La prevalença global de la malaltia renal crònica (ERC) augmenta amb l'envelliment de la població

Contacteu amb oscar.xiao@wecistanche.com per obtenir més informació

Antecedents:La fibrosi és una de les característiques patològiques més freqüents del procés d'envelliment del ronyó, i la fibrosi en els ronyons envellits també agreuja el procés de malaltia renal crònica (ERC). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) és una droga botànica d'ús comú al folklore xinès. No obstant això, pocs estudis han informat dels seus efectes farmacològics. Aquest estudi tenia com a objectiu explorar l'efecte de l'extracte d'etanol CF sobre la fibrosi renal en ratolins SAMP8 i identificar compostos potencialment actius.

Mètodes:Es van utilitzar 8 propensos a ratolí accelerat per senescència (SAMP8) com a models animals i es van administrar diferents dosis de CF per sonda durant un mes. Observar el grau d'envelliment renal en ratolins mitjançant la tinció de -galactosidasa. La tinció de Masson i els nivells d'expressió de Col-lI, a-SMA i FN es van utilitzar per avaluar la fibrosi renal en ratolins. Es van mesurar els nivells d'expressió de proteïnes de la via Nrf2 i la via Wnt/-catenina/RAS al ronyó. I la -galactosidasa (-gal) va induir cèl·lules NRK-52E com a model in vitro per examinar els components actius de la CF.

Feu clic aquí per saber-ne més

Resultats:L'extracte d'etanol CF va inhibir significativament l'activitat de la -galactosidasa renal i els nivells d'expressió dels ratolins Coll, a-SMA i FNin SAMP8, i va millorar la tinció de Masson en ratolins SAMP8. La CF va reduir notablement les proteïnes urinàries, la creatinina, el nitrogen ureic i els nivells sèrics de TNF-a i IL-1 en ratolins SAMP8 i va augmentar significativament els nivells de SOD i GSH-Px. A més, la CF va activar la via Nrf2 i va bloquejar la via Wnt/-catenina/RAS als ronyons dels ratolins. A més, 3,4-dihidroxi fenil etanol (SDC{-0-14,16) i (3,{4-dihidroxi fenil etanol{-8-O-[{4-O-trans -cafeoil- -D-apiofuranosi-(1→3)- -D-glucopiranosil (1→6)]- -D-glucopiranòsid (SDC{-1-8) es va aïllar de CF , que va reduir la senescència de les cèl·lules NRK-52E, i potser els ingredients actius de la FQ jugant el paper anti-envelliment.

Conclusions:Els nostres experiments van il·luminar que l'extracte d'etanol CF pot millorar la fibrosi renal en ratolins SAMP8 mitjançant la via Wnt/-catenina/RAS. I SDC-0-14,16 i SDC-1-8 poden ser la base material perquè la FQ exerceixi efectes relacionats amb la senescència antirenal.

Paraules clau:Envelliment, Corallodiscus flabellata, Ronyó, Fibrosi renal, SAMP8, Senescència, Wnt/-catenina/RAS

Introducció

La prevalença global de la malaltia renal crònica (ERC) augmenta amb l'envelliment de la població i suposa una càrrega important per a la societat [1-3]. La manifestació patològica més freqüent de l'ERC és alguna forma de fibrosi renal[4]. Així mateix, la fibrosi renal també és un dels signes de l'envelliment renal [2]. Els estudis han demostrat que l'estrès oxidatiu, la inflamació, la Wnt/-catenina, el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS) i la senyalització de rapamicina (mTOR) estan relacionats amb la CKD induïda per la senescència [5]. La fibrosi renal en els ronyons envellits està estretament relacionada amb l'activació de la via de senyalització Wnt/-catenina i RAS [6]. Després de l'activació de Wnts, la -catenina al citoplasma es trasllada al nucli, on s'uneix al factor d'unió del potenciador limfoide (LEF)/la família de factors de transcripció del factor de cèl·lules T (TCF) i inicia la transcripció dels gens diana aigües avall. Curiosament, la regió promotora del gen RAS també conté llocs d'unió LEF/TCF, que permet que -catenina promogui la unió de LEF-1 a aquests llocs[7].colesterol de cistanche,Per tant, dirigir-se a la via de senyalització Wnt/-catenina/RAS podria ser una estratègia terapèutica potencial per a la fibrosi renal [8,9]. En els últims anys, la teràpia de substitució de la fibrosi renal amb productes naturals ha cridat l'atenció de molts estudiosos [10] . Xiaoyan Shen et al. van trobar que el ginsenòsid Rgl va millorar la fibrosi glomerular durant l'envelliment renal mitjançant la inhibició de l'activació de l'inflamsoma NLRP3 en ratolins SAMP8 [11]. Aquest estudi va explorar l'efecte de l'extracte de C. flabellate (CF) sobre la fibrosi renal en ratolins SAMP8 de la via Wnt/-catenina/RAS.

Cistanche pot anti-envelliment

La FQ com a planta medicinal a la Xina es va registrar per primera vegada a "Dian Nan Ben Cao". La planta sencera s'utilitza habitualment per tractar la disenteria, l'ejaculació precoç, la malaltia de les vesícules seminals i la malaltia renal a les zones de minories ètniques de la Xina [12]. , hi ha pocs informes sobre la FQ en la investigació moderna. Els estudis farmacològics al nostre laboratori van trobar que l'extracte de CF tenia efectes diürètics i millorava la insuficiència hepàtica induïda per lipopolisacàrids/D-galactosamina i el dany cerebral en rates [13, 14]. I estudis fitoquímics sobre va revelar que els glucòsids feniletanoides i els flavonoides eren els principals components químics de la FQ [15,16] L'objectiu d'aquest estudi era investigar l'efecte de l'extracte de CF sobre la fibrosi renal en ratolins SAMP8 i dilucidar el seu possible mecanisme, per tal de proporcionar evidència experimental per al tractament de la malaltia renal amb CF descrita en llibres antics.

Materials i mètodes

Recollida i extracció del material vegetal

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" registra que la CF es pot collir durant tot l'any. Les plantes CF utilitzades en aquest experiment es van collir al comtat de Xixia, província de Henan, Xina al setembre. Va ser identificat pel professor Suiqing Chen de la Universitat de Medicina Xinesa de Henan i els exemplars es van emmagatzemar a la biblioteca d'exemplars del laboratori.efectes secundaris de cistanche deserticolaLes plantes (1 kg) es van refluxar amb etanol al 50 per cent (3 × 12 L, cada 1 h) i la barreja es va filtrar amb 16 capes de gasa. Els filtrats combinats es van assecar per evaporació rotativa utilitzant un liofilitzador. Finalment, el rendiment percentual d'extracte brut d'etanol al 50 per cent de CF va ser del 15,5 per cent. L'extracte sec es va guardar a la nevera fins a un nou ús. Els materials suplementaris inclouen les dades rellevants sobre la designació dels ingredients de l'extracte de CF.

En aquest estudi es va utilitzar un altre procés de separació informat anteriorment per obtenir la fracció d'elució d'aigua, la fracció d'elució d'etanol del 20 per cent, la fracció d'elució d'etanol del 30 per cent i la fracció d'elució d'etanol del 40 per cent de CF [13]. La fracció d'etanol del 40 per cent es va separar mitjançant Sephadex LH-20 i una columna de gel de sílice i es va purificar mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) semipreparativa per obtenir finalment compostos com SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(alcohol p-hidroxibenzílic).

Animals i administració

En aquest estudi es van utilitzar ratolins SAMP8 masculins de sis mesos i ratolins resistents a la senescència 1 (SAMR1) del Primer Hospital Afiliat de la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Tianjin (Tianjin, Xina). Els animals es van allotjar sota condicions de llum controlada (12-h cicle de llum/foscor), temperatura (23-25 grau C) i humitat (45-55 per cent) i van rebre una dieta estàndard i un anunci d'aigua libitum. Un total de 48 ratolins SAMP8 es van dividir en quatre grups experimentals (n=12/grup): ratolins model SAMP8 (M), ratolins SAMP8 tractats amb extracte d'etanol CF a dosis baixes (CF-L, 387,5 mg/kg, intragàstricament), ratolins SAMP8 tractats amb extracte d'etanol CF a dosis mitjanes (CF-M, 775 mg/kg, intragàstricament) i ratolins SAMP8 tractats amb extracte d'etanol CF a dosis altes (CF-H, 1550 mg/ kg, intragàstricament). Els ratolins dels grups de control SAMRI (Con, n=10) i SAMP8 (M) van ser tractats amb solució salina fisiològica (0,9 per cent). Tots els ratolins van ser tractats per via oral durant 1 mes. Tots els experiments amb animals van ser aprovats pel comitè d'ètica de la Universitat de Medicina Xinesa de Henan i es van realitzar segons les directrius institucionals (Henan, número d'aprovació de la Xina: HACTCM-2018009060-19). Durant l'experiment, hi va haver una mort de ratolí en cadascun dels grups Con i M, i dos ratolins van morir al grup CF-H.

Recollida de mostres

Al final de l'experiment, els ratolins es van allotjar individualment en gàbies metabòliques durant 12-h col·leccions urinaris. Els ratolins van ser anestesiats amb isoflurà i es van recollir mostres de sang mitjançant hemorràgia retroorbital. Els ronyons de cada ratolí es van extirpar quirúrgicament i es van mantenir a 80 graus fins a les anàlisis.

Cultiu cel·lular i estudi in vitro

Les cèl·lules NRK-52E adquirides al Banc de cèl·lules de l'Acadèmia Xinesa de Ciències (Xangai, Xina) es van cultivar per investigar l'efecte de l'extracte de CF sobre l'envelliment cel·lular causat per la D-galactosa (D-gal, S11050, Yuanye, Xangai, Xina). Les cèl·lules NRK-52E es van cultivar en la modificació de Dulbecco del medi Eagle's Dulbecco (DMEM, 12.100.046, Thermo Fisher, Massachusetts, EUA) subministrat amb un sèrum boví fetal al 10 per cent en una incubadora a 37 graus C i en presència de 5 per cent , les cèl·lules de CO es van fer créixer en 96-plaques de pous o 6-plaques de pous fins a 80-85 per cent de confluència i després es van tractar amb medis de creixement que contenien diferents combinacions de fàrmacs: Mitjà més D-gal ( 20 mg/mL）, Mitjà més D-gal més CF (10, 25,50, 100 ug/mL) o Mitjà més D-gal més compost monomèric (10 μM) respectivament durant 48 h. Posteriorment, el metil tiazolil tetrazoli ( MTT) es va utilitzar per detectar la viabilitat cel·lular i es va utilitzar la tinció de -galactosidasa per observar la senescència cel·lular.

Tinció de galactosidasa associada a la senescència

Els ronyons congelats de ratolins tallats en seccions de 10-μm de gruix i cèl·lules NRK-52E es van tacar amb -galactosidasa associada a la senescència (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Xangai, Xina) seguint els protocols del fabricant.

Anàlisi histològica

Les seccions de ronyó es van fixar amb paraformaldehid tamponat al 4 per cent i les seccions incrustades en parafina de 10- μm de gruix es van tacar amb tricrom de Masson (G1006, Service, Wuhan, Xina) i es van observar microscòpicament. Les àrees de color blau de les seccions tacades de tricrom de Masson es van mesurar quantitativament a partir de sis camps seleccionats aleatòriament i es van analitzar amb el programari Image-Pro Plus 6.0.

Mesures bioquímiques

Les mostres d'homogeneïtat de sèrum i ronyó es van descongelar a temperatura ambient i els nivells de superòxid dismutasa (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Xina), glutatió peroxidasa (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Xina), interleucina-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Wuhan, Xina), factor de necrosi tumoral- (TNF- , RK00027, ABclonal, Wuhan, Xina), nitrogen ureic (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Xina), creatinina (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Xina) en sèrum de ratolí, proteïna urinària total (C{035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Xina) a l'orina del ratolí i els nivells d'expressió del col·lagen tipus I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Xina), -actina del múscul llis (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Xina), fibronectina (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Xina) en teixits renals de ratolí es van mesurar seqüencialment segons el protocol del fabricant del kit d'assaig.

Anàlisi immunohistoquímica

L'anàlisi immunohistoquímica es va realitzar mitjançant el mètode rutinari [17]. Els anticossos utilitzats incloïen els següents: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, EUA), -catenina ({17565-1-AP, Proteintech, Chicago, EUA), receptors d'angiotensina II tipus 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, EUA), factor p-nuclear eritroide 2-factor 2 relacionat (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Regne Unit), pc-Fos (ab27793, Abcam, Cambridge, Regne Unit) ), factor de creixement del teixit connectiu (CTGF, GB11078, Servei, Wuhan, Xina). Les seccions es van observar al microscopi (Olympus, Tòquio, Japó).dosificació de cistanche redditMesureu l'àrea i la densitat òptica integrada (IOD) de l'àrea amb expressió bronzejada mitjançant el programari Image-Pro Plus 6.0 i calculeu la densitat òptica mitjana (MOD, MOD=IOD/àrea) per a semi -Anàlisi quantitativa.

Anàlisi Western blot

L'assaig de Western blot es va realitzar tal com es descriu en un estudi anterior [18]. Breument, els teixits renals es van homogeneïtzar en tampó de lisi i es van quantificar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes Bradford (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Xina). A continuació, els homogeneïts es van sotmetre a electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida, es van transferir a la membrana de fluorur de polivinilidè i es van bloquejar en un tampó de bloqueig (4 per cent de llet seca sense greix) durant 90 min. Després es van incubar amb anticossos primaris (Wnt4; renina; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; proteïna 1 associada a Kelch-like ECH (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Xina); -actina (AC026, Abclonal, Wuhan, Xina); i gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Xina)) durant la nit a 4 graus, seguida d'incubació amb un anticòs secundari adequat conjugat amb presència de fluor durant 1 h a temperatura ambient. . Les proteïnes d'interès es van escanejar amb un escàner IR Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, EUA) i es van quantificar les intensitats del senyal mitjançant el programari Image Studio. Els nivells de proteïnes es van normalitzar contra la -actina o GAPDH.

Anàlisi UPLC-Q-TOF-MS per a mostres de ronyó

Els teixits renals es van pesar i homogeneïtzar en solució salina fisiològica gelada (p/v=1:1). A continuació, es va afegir 1 ml d'acetonitril a 200 μL de mostres d'homogeneïtat de teixits, seguit d'extracció ultrasònica durant 30 min. L'extracte es va centrifugar a 12,000 g i 4 graus durant 10 min. El sobrenedant es va introduir al vial per a l'anàlisi. La separació cromatogràfica es va realitzar amb cromatografia líquida d'ultraperformance (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, EUA), amb el sistema LC que consta d'una columna Acclaim RSLC 120 C18 (2,2 μm, 2,1 × 100 mm); Thermo Scientific).Beneficis de l'extracte de cistancheLa fase mòbil constava de dissolvent A (acetonitril) i aigua amb {{0}}, 1 per cent d'àcid fòrmic (B). La separació es va realitzar mitjançant l'elució en gradient de la següent manera: 10-70 per cent A de 0 a 3 min, 70-78 per cent A de 4 a 13 min, 78-90 per cent A de 14 a 13 min. 15 min, 90 per cent -10 per cent A de 15 a 16 min, i 10 per cent A de 16 a 20 min. El volum d'injecció de la mostra de prova va ser de 2 μL. L'anàlisi d'espectrometria de masses (MS) es va realitzar utilitzant una font ESI en les condicions següents: la tensió capil·lar en mode positiu era de 3,5 kV i la tensió capil·lar en mode negatiu era de 3,2 kV. La pressió del nebulitzador era de 2,0 bar, la temperatura del gas sec era de 230 graus i el cabal era de 8 L/min.

Anàlisi estadística

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}},05; es va utilitzar l'anàlisi unidireccional de la variància per a la comparació entre grups. El valor AP inferior a 0,05 es va considerar estadísticament significatiu.

Resultats

La CF va millorar l'envelliment i la fibrosi dels ronyons en ratolins SAMP8

Per investigar l'efecte de la CF sobre els ronyons dels ratolins SAMP8, es va mesurar l'activitat SA- -gal als ronyons. A la figura la, l'activitat SA- -gal als teixits renals va augmentar significativament en el grup M (millora blava). L'administració de CF-L i CF-M va inhibir significativament l'activitat de la galactosidasa als ronyons de ratolins SAMP8, mentre que la millora de CF-H no va ser significativa. A més, l'índex renal del grup model era significativament més baix que el del grup control (Fig. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

La CF va millorar la funció renal, l'estrès oxidatiu i els nivells d'inflamació en ratolins SAMP8

A més, es van provar els indicadors de funció renal de cada grup de ratolins, que incloïen volum d'orina en ratolins durant 12 h, nivells de Cr i nitrogen d'urea al sèrum i nivells de proteïna de l'orina. Tal com es mostra a la figura 2a-d, els nivells de proteïna de l'orina, Cr sèric i nitrogen d'urea sèrica del grup model eren significativament més alts que els del grup control (Fig. 2a, P).<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche genghis khanA continuació, es va explorar si la CF va modular beneficiosament l'estrès oxidatiu i la inflamació als ronyons de ratolins que envelleixen ràpidament. Com es mostra a la figura 2e-h, els nivells de SOD i GSH-Pxin als ronyons del grup M eren significativament inferiors als del grup Con, i els nivells d'IL-1 eren significativament més alts que els de el grup Con. Després del tractament amb CF, els indicadors anteriors s'han millorat, especialment l'efecte de millora de CF-L i CF-M és millor.

CF va activar la via Nrf2 al ronyó de ratolins SAMP8

El nivell d'expressió de p-Nrf2 es va mesurar en teixits renals per investigar si la via Nrf2 estava implicada en l'efecte protector de CF (Fig. 3a-c) en el present estudi. El nivell d'expressió de p-Nrf2 va disminuir significativament només en el grup SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF va atenuar l'activació de senyalització Wnt/-catenina/RAS al ronyó de ratolins SAMP8

Per tal d'explorar encara més el mecanisme potencial de la FQ que exerceix l'efecte anti-fibrosi. La localització de proteïnes es va realitzar mitjançant immunohistoquímica. Com es mostra a la figura 4a, el nivell d'expressió de Wnt4 i

-La catenina es va induir principalment a les cèl·lules tubulars renals. Es van observar resultats similars quan es van avaluar AGTR1, els objectius de la via aigües avall de la senyalització Wnt (Fig. 4a). Després d'això, es va quantificar el nivell d'expressió de proteïnes i els resultats van mostrar que les proteïnes Wnt4, -catenina, renina i AGTR1 es van acumular al teixit renal dels ratolins del grup model, mentre que la CF va inhibir significativament aquestes alteracions (Fig. 4b-f). ). A més, també es va localitzar i analitzar quantitativament el nivell d'expressió de CTGF. D'acord amb els resultats esmentats anteriorment, el CTGF es va expressar principalment als túbuls renals i la CF va inhibir notablement l'activitat del CTGF (Fig. 4d g).

La CF i els seus compostos van inhibir la senescència de les cèl·lules NRK-52E induïdes per D-gal

Les cèl·lules NRK-52E induïdes per D-gal es van utilitzar per examinar certs ingredients actius a la FQ, per determinar la base material per al tractament dels ronyons senils mitjançant l'extracte de CF. Els resultats van mostrar que la CF va millorar la viabilitat cel·lular de manera dependent de la dosi i els compostos

SDC-0-14,16 i SDC-1-8 aïllats de CF van tenir millors efectes sobre la proliferació cel·lular. A més, 25 ug/mL CF i els compostos SDC-0-14,16 i SDC-1-8 van mostrar l'efecte d'inhibir l'activitat de la -galactosidasa (Fig.5).

L'anàlisi de la PCA millorada amb CF del teixit renal en ratolins SAMP8 Es va realitzar una anàlisi de components principals (PCA) per explorar els efectes de la CF en ratolins SAMP8. Com es mostra a la figura 6a, hi havia una agrupació òbvia entre els grups control i model (R2X=0.542; Q2=0.38), cosa que suggereix que els metabòlits endògens dels ratolins SAMP8 eren diferents de SAMR1. ratolins, cosa que fa que es desviïn del grup SAMR1. Com es mostra a la figura 6b, els diferents grups de CF també es van agrupar en diferents classes dels grups de control i model, i els grups de CF es van apropar al grup de control, cosa que indica que el

Els metabòlits endògens dels ratolins SAMP8 intervenits per CF eren similars als dels ratolins SAMR1.

Discussió

L'envelliment té un paper important en la progressió de la CKD [19]. A mesura que avança la fibrosi de la ERC, les cèl·lules senescents expressen i segreguen factors profibròtics (TGF-, CTGF, etc.) i factors proinflamatoris (IL-1, IL{-6, TNF-, etc. ), que són factors de fenotip secretor associats a la senescència, accelerant així la fibrosi renal [20, 21]. Actualment, la medicina tradicional xinesa ha aconseguit bons resultats en el tractament de la fibrosi renal amb menys efectes secundaris [22]. Aquest estudi va explorar els efectes intervencionistes de l'extracte de CF sobre la fibrosi renal en ratolins SAMP8. La soca de ratolí seleccionada per a aquest estudi va ser SAMP8, que es va desenvolupar a partir de la vida útil, la senescència i les puntuacions de classificació fenotípica patològica dels ratolins AKR / i va ser un model d'envelliment accelerat únicament d'origen genètic [23,24]. Els estudis han demostrat que els canvis en la patologia renal dels ratolins SAMP8 (9 mesos) inclouen fibrosi tubulointersticial i glomeruloesclerosi segmentària focal [25]. I es va trobar que la fibrosi renal en ratolins SAMP8 estava relacionada amb l'edat [6]. Per tant, vam provar l'activitat de la -galactosidasa i

el nivell de fibrosi renal en ratolins SAMP8 i va trobar que CF-L i CF-M milloraven la fibrosi renal i l'activitat de -galactosidasa en ratolins SAMP8 (Fig.1). I també vam provar la producció d'orina dels ratolins. D'acord amb els estudis publicats anteriorment que indiquen que la CF obtinguda per dos processos diferents tenia efectes diürètics [13], l'extracte va augmentar significativament el volum d'orina dels ratolins SAMP8. A més, el present estudi va demostrar que la suplementació amb CF va millorar la funció renal, l'activitat dels enzims antioxidants i els nivells de factors inflamatoris en ratolins SAMP8 (Fig.2).

El sistema Keap1-Nrf2 va cridar l'atenció de molts estudiosos en els darrers anys a causa de les seves propietats antioxidants i antiinflamatòries. El seu potencial farmacològic en el tractament de malalties renals s'havia estudiat àmpliament en estudis clínics i no clínics [26]. Nrf2 és un regulador transcripcional mestre per a gens relacionats amb l'estat redox i els efectes antioxidants [27]. Els estudis han demostrat que la fosforilació és necessària per a l'activació de Nrf2 i la inducció del gen objectiu [28]. L'activació de Nrf2 va millorar la progressió de la CKD prevenint l'estrès oxidatiu i mantenint l'homeòstasi redox cel·lular [29]. Com a factor de transcripció clau, Nrf2 té un paper crucial en la defensa contra l'estrès oxidatiu mitjançant la regulació dels seus antioxidants aigües avall i els enzims de desintoxicació [30]. Kim et al. va informar que el resveratrol, com a potent activador de Nrf2, va millorar la lesió renal progressiva relacionada amb l'envelliment [31]. En el present estudi, la CF va millorar l'atenuació de Nrf2 al ronyó de ratolins SAMP8 sense afectar el nivell d'expressió de Keapl, cosa que suggereix que l'extracte cru de CF podria millorar el dany oxidatiu als ronyons activant la via Nrf2 (Fig. 3).

La fibrosi renal es caracteritza per una deposició excessiva de matriu extracel·lular (ECM) que condueix a la formació de cicatrius al parènquima renal [32]. Es creu que el factor de creixement transformant- (TGF-) és una citocina clau en la sobreactivació de fibroblasts [33, 34]. Per descomptat, dirigir-se només a la via de senyalització del TGF és insuficient per reduir la fibrosi renal. Alguns estudis van indicar que CTGF, Wnt/-catenina, sistema renina-angiotensina, estrès oxidatiu, etc., estaven implicats en la fibrosi renal [35-37]. Wnt/-catenina és una via de senyalització conservada evolutivament implicada en la regulació de l'homeòstasi dels teixits, el desenvolupament d'òrgans i la reparació de lesions[38]. Cisternes et al. va discutir l'efecte pro-fibròtic de la senyalització Wnt tant al múscul esquelètic com al ronyó [39]. L'evidència creixent va establir que la via de senyalització Wnt/-catenina té un paper crucial en la regulació del desenvolupament i la progressió de les lesions fibròtiques renals després d'una lesió [40-42]. El senyal Wnt/-catenina és relativament silenciós als ronyons d'adults sans i s'activa un cop els ronyons estan sotmesos a diversos tipus de danys [43].

En els mamífers, la família Wnt té almenys 19 membres de la família crítics per al desenvolupament del ronyó. I almenys 15 d'aquests membres de la família estan regulats de manera diferent al ronyó envellit, inclòs Wnt4 [6]. Els resultats del present estudi van mostrar que el nivell d'expressió de la proteïna Wnt4 als ronyons dels ratolins SAMP8 era significativament superior al dels ratolins SAMR1, cosa que es va verificar tant mitjançant anàlisis Western blot com immunohistoquímiques (Fig. 4a, d i f). Casualment, el nivell d'expressió de la proteïna -catenina també es va regular. A més, tant Wnt4 com -catenina es van expressar en cèl·lules epitelials tubulars renals, tal com va revelar l'anàlisi immunohistoquímica (Fig. 4a i f). Wnt/-catenina va provocar fibrosi renal induint múltiples gens fibrogènics com ara components RAS, metaloproteinasa de matriu-7 (MMP{-7), inhibidor de l'activador del plasminogen 1 (PAI{-1) i caragol [37 ]. Zhou et al. va descriure Wnt/-catenina com el principal regulador aigües amunt, que controla l'expressió de tots els components RAS provats als ronyons [44]. Zhou et al. van utilitzar un model de rata de nefrectomia 5/6 (5/6 NX) per mostrar els nivells d'expressió dels components principals de RAS al cervell i als ronyons, com ara l'angiotensinogen, l'enzim convertidor d'angiotensina i l'angiotensina II AT{25 }}el receptor es va regular significativament. El nivell d'expressió regulat va ser inhibit per un bloquejador central de Wnt, que era un vector de virus adenoassociat que sobreexpressava el gen DKK1 [45]. De la mateixa manera, el present estudi va trobar que AGTR1 encara s'expressava a l'epiteli tubular renal, i els nivells d'expressió de renina i AGTRl als teixits renals dels ratolins SAMP8 eren significativament superiors als dels ratolins SAMR1 (Fig. 4a i dg). Aquests resultats van indicar que la via de senyalització Wnt/-catenina/RAS es va activar als ronyons dels ratolins SAMP8 i la CF va inhibir eficaçment l'activació d'aquesta via.

El CTGF exerceix múltiples funcions biològiques, com ara promoure la mitosi de les cèl·lules quimiotàctiques, induir l'adhesió i promoure la proliferació cel·lular i la síntesi d'ECM [35,46]. CCN2 (CTGF) va modular la senyalització Wnt unint-se a la proteïna 5/6 relacionada amb el receptor de lipoproteïnes de baixa densitat (LRP5/6) per mediar encara més la fibrosi [39, 47]. Altres estudis van utilitzar el silenciament gènic per descobrir i confirmar que Nrf2 regulava la via Wnt regulant el nivell d'expressió de CTGF, afectant la malaltia intersticial renal. A més, Nrf2 va regular el nivell de transcripció de CTGF principalment mitjançant el regulador transcripcional de CTGF c-Fos [48]. L'anàlisi immunohistoquímica va revelar que CTGF i pc-Fos s'expressaven principalment en cèl·lules epitelials tubulars renals, i que pc-Fos també es distribuïen als glomèruls. L'anàlisi quantitativa va mostrar que els nivells d'expressió d'ambdues proteïnes estaven inhibits per CF (Figs.3b i e i 4a i c). Finalment, l'anàlisi PCA es va utilitzar per verificar encara més que la CF millorava el dany renal en ratolins SAMP8 (Fig.6). El present estudi va proporcionar proves que la CF no només va activar la senyalització de Nrf2, sinó que també es va basar en Nrf2 per equilibrar l'estrès oxidatiu i la inflamació, va inhibir la senyalització Wnt/-catenina/RAS i va millorar l'envelliment renal i la fibrogènesi renal. Tanmateix, també hem trobat una millora inconsistent en l'efecte de la CF sobre la tinció de Masson i SA- -gal en aquest experiment. S'especula que això pot ser degut a la progressió inconsistent de l'envelliment renal i la fibrosi renal en ratolins SAMP8. El grau d'envelliment renal dels ratolins en aquest experiment pot ser més greu que la fibrosi. Per tant, l'efecte millorant de CF-H sobre l'envelliment renal en ratolins SAMP8 no era tan evident com el de la fibrosi renal.

Com a monosacàrid reductor, la D-galactosa s'utilitza àmpliament en diverses malalties relacionades amb l'edat in vivo i in vitro. Es va trobar que D-gal causava senescència i lesions a les cèl·lules NRK-52E [49], induïa la senescència de les cèl·lules epitelials tubulars proximals del ronyó humà (cèl·lules HKC{-8) i augmentava els nivells d'expressió de dues cèl·lules renals. proteïnes marcadores de fibrosi FN i a-SMA [6]. En aquest estudi, es va utilitzar D-gal per induir cèl·lules NRK-52E in vitro. Mitjançant l'assaig de MTT i la tinció de -galactosidasa per detectar els compostos aïllats de CF, es va trobar que SDC-0-14,16 i SDC{-1-8 van millorar la viabilitat cel·lular induïda per D-gal i van inhibir la D-gal induïda. senescència cel·lular (Fig.5). Aquests suggereixen que la SDC-0-14,16 i la SDC-1-8 poden ser la base material perquè la FQ retardi l'envelliment renal. SDC-1-8 és un dels glicòsids feniletanoides. Es va trobar que els glicòsids feniletanoides allargaven la vida útil de Caenorhabditis Elegans [50], amb efectes anti-envelliment [51] i neuroprotectors [52-54]. Aquests proporcionen una direcció per al nostre estudi de seguiment sobre els efectes farmacològics de la FQ.

Conclusions

En conclusió, els estudis in vivo van demostrar que la CF va reduir la fibrosi renal en ratolins grans. Es van trobar alguns ingredients actius potencials en experiments in vitro. Aquestes troballes van proporcionar suport farmacològic per tractar la malaltia renal mitjançant la FQ i una direcció per a més investigacions sobre els ingredients actius de la FQ.

Aquest article està extret de Cao et al. BMC Medicina i Teràpies Complementàries (2022) 22:52