}}, HITACH, Tòquio, Japó); la condició es va establir a 10 mA 120 s després. La morfologia i la forma de cada mostra es van observar amb un microscopi electrònic d'escaneig (Hitachi S4700 Hitachi, Tòquio, Japó). El diàmetre de cada mostra es va calcular mitjançant el programari image j. Es va utilitzar un analitzador Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, Regne Unit) per mesurar la mida de partícula d'OAnf. La mida de les partícules d'OA i OAnf es va mesurar a una concentració d'1 mg/mL i 0,1 mg/mL, respectivament.dosificació de cistanche redditA més, també vam observar la uniformitat de la morfologia de l'OAnf després de dissoldre's en aigua mitjançant un microscopi electrònic de transmissió (TEM, JEM{{0}}instrument EXII, JEOL Co., Tòquio, Japó). La mostra de prova es va ajustar a 1 ug/mL d'OA en aigua desionitzada i després es va degotejar a la malla de coure, i després es va degotejar immediatament un àcid fosfotúngstic al 0,5 per cent (p/v). Després de l'assecat, cada mostra es va col·locar al TEM per a l'observació.

2.8.Eficiència de càrrega i encapsulació de fàrmacs d'OAnf

És molt important determinar l'eficiència de càrrega i encapsulació de fàrmacs del sistema de lliurament per avaluar el rendiment del procés farmacèutic. La càrrega de fàrmac es va calcular com el percentatge del contingut determinat i el contingut teòric de l'OA contingut a les nanofibres d'OA. Per a la determinació de la càrrega de fàrmacs es van afegir 100 μL de cada mostra a 900 μL de metanol, i la concentració d'OA era on CoA és la concentració d'OA de OAnf, WoA és la quantitat teòrica d'OA afegit, VoAnf és el volum de solució OAnf.

L'eficiència d'encapsulació indica si les nanofibres van encapsular amb èxit els compostos actius. Les mostres d'OAnf es van dissoldre en aigua desionitzada i es van afegir als dispositius de filtre centrífug (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, EUA) i després es van centrifugar a 12,00 rpm durant 10 minuts. la centrífuga refrigerada (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburg, Alemanya). La part encapsulada es va retenir al tub superior i la part no encapsulada es va recollir del tub inferior a causa de la diferència de pes molecular. La quantitat d'OA no encapsulada es va detectar mitjançant el mètode HPLC esmentat. Es va utilitzar l'equació següent per calcular l'eficiència d'encapsulació:

on AoA és la quantitat teòrica d'OA (obtinguda a partir de la condició d'alimentació) incorporada a les nanofibres, i Aunentrapped OA és la quantitat d'OA no encapsulada.

2.9.Solubilitat aquosa de OAnf

Es van dissoldre OA crua (1 mg) i diferents formulacions de proporció d'OAnf (que contenien un equivalent d'1 mg d'àcid oleanòlic) en 1 ml d'aigua desionitzada, respectivament, i després es van sonicar sota un ultrasònic (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, EUA) durant 20 min. Cada mostra es va filtrar a través d'una membrana de 0,45 um (Pall Corporation, Washington, NY, EUA) i es va diluir 10- vegades. Les solucions diluïdes es van analitzar per HPLC i es va utilitzar la corba estàndard per determinar la quantitat d'àcid oleanòlic per comparar la seva solubilitat aquosa.

2.10. Determinació de la transformació cristal·lina a amorfa

La difractometria de raigs X (Siemens D500, Karlsruhe, Alemanya) es va utilitzar per analitzar la forma cristal·lina de l'OA, els excipients i l'OAnf. L'anàlisi es va realitzar mitjançant radiació Cu-Ka filtrada amb níquel, utilitzant una tensió de 40 kV i un corrent de 25 mA. La velocitat d'escaneig era d'1 grau / min, i el rang dels angles escanejats era de 5 graus a 50 graus. 2.11.Interacció intermolecular entre OA i excipients

L'espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR) i la ressonància magnètica nuclear 1H (RMN 1H) s'utilitzen normalment per confirmar la interacció intermolecular entre els ingredients actius i els excipients. L'àcid oleanòlic, PVP, HPBCD i diferents formulacions de proporció d'OAnf es van barrejar, respectivament, amb bromur de potassi (KBr) en una proporció de volum d'1:9 amb un morter i es van premsar en pastilles. Després, cada mostra es va analitzar amb l'espectrofotòmetre FTIR (espectrofotòmetre Perkin-Elmer 200, Perkin-Elmer, Norwalk, CT EUA). El rang d'exploració era de 400-4000 cm-4. A més , cada mostra es va dissoldre en 0,8 ml de DMSO-dg al 99,8 per cent (Merck, St.Louis, MO, EUA) i es va analitzar per l'espectròmetre JEOL Alpha 400 (Nihon Denshi Co., Tòquio, Japó).

2.12. Penetració cutània ex vivo de l'àcid oleanòlic i la seva nanofibra

Aquest experiment es va realitzar d'acord amb el protocol estàndard de les directrius de l'Associació Europea de Perfumeria i Tocador Cosmètics (COLIPA). El sistema de cèl·lules de difusió Franz es pot dividir en recipients de vidre de la cambra superior del donant i la cambra inferior del receptor. Es va col·locar un total de 1,5 ml de solució tampó que comprenia 0.14MNaCl, 2mMK-HPO4, 0.4 mM KH2PO4 (pH7.4) a la cambra del receptor i es va agitar amb una barra magnètica a 600 rpm durant tot el temps. l'experiment. La pell fresca del flanc d'un porc es va obtenir d'una carnisseria local del mercat i es va refrigerar durant el període de l'experiment. Cada mostra de pell es va tallar en trossos de 2 cm × 2 cm i es va col·locar entre les dues cambres, amb l'estrat corni cap amunt. La cèl·lula de difusió de Franz es va mantenir a 32 graus amb un bany d'aigua circulant.Beneficis de l'extracte de cistancheA continuació, es van afegir 200 μL d'1 mg/mL d'OA o OAnf a la cambra del donant durant 1, 2 o 4 h. Després d'això, es va treure la pell del porc de la cèl·lula de difusió de Franz i es va obtenir l'estrat còrni mitjançant una cinta adhesiva 15 vegades. Cada mostra de pell residual es va escalfar a 95 graus amb un coixinet tèrmic i es van separar l'epidermis i la dermis amb un bisturí. Cada mostra es va submergir en metanol i es va sonicar durant 1 h per extreure OA, i el contingut d'àcid oleanòlic de cada mostra es va determinar pel mètode HPLC. 2.13. Anàlisi estadística

Totes les dades es van mostrar com a mitjana ± desviació estàndard (DE). La significació estadística entre diferents grups es va analitzar mitjançant l'anàlisi de la variància (ANOVA) amb la prova post hoc de Tukey.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. L'àcid oleanòlic pot suprimir la inflamació, l'envelliment i les vies de senyalització de ROS/MAPK en danys de queratinòcits induïts per PM

Per trobar el rang de concentració adequat per a l'avaluació de l'activitat biològica, es va determinar la citotoxicitat de l'OA dissolt en DMSO en cèl·lules humanes de queratinòcits HaCaT mitjançant un assaig MTT. Tal com es mostra a la figura 1A, 40 i 80 μM d'OA es van associar amb una viabilitat cel·lular del 32 al 16 per cent. L'OA a menys de 20 μM encara tenia una taxa de supervivència cel·lular superior al 85 per cent. Aquests resultats van indicar que l'OA a una concentració de 5-20 μM no té efectes citotòxics sobre els queratinòcits HaCaT humans (figura 1A). En conseqüència, es va estudiar l'OA a una concentració de 5-20 uM per investigar la seva activitat antioxidant i anticontaminació en el dany dels queratinòcits induïts per PM. Recentment, molts estudis han demostrat que el PM és un contaminant de l'aire comú que causa una sobreproducció de ROS i danys posteriors al sistema de la pell a través d'una sèrie d'estrès oxidatiu, inclosa la peroxidació lipídica, la carbonilació de proteïnes i la mutació de l'ADN [14-16]Com es mostra a Figura 1B, el tractament amb PM va augmentar significativament la producció de ROS en comparació amb el grup no tractat (p<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Les nanofibres d'àcid oleanòlic van augmentar la solubilitat en aigua i la penetració de la pell de l'àcid oleanòlic cru millorant les propietats fisicoquímiques

3.2.1.Morfologia superficial de l'àcid oleanòlic i les seves nanofibres

Sota l'observació SEM, l'aparició de HPBCD presentava un excipient esfèric i porós, i la seva mida era d'uns 20 a 50 μm (figura 2A). PVPK90 és un excipient amb partícules poligonals irregulars i una mida de partícula de més de 60 um (figura 2B) .L'àcid oleanòlic cru és una pols granular irregularment rodona amb una mida de 3-60 um. La figura 2D-F mostra el diàmetre mitjà de fibra de diferents proporcions de pes d'àcid oleanòlic: HPBCD: PVPK90 eren 174,83 ± 19,53 nm, 219,23 ± 18,93 nm i 403,17 ± 32,99 nm, respectivament. Es va trobar que una proporció més alta de HPBCD (18 :20) va fer que OAnf tingués un diàmetre de fibra més gran (taula 1).

3.2.2.Grandària de partícules i morfologia de l'OAnf reconstituït a l'aigua

Per tal d'observar la forma i la mida de la partícula de l'OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) dissolt en aigua, la imatge d'OAnf sota el microscopi electrònic de transmissió (TEM) va mostrar que les partícules d'àcid oleanòlic eren esfèriques i uniformement disperses a l'aigua (figura 3). La mida de partícules també es va confirmar mitjançant un analitzador de mida de partícules làser (taula 2). Les mides de partícules d'OA i OAnf eren de 5079,5{0±384,87 nm i 302,37±11,91 nm, respectivament. Els índexs de polidispersitat (PDI) d'OA i OAnf eren d'1,63±0,21 i 0,32±0,02, respectivament. Aquests resultats indiquen que el procés d'electrospinning va reduir eficaçment la mida de les partícules d'OA amb una distribució uniforme de partícules i va donar lloc a una millora de la superfície.

3.2.3. Càrrega de fàrmacs, eficiència d'encapsulació i solubilitat en aigua de nanofibres d'àcid oleanòlic

Tal com es mostra a la taula 3, els percentatges de càrrega d'OA en diferents proporcions d'excipients eren del 72,36 ± 10,45 per cent, 84,23 ± 3,62 per cent i 98,19 ± 4,82 per cent, respectivament. Els resultats van indicar que una proporció més alta de HPBCD mostrava un millor efecte de càrrega de fàrmacs. L'eficiència d'encapsulació de totes les formulacions va ser superior al 95 per cent, la qual cosa va indicar que PVPK90 i HPBCD van encapsular eficaçment l'OA. A més, la solubilitat en aigua d'OAnf amb diferents proporcions d'excipients va ser de 296,14±57,75 ug/mL, 395,87±32,77 ug/mL. , i 998,7±58,32 ug/ml, respectivament.cistanche genghis khanAquests resultats van mostrar que l'augment de HPBCD en la formulació va millorar dràsticament la solubilitat en aigua de l'OA en brut. Per contra, la solubilitat en aigua de l'OA en brut no es va poder determinar perquè es trobava per sota del límit de detecció (0,01 ug/mL) en el mètode HPLC. Aquest resultat va indicar que l'OAnf 1:8:20 va tenir una millora de la solubilitat en aigua més d'un 1000-fold en comparació amb l'OA cru. Així, en els estudis següents, 18:20 OAnf es va utilitzar per determinar l'activitat biològica en el model de dany dels queratinòcits induïts per PM.

3.2.4.Canvi cristal·lí de l'àcid oleanòlic i les seves nanofibres

Els patrons de difracció de raigs X (XRD) de l'OA en brut, els excipients i les seves nanofibres es mostren a la figura 4. L'OA en brut va mostrar múltiples pics de difracció característiques d'alta intensitat a un angle d'exploració de 5 graus -20 graus, cosa que indica que L'OA en brut era un compost cristal·lí. D'altra banda, els patrons de difracció de PVPK90 i HPBCD no tenen pics de difracció característics evidents. A més, per a l'OA en brut sota processament d'electrospinning, tots els pics de difracció característics de l'OA en brut van desaparèixer completament, cosa que indicava que la naturalesa de l'OA bruta. L'OA es va transformar de cristal·lí a amorf (figura 4). Segons aquests resultats, podríem concloure que l'àcid oleanòlic cru es va encapsular amb èxit a HPBCD i encapsulat per PVPK90 després del procés de nanofibres.

3.2.5.Formació d'enllaç d'hidrogen intermolecular entre l'àcid oleanòlic i els excipients

La interacció intermolecular d'OA en brut i HPBCD amb PVPK90 es va determinar mitjançant espectroscòpia FTIR, i els resultats es mostren a la figura 5. L'espectre FTIR mostrava clarament l'absorbància de diversos grups funcionals químics d'OA cru, inclosa una banda d'absorció a 3463 cm{{ 3}} (——vibració d'estirament OH), 1696 cm-1 (——vibració d'estirament C{=O) i 1462 cm-l (—vibració d'estirament CHz) (figura 5). Quan OA, PVPK90 i HPBCD es van complexar per formar nanofibres, l'absorció d'aquests grups funcionals químics, òbviament, es va traslladar a una absorció més baixa. Aquestes troballes van ser indicatives de les interaccions d'enllaç d'hidrogen intermolecular entre OA i HPBCD amb PVPK90. A més, el present estudi també va utilitzar 'H RMN per confirmar la interacció intermolecular de l'OA i els excipients. L'espectre 1HNMR d'OA en brut (figura 6C) va mostrar un senyal de carboxil a 812 ppm (H28), protons doblement enllaçats a 85,15 ppm (H12), senyal de protons hidroxi a 83,38 ppm (H3) i protons metil (81 ppm). , l'espectre HNMR de les nanofibres d'OA va mostrar que el senyal carboxil de l'OA va desaparèixer i els canvis químics dels protons de doble enllaç, hidroxi i metil es van traslladar, òbviament, cap amunt (figura 6). Aquests resultats van demostrar la formació d'enllaços d'hidrogen intermoleculars entre l'OA i els excipients, que van donar suport a l'encapsulació reeixida de l'OA per HPBCD i PVPK90.

3.2.6.Penetració cutània in vitro de l'àcid oleanòlic cru i les seves nanofibres

L'activitat biològica d'una formulació tòpica depèn principalment de l'absorció de la pell. Les penetracions de la pell de l'OA cru i les seves nanofibres es van determinar en pell de porc ex vivo. Com es mostra a la figura 7, un contingut més baix d'OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3.Les nanofibres d'àcid oleanòlic a concentracions no citotòxiques tenien una millor activitat anticontaminant millorant l'activitat antioxidant, antiinflamatòria i antienvelliment

De manera similar a l'OA dissolt en DMSO, l'OAnf dissolt en PBS a 40 uM i 80 uM va reduir la viabilitat de les cèl·lules HaCaT a un 14, 1 per cent i un 5, 6 per cent, respectivament (figura 8A). Per tant, es van avaluar 10 uM d'OAnf per a una activitat antioxidant i anticontaminació addicional per entendre si l'OA i les seves nanofibres tenen la capacitat d'inhibir la producció excessiva de ROS causada per PM. La figura 8B mostra que OAnf a 10 uM va reduir notablement la sobreproducció de ROS induïda per PM. També es va calcular la taxa d'inhibició de la producció de ROS per comparar l'activitat antioxidant entre l'OA dissolt amb PBS i l'OAnf. Deu micromolars d'OA en PBS van donar lloc a una inhibició del 28,3 per cent de la producció de ROS, i OAnf va aconseguir una inhibició del 97,6 per cent (figura 8B). Aquests resultats van indicar que l'OAnf tenia una millor activitat antioxidant que l'OA en PBS en l'estrès oxidatiu induït per PM als queratinòcits. A més, també vam comparar l'activitat antiinflamatòria del dany dels queratinòcits induïts per PM. El pretractament amb OA cru en PBS no va poder inhibir l'expressió de proteïnes induïda per PM de NF-KB i COX-2 En canvi, el pretractament amb OAnf en PBS va disminuir significativament l'expressió de NF. kB i COX-2 en cèl·lules tractades amb PM (pàg<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Discussió

Recentment, el seguiment de la concentració de partícules a l'aire s'ha convertit en un dels indicadors més importants utilitzats per avaluar l'índex de qualitat de l'aire. La pell és l'òrgan immune més gran dels éssers humans, i la sobreexposició al PM podria danyar les funcions de la pell. Jin et al. va revelar que diversos tipus de PM no només es van quedar a l'estrat còrni exterior de l'epidermis, sinó que també van penetrar a l'estrat espinós i els fol·licles pilosos [14]. Si s'exposa a una PIA excessiva durant molt de temps, això provocarà una disfunció de la barrera cutània i s'associarà a moltes malalties de la pell, com ara dermatitis atòpica, psoriasi, acne i envelliment [19,20]. Dijkhoff et al. Il·lustra clarament que el PM pot desencadenar la formació de ROS exògena i endògena, donant lloc a una progressió de l'estrès oxidatiu, inclosa la peroxidació lipídica, l'oxidació de proteïnes, la disfunció mitocondrial, el dany a l'ADN, l'activació de la inflamació i l'acceleració del procés d'envelliment [15]. En conseqüència, contrarestar la sobreproducció de ROS induïda per PM és una bona estratègia i la primera opció per prevenir el dany per l'estrès oxidatiu durant la sobreexposició a PM. Estudis anteriors també han demostrat que els tractaments antioxidants, com el difloretohidroxicarmalol [21], el dieckol [22], l'extracte d'Opuntia humifusa [23] i l'extracte de cirera àcida [24] poden atenuar eficaçment la disfunció dels queratinòcits induïda per PM. Els nostres resultats també van trobar que l'OA en DMSO pot reduir la producció de ROS induïda per PM i prevenir el dany de PM. A més, NF-kB és un factor de transcripció omnipresent i inductible que regula l'expressió de proteïnes proinflamatòries, com la COX-2, que tenen un paper crític en moltes malalties de la pell. Els nostres resultats van esmentar que l'OA pot disminuir l'activació induïda per PM de NF-kB per inhibir l'expressió de la proteïna inflamatòria COX-2[25]. A més, l'activació de la senyalització de MAPK pot millorar l'expressió d'AP-1 i condueix a la regulació transcripcional dels MP[18]. En aquest estudi, l'OA va ser capaç de suprimir l'expressió de la proteïna de l'envelliment de la pell MP-1 i augmentar l'expressió de la proteïna anti-envelliment de la pell TIMP-1 per prevenir l'envelliment dels queratinòcits induït per PM. Els nostres resultats també van demostrar que l'OA va inhibir eficaçment la fosforilació de JNK. Per tant, l'OA pot inhibir la inflamació i l'envelliment de la pell induïda per PM mitjançant la regulació a la baixa de la via de senyalització ROS / JNK en els danys dels queratinòcits induïts per PM.

Segons el que sabem, la poca solubilitat en aigua dels compostos actius està associada a una baixa biodisponibilitat, la qual cosa limita la seva aplicació a les indústries de la medicina, l'alimentació i la cosmètica [26,27]. És ben sabut que els compostos amb poca solubilitat en aigua tenen diverses característiques fisicoquímiques comunes, com ara una mida de partícula excessivament gran, una àrea superficial més baixa, una estructura lipòfila i una forma cristal·lina [28]. Els nostres resultats també van indicar que l'OA en brut tenia aquestes propietats fisicoquímiques, inclosa una gran mida de partícula (5079,50 ± 384,87 nm), una pols granular irregular 3-60 um amb una àrea superficial inferior (figura 2C) i una forma cristal·lina evident. Aquests resultats van indicar que la solubilitat en aigua de l'OA era inferior a 0,01 ug/ml i es podria classificar com un compost actiu pràcticament insoluble segons la classificació de solubilitat en aigua de la Farmacopea dels Estats Units (USP)[29]. Si aquests inconvenients no es poden resoldre, les activitats de l'OA a la pell serien molt limitades. El present estudi va utilitzar amb èxit PVPK90 i HPBCD com a portadors mitjançant un procés d'electrospinning per preparar OAnf. La millora de la solubilitat en aigua és l'índex principal utilitzat per confirmar la formulació farmacèutica òptima, i els nostres resultats van demostrar que OA:PVPK90:HPBCD a 1:8:20 tenia la millor solubilitat en aigua. Això va indicar que OAnf augmentava eficaçment la solubilitat en aigua de les crues. OA en funció de la relació HPBCD. De la mateixa manera, estudis anteriors també han revelat que una proporció més alta de ciclodextrina millora la capacitat d'encapsulació de la formulació i dóna lloc a un augment significatiu de la solubilitat en aigua i l'activitat biològica de la curcumina [30], resvera-trol [12], timol [31] , i difenoconazol[32].A més, el present estudi també va comparar les propietats fisicoquímiques de l'OA en brut i les seves nanofibres per dilucidar els mecanismes de millora de la solubilitat en aigua de les nanofibres OA.OA produïdes en aquest estudi eren filaments amb una mida nano uniforme. Els resultats de l'anàlisi de la mida de les partícules també van esmentar que l'OAnf reconstituït a l'aigua presentava partícules nanomètriques amb una homogeneïtat de distribució superior. Aquests resultats van indicar que l'OAnf tenia una superfície més gran que l'OA en brut. A més, la formació d'enllaços d'hidrogen intermolecular entre compostos actius i portadors també podria contribuir a la millora de la solubilitat en aigua. L'espectre de FTIR i HNMR d'OAnf va demostrar que l'OA en brut es va encapsular eficaçment a HPBCD i va formar una estructura de nanofibra estabilitzada amb PVPK90 mitjançant la formació de l'enllaç d'hidrogen intermolecular entre OA i HPBCD/PVPK90. La forma cristal·lina transformada en una forma amorfa del compost actiu també va ser un indicador de la millora de la solubilitat en aigua. El patró XRD d'OAnf va mostrar que l'estructura cristal·lina de l'OA en brut es va transformar en una estructura amorfa després de la formació de nanofibres. Aquest resultat similar també es va observar en diversos compostos actius carregats en nanofibres [12,30]. En conjunt, la formulació de nanofibres va millorar eficaçment la solubilitat en aigua de l'OA en brut mitjançant la millora de les propietats fisicoquímiques, inclosa una reducció de la mida de les partícules, un augment de la superfície, la formació d'enllaços d'hidrogen amb portadors i la transformació amorfa.

Les formulacions tòpics que contenen antioxidants són efectives per al lliurament a l'epidermis i la dermis per contrarestar l'estrès oxidatiu, la inflamació i l'envelliment de la pell induïts per PM [33]. Segons el coneixement de l'absorció de la pell, l'estrat còrni és el factor limitant de la velocitat que limita la penetració de la pell i l'absorció de compostos actius, donant lloc a una disminució de l'activitat biològica [34]. El resultat de la penetració cutània in vitro va indicar que l'OAnf passava a través de l'estrat còrni amb més facilitat i rapidesa que l'OA cru i es va mantenir a l'epidermis i la dermis en grans quantitats. Aquest resultat va confirmar que OAnf pot millorar eficaçment l'absorció cutània de l'OA cru. A continuació, per determinar si l'OAnf tenia una millor activitat anticontaminació que l'OA cru, en aquest estudi, es va utilitzar un model de dany dels queratinòcits induïts per PM per comparar les seves activitats biològiques. Els nostres resultats van demostrar que l'OAnf en PBS tenia millors efectes anticontaminació que l'OA cru, inclosa la reducció de la sobreproducció de ROS, la disminució de l'expressió de proteïnes inflamatòries (COX-2 i NF-kB) i la proteïna de l'envelliment de la pell (MP{-1), l'augment de l'expressió de proteïnes anti-envelliment de la pell (TIMP-1) i la fosforilació JNK regulada a la baixa. Per tant, OAnf podria ser una formulació tòpica com a agent antioxidant per prevenir el dany dels queratinòcits induïts per PM.

En resum, OAnf va millorar les seves propietats fisicoquímiques per resoldre la mala solubilitat en aigua de l'OA cru i també va millorar significativament l'absorció de la pell de l'OA cru. OAnf tenia millors activitats antioxidants, antiinflamatòries i antienvelliment en els danys dels queratinòcits induïts per PM. En conseqüència, suggerim que OAnf es podria utilitzar com a producte per a la cura de la pell o com a formulació farmacèutica per prevenir els danys a la pell induïts per PM en el futur.

Aquest article està extret de Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants