La codificació de la freqüència optogenètica de les oscil·lacions theta de l'hipocamp dissocia la recuperació de la memòria de treball dels codis espaitemporals de l'hipocamp Part 3

El ritme optogenètic de les neurones de l'EM condueix a una sincronia theta no fisiològica

Sorprenentment, les estimulacions optogenètiques de 8 Hz que s'associen amb el ritme de les oscil·lacions theta van provocar una disminució del rendiment quan s'aplicaven durant la codificació o la recuperació de la memòria episòdica a la tasca NPOR, així com la recuperació de la memòria de treball espacial a la tasca DNMTS. Per entendre millor els efectes del ritme theta sobre la fisiologia de l'hipocamp, vam analitzar el bloqueig de fase de l'oscil·lació theta abans i durant les estimulacions optogenètiques de 8 Hz (figura suplementària 7a) i vam trobar que aquesta estimulació va provocar un augment de la sincronia de fase entre les èpoques d'estimulació (figura suplementària 7b). A més, vam analitzar la correlació creuada de les oscil·lacions theta a través del CA1 dorsal (~ 1 mm de distància entre els elèctrodes al llarg de l'eix septotemporal (figura suplementària 7c) i vam trobar que els ritmes theta de ritme a 8 Hz van augmentar la correlació creuada entre aquests dos elèctrodes ( Fig. 7d suplementària).

La genètica és la ciència que estudia l'herència i la variació genètica, i la memòria és un aspecte de gran preocupació. Aleshores, què té a veure la genètica amb la memòria? Aquest article explorarà qüestions relacionades amb la memòria des d'una perspectiva genètica.

En primer lloc, sabem que els gens genètics són la base del desenvolupament físic i intel·lectual humà, i si aquests gens són superiors afectarà la memòria de les persones. Les darreres investigacions mostren que el coeficient intel·lectual i la memòria de les persones es veuen afectats per factors genètics. La investigació demostra que els gens genètics tenen un paper crucial en la intel·ligència i la memòria. Per tant, algunes persones neixen amb records més forts, mentre que altres necessiten treballar molt i entrenar per millorar la seva memòria.

En segon lloc, els factors ambientals també són factors importants en el desenvolupament de la memòria. No només necessitem el suport dels gens genètics sinó que també necessitem millorar la nostra memòria mitjançant la formació científica i els bons hàbits de vida. Per exemple, podem insistir en fer exercici cada dia, dormir prou, seguir els principis d'adaptació dels àpats, etc., que poden ajudar a millorar la nostra funció cerebral i la nostra memòria.

Finalment, la gent comuna, no emfatitzem excessivament la influència dels factors genètics en el desenvolupament de la memòria. Com que els factors genètics no són absoluts, la memòria i la intel·ligència de les persones encara poden millorar-se millorant els seus esforços i formació. Hem de mantenir sempre una actitud positiva i d'aprenentatge continu, i explorar i desenvolupar constantment el nostre potencial de memòria. Crec que només d'aquesta manera podrem ser més intel·ligents i tenir una major sensació de realització. En resum, la relació entre la genètica i la memòria és molt estreta, però no hem de posar l'accent en els factors genètics, sinó que hem de millorar constantment la nostra memòria i la nostra intel·ligència mitjançant la superació personal i l'entrenament.

Es pot veure que hem de millorar la nostra memòria. Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria perquè Cistanche deserticola és un material medicinal tradicional xinès amb molts efectes únics, un dels quals és millorar la memòria. L'eficàcia de la carn picada prové dels diferents ingredients actius que conté, entre ells àcid, polisacàrids, flavonoides, etc. Aquests ingredients poden afavorir la salut cerebral de diverses maneres.

Feu clic a Coneix 10 maneres de millorar la memòria

Discussió

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neurones mentre realitzen l'estimulació optogenètica de les neurones de l'EM amb una resolució de subsegons per controlar els ritmes theta i avaluar el seu paper en la fisiologia i la memòria de l'hipocamp. És important destacar que, utilitzant una excitatoriopsina i estimulacions remenades o de 8 Hz, vam poder abolir o ritme theta de l'hipocamp de manera consistent i robusta, respectivament.

En comparació amb la inhibició de l'EM utilitzant una opsina inhibidora o compostos farmacològics (per exemple, muscimol), el nostre enfocament permet la comparació entre subjectes de dos estats oposats (ritme vs abolit theta) mentre es manté els nivells d'activitat a les cèl·lules MS-PV. Vam combinar una tasca de seguiment lineal aton-cued que, juntament amb els enfocaments teòrics de la informació, ens van permetre desvincular els codis de l'hipocamp espacial i temporal. Aquest mètode alleuja la necessitat de llindars arbitraris, permetent un enfocament estandarditzat per a l'anàlisi d'imatges de calci. Tot i que una gran part de les neurones piramidals CA1 expressaven una barreja de codis espaciotemporals, vam centrar les nostres anàlisis en neurones aturdes específicament al lloc, el temps o la distància recorreguda.

Tot i que la codificació espacial s'ha investigat àmpliament a CA1, recentment els codis temporals i de distància han guanyat més interès. Els codis temporals28,35–37 i distància37 s'han extret mitjançant la fixació de senyals visuoespacials o s'han extret analíticament utilitzant models lineals generalitzats en paradigmes de realitat virtual26,27,38. Aquí, proposem un enfocament per desvincular codis espacials, temporals i de distància mitjançant un enfocament teòric de la informació que, juntament amb la nostra tasca d'alternança, permet l'anàlisi de codis espacials temporals i multiplexats del món real en animals en moviment lliure. Una gran quantitat de neurones piramidals CA1 codifiquen informació multiplexada de ubicació, distància i temps com s'ha informat anteriorment26,27,38, a més de senyals d'auto-moviment com l'acceleració, la velocitat i l'orientació60.

Vam trobar que la codificació de freqüència i les estimulacions optogenètiques de 8 Hz van abolir o ritme dràsticament els ritmes theta, respectivament, i van conduir a una disminució de l'activitat general en una subpoblació de cèl·lules piramidals CA1 sense provocar canvis significatius en l'activitat cel·lular del lloc, de manera similar als informes anteriors que utilitzaven inhibició farmacològica36, 46,47 o ritme optogenètic9,48 de MS o entrades septals a l'hipocamp. Com que se sap que les neurones de l'EM són el principal motor de les oscil·lacions de l'hipocamp, esperàvem que l'estimulació de l'EM s'associés amb una interrupció de l'activitat cel·lular de temps o distància en condicions de ritmes theta reduïts, però no es van produir canvis quan es va abolir o ritme theta. A més, el ritme de les oscil·lacions de l'hipocamp a 8 Hz no va provocar canvis en la qualitat dels codis espacials tal com es va informar anteriorment9 i no va alterar els codis temporals tal com s'observa al nostre paradigma de comportament.

Tot i que es va informar que les cèl·lules del temps (però no del lloc) podrien dependre directament de les entrades de l'escorça entorrinal medial (MEC)61, les proves experimentals recents suggereixen que les lesions de MEC no condueixen a cap alteració en la fisiologia de les cèl·lules del temps de l'hipocamp62. En particular, una investigació més recent va trobar que el ritme optogenètic de l'MS no va alterar els codis espacials de les cèl·lules de la quadrícula a l'entorhinalcortex63, cosa que suggereix a més que l'activitat de l'EM no està directament implicada en els codis espacials de la formació de l'hipocamp. Juntament amb els nostres resultats, això indica que els codis temporals podrien ser el resultat de càlculs dependents de l'EM dins del còrtex entorrinal63 (1) o generar-se intrínsecament dins de l'hipocamp (2).

Tot i que els primers estudis van trobar que l'EM va tenir un paper essencial en el manteniment de les cèl·lules del temps i el suport a la memòria de treball36, l'evidència recent experimental mostra que la contribució exacta de les cèl·lules del temps al rendiment de la memòria de treball podria ser menor del que es pensava anteriorment62. Atès que les neurones MS-PV probablement mantenen nivells d'activitat significatius durant l'estimulació optogenètica de freqüències (a diferència dels enfocaments d'inhibició), els nostres resultats recolzen fortament el paper de l'activitat septal cronometrada amb precisió en el suport de la memòria de treball, hipotetitzada anteriorment. Tot i que vam observar un rendiment de memòria reduït quan s'utilitzava l'estimulació optogenètica durant la recuperació, l'estimulació durant la fase de codificació de les tasques DNMTS no es va associar amb una memòria reduïda a la tasca DNMTS. El ritme de les taoscil·lacions a 8 Hz durant la fase de codificació o recuperació de la tasca NOPR va provocar una recuperació de la memòria deteriorada. Les nostres anàlisis electrofisiològiques revelen a més que aquesta estimulació va provocar que regions llunyanes del CA1 dorsal s'arrenguessin a la mateixa fase, amb un bloqueig de fase no fisiològica. Tot i que no vam investigar directament la relació causal entre els canvis de fase i el rendiment de la memòria, també es va trobar que el spiketiming i la precessió de fase estaven associats amb una funció de memòria de treball alterada tot i deixar la codificació del lloc intacte64. A més, s'ha demostrat anteriorment que el bloqueig de fase de les neurones piramidals a les taoscil·lacions és un predictor del rendiment de la memòria65.

En particular, una limitació del nostre enfocament per establir propietats d'ajust temporal i de distància és que requereix quatre vegades més mostreig que una pista lineal normal que augmenta les possibilitats de fotoblanqueig quan s'afegeixen condicions d'estimulació a la línia de temps experimental. Tot i que vam trobar que els codis espacials no es van veure afectats per les estimulacions optogenètiques dins de la mateixa sessió, un maquinari d'imatge més recent que inclou sensors amb una major sensibilitat podria ajudar a prevenir el blanqueig fotogràfic i permetre sessions de gravació més llargues, per tant el mostreig de cèl·lules temporals i de distància juntament amb estimulacions. També vam trobar que el conjunt de neurones que codifiquen de manera significativa i específica només una variable és petit en comparació amb el nombre de neurones conjuntives, cosa que fa que els requisits de mostreig per a aquestes neurones altament específiques siguin molt més alts.

Proporcionem proves experimentals que la manipulació de l'EM no altera la velocitat locomotora i que, per contra, la velocitat locomotora dicta la freqüència theta. Tot i que els codis de lloc i temps es van preservar durant les nostres estimulacions amb EM, una part (~ 6%) de les cèl·lules es va modular directament i podria tenir en compte les alteracions de la memòria observades en els nostres assajos de comportament. S'ha informat anteriorment que les interneurones PV a l'hipocamp formen part d'un microcircuit essencial per regular la consolidació de la memòria66,67, i les nostres manipulacions optogenètiques podrien estar associades amb el silenciament d'una part d'aquestes cèl·lules. A més, tot i que no vam observar canvis en les bandes de freqüència diferents de theta, no podem excloure que el temps d'espiga de la neurona piramidal CA1 es pogués alterar dràsticament quan s'agitaven oscil·lacions theta, mentre que es va demostrar que l'estimulació de 8 Hz no provocava un augment de l'activitat de l'hipocamp18, cosa que podria explicar els efectes diferencials de aquests patrons d'estimulació sobre el rendiment de la memòria de treball. Els problemes de memòria que vam observar probablement no eren colinèrgics: en primer lloc, en els nostres experiments immunohistològics, pràcticament no vam trobar cap expressió de ChrimsonR a les neurones ChAT de l'EM. En segon lloc, les nostres estimulacions optogenètiques no estaven associades amb canvis en les ondulacions de l'hipocamp, mentre que els informes anteriors indiquen Les neurones ChAT s'associen amb una freqüència d'ondulació reduïda45,57. La transfecció de ChrimsonR de les neurones MS VGLUT2 també és poc probable, ja que l'activació d'aquestes neurones s'associa amb un augment directe de l'activitat locomotora 68, que no vam observar.

Tot i que la disposició temporal precisa dels pics piramidals CA1 podria explicar, almenys parcialment, els efectes de l'estimulació de l'EM sobre la memòria, s'han de tenir en compte mecanismes alternatius. En particular, a més de l'hipocamp i l'escorça entorrinal, les neurones MS PV es projecten a l'escorça retrosplenial3 i podrien ser responsables d'alguns dels problemes de memòria observats aquí.

En resum, utilitzant imatges de calci, optogenètica i electrofisiologia, vam trobar que els ritmes theta es poden ritmar o abolir mitjançant l'estimulació de l'EM. Aquesta estimulació va afectar la recuperació de la memòria episòdica i de treball. Aquests efectes no van ser colinèrgics i no van interrompre l'activitat de l'ondulació de l'hipocamp. Finalment, mentre que una petita fracció de neurones de l'hipocamp va respondre directament a l'estimulació optogenètica de l'EM, les cèl·lules de lloc, temps i distància no es van interrompre per manipulacions de les oscil·lacions theta. En conjunt, aquests resultats suggereixen que, mentre que l'entrada de MS a l'hipocamp té un paper essencial en la memòria, els codis multiplexats a les neurones piramidals CA1 poden no ser el substrat directe per a aquestes funcions.

Mètodes

Els animals

Tots els procediments van ser aprovats pel Comitè de Cura dels Animals de la Universitat de McGill i el Consell Canadenc de Cura dels Animals (protocol 2015-7650). Un total de n=41 mascles (n=20) i femelles (n=21) de 8 a 16 setmanes d'edat, B6;129P2 ratolins PV-Cre (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) es van utilitzar en aquest estudi. n=5 ratolins es van utilitzar per combinar optogenètica amb imatges de calci; n es van implantar ratolins=3 per a controls d'imatge de calci, optogenètica i electrofisiològics; n=4 ratolins es van utilitzar en estudis electrofisiològics; n=29 ratolins es van transfectar i implantar per a assajos de comportament. Els ratolins es van allotjar individualment durant un cicle de llum/foscor de 12-h a 22 graus i un 40% d'humitat amb menjar i aigua a voluntat. Tots els experiments es van dur a terme durant la part de llum del cicle llum/foscor.

Vectors virals adenoassociats

El virus adenoassociat AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene # 100834, obtingut de la Universitat de Pennsylvania Vector Core) es va utilitzar en tots els experiments d'imatge de calci. El virus adenoassociat (AAV) del serotip dj (càpsida híbrida creada a partir de vuit serotips AAV diferents) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato es va obtenir del Vector Core Facility de la Oregon Health and Science University de Portland, Oregon. Tot i que és un gen domèstic, no vam observar transfecció en cèl·lules colinèrgiques (vegeu "Resultats" i Fig. 2b-e). Es va utilitzar una construcció eYFP sense la seqüència ChrimsonR com a control (anomenat control YFP en aquest manuscrit).

Procediments quirúrgics

Els ratolins es van anestesiar amb isoflurà (5% d'inducció, 0.5-1% de manteniment) i es van col·locar en un marc estereotàxic (David Kopf Instruments). La temperatura corporal es va mantenir amb un coixinet de calefacció, els ulls es van hidratar amb gel (Optixcare) i es va administrar carprofèn (10 ml/kg) per via subcutània. El crani es va netejar completament de tot el teixit connectiu i es van realitzar petites craniotomies mitjançant un broca dental per a la posterior injecció o implant.

Injeccions virals. Totes les injeccions virals es van realitzar mitjançant una pipeta de vidre connectada a un injector Nanoject III (Drummond). 500 nl d'AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (o control eYFP) es va lliurar al MS a una velocitat d'1 nL/s, a les coordenades següents basades en l'atles estereotàxic del ratolí de referència69 (distància de Bregma a mm): anteroposterior (AP) 0,85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) -4,50 utilitzant un angle de 5 graus en el pla ML. Després de la cirurgia, els animals van ser controlats fins a la seva recuperació.

Implant de fibra òptica. Dues setmanes després de la injecció, els ratolins van ser anestesiats per a la implantació seguint el mateix procediment quirúrgic. Es va implantar una fibra òptica de 200 μm de diàmetre amb virola ceràmica (Thorlabs) a les mateixes coordenades. Els implants es van cimentar al lloc utilitzant C&B-Metabond® (Patterson dental). Es va aplicar esmalt d'ungles negre sobre el ciment dental per bloquejar l'emissió de llum durant l'estimulació optogenètica.

Implants d'elèctrodes. Es va reduir una matriu de 7 microelèctrodes de tungstè (~ 1 MΩ d'impedància) a la CA1 dorsal que abastava estratpiramidal (pyr), estrat radiatum (rad) i estrat lacunosummoleculare (lm). Els cargols col·locats a l'os per sobre de l'escorça frontal i el cerebel van servir de base i de referència, respectivament. Després de la col·locació de l'elèctrode, el sòl i la referència, es va aplicar ciment dental per fixar l'implant de manera permanent al crani.

Implant per a imatges de calci. Hem injectat el virus AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL a 1 nl s-1) a l'hipocamp CA1 mitjançant les coordenades següents: anteroposterior (AP) - 1.86 mm de bregma, mediolateral (ML) 1.5 mm, dorsoventral (DV) 1,5 mm. Dues setmanes després de la injecció, els ratolins van ser anestesiats amb isoflurà i es va netejar el crani. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Imatges simultànies de calci i enregistraments electrofisiològics. Per controlar els efectes dels implants GRIN a la teta de l'hipocamp, així com la conversa creuada entre el mini-scopi i els llums d'excitació optogenètiques, vam connectar microelèctrodes de tungstè a les lents GRIN. Per a això, vam col·locar les lents GRIN horitzontalment sota un microscopi de baix augment en un entorn lliure de pols. Un microelectrode tungstè es va col·locar suaument a la vora superior de la lent GRIN mitjançant un micromanipulador. Hem utilitzat el diàmetre conegut de la lent GRIN com a unitat de referència per estimar la protrusió desitjada de l'elèctrode (~ 50 µm, avaluada digitalment després de fer una microfotografia de la preparació) per les nostres coordenades d'implantació planificades. Es van dipositar petites quantitats (~ 50 µL) de supercola a la vora superior de la lent GRIN amb l'elèctrode al seu lloc i es van deixar assecar durant ~ 10 min, abans d'aplicar la següent capa de cola. Es van utilitzar cinc capes fines per mantenir l'elèctrode connectat a la lent GRIN. Després de la implantació d'aquests conjunts d'elèctrodes GRIN utilitzant el protocol descrit anteriorment, els cables que sobresurten es van doblegar i amagar suaument sota una tapa protectora (d'1 a 1, 5 cm d'alçada) recuperada de la pera de la pipeta de succió manual com a reemplaçament de Kwik-Sil.

Procediments conductuals in vivo

Habituació. Els ratolins es van manipular suaument durant ~ 5 minuts durant una setmana, amb una habituació progressiva al procediment d'endoll (fibra òptica, miniscopi i cordons electrofisiològics preamplificats). Aleshores, els animals es van programar amb aigua (2 h d'accés al dia).

Enregistraments en miniscopi. Els miniscopis (V3) es van muntar mitjançant instruccions de codi obert (miniscope.org). Les dades d'imatge es van adquirir mitjançant un sensor d'imatge CMOS (Aptina, MT9V032) i es van multiplexar mitjançant un cable coaxial lleuger. Les dades es van adquirir mitjançant una caixa d'adquisició de dades (DAQ) connectada mitjançant un controlador d'amfitrió USB (Cypress, CYUSB3013). El comportament dels animals es va registrar mitjançant una càmera web de grau de consum (Logitech) muntada a sobre de l'entorn. El calci i les dades de comportament es van registrar mitjançant miniscope.org, el programari d'adquisició personalitzada DAQ font. El DAQ va adquirir simultàniament fluxos d'imatges de comportament i cel·lulars a 30 Hz com a fitxers.avi sense comprimir de 1000 fotogrames per a sessions d'enregistrament de 15-minuts, juntament amb les marques de temps corresponents per permetre l'alineació temporal precisa de les dades d'imatge de comportament i de calci.

Enregistraments electrofisiològics in vivo. Després d'una setmana de recuperació postquirúrgica i una setmana d'habituació a la configuració de lligament, es va registrar LFP dels ratolins implantats. Tots els senyals gravats dels elèctrodes implantats van ser amplificats pel preamplificador de corda abans de ser digitalitzats a 22 kHz mitjançant un sistema de gravació digital (Neuralynx, EUA). Els enregistraments de cada senyal de canal es van guardar juntament amb enregistraments de vídeo i senyals TTL del díode làser per a l'anàlisi posterior.

Estimulació optogenètica. L'estimulació làser es va lliurar a través d'un cable de fibra òptica (200 μm de diàmetre) mitjançant una font de llum de fibra de díode làser (lents dòriques). La intensitat de la llum es va calibrar i la longitud d'ona es va corregir mitjançant el paquet Power Meter amb la consola PM100D i S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Cada estimulació de ritme (inclosos 8 Hz) es va realitzar mitjançant polsos quadrats de 5 ms. Per aplicar l'estimulació de la llum codificada, hem utilitzat un microcontrolador Arduino per generar un senyal d'oscil·lació de soroll blanc directament alimentat a l'entrada analògica del controlador de díode làser. Per realitzar una estimulació de freqüència seleccionada aleatòriament, vam utilitzar un protocol estàndard de 5 s ON, 5 s OFF, però per a cada època d'estimulació, vam utilitzar un microcontrolador Arduino per seleccionar aleatòriament una freqüència d'estimulació a la banda theta. Quan s'aplicava l'estimulació optogenètica durant el comportament, es va col·locar un tros solt de tub termoretràctil al voltant de la unió entre el cordó de connexió i l'implant de virola del ratolí per limitar l'emissió de llum visible. Les intensitats de la llum s'expressen com a potència nominal, mesurada a la punta del conjunt implant-cordó de fibra òptica (abans de la col·locació quirúrgica) i corregida per a la longitud d'ona adequada.

Assajos de comportament

Pista lineal de to seqüencial. Els ratolins estaven programats amb aigua i només podien accedir a l'aigua durant 2 hores al dia de 6 a 8 de la tarda. Per desvincular els codis espacials, temporals i de distància, construïm una pista lineal de 134 cm de llarg amb maons Lego® de color gris mitjà, que permet modificacions i implementacions fàcils sense necessitat de modificar permanentment l'estructura del laberint. Els sensors piroelèctrics es van col·locar a cada extrem de la pista lineal i es van connectar a un microcontrolador Arduino. Cada detecció va activar un nou to en seqüència, que indicava el progrés cap al lliurament. Els següents tons es van utilitzar i es van lliurar mitjançant un altaveu apiezo: bips d'1 s a 2000 Hz, bips de 250 ms a 3000 Hz i to continu a 4000 Hz. Quan es va activar l'últim to continu, es va lliurar una recompensa (10% de sacarosa en aigua) al final de la pista lineal a la tapa d'un tub Falcon de 15 ml. Els canvis en la direcció de marxa abans d'activar el següent to es consideraven errors i no desencadenaven l'entrega de recompenses. El rendiment es va mesurar segons el nombre d'assaigs correctes (sense error) dividit pel nombre de proves totals.

Reconeixement de llocs d'objectes nous. El primer dia, es va permetre als ratolins explorar lliurement un camp obert gris fosc de 45 × 45 cm que contenia senyals visuals (grans reixetes blanques horitzontals i verticals) a les seves parets durant 10 min. El segon dia, es van presentar dos objectes idèntics (base de mà ajudant) durant 10 min. El tercer dia, es va permetre als ratolins explorar el mateix camp obert mentre es desplaçava la ubicació d'un dels dos objectes. Per controlar els possibles biaixos de preferències espacials, es van aleatoriar tant la posició inicial com la desplaçada dels objectes. Els ratolins han atribuït un ordre de prova aleatori que es va mantenir idèntic durant els tres dies de prova. El comportament es va registrar amb una càmera de vídeo (Logitech) i es va analitzar fora de línia. L'anàlisi del comportament es va realitzar a cegues pel genotip i el tractament. Les exploracions d'objectes es van definir com les èpoques en què els ratolins tenen el nas a 1 cm d'un objecte. El RI es va calcular de la següent manera:

Tasca de mostra automatitzada amb retard que no coincideix. Els ratolins van ser programats i entrenats amb aigua en un laberint en T continu per a una tasca de mostra retardada sense coincidència. Breument, cada assaig es va dividir en dues fases: mostra i prova. En la fase de mostra, es va bloquejar un braç i els ratolins es van forçar a explorar el braç oposat, on van rebre una recompensa de 50 µL d'aigua de sacarosa al 10%. Després de completar la fase de mostra, els ratolins van ser sotmesos a un retard (10 s) al compartiment inicial. Aleshores, durant la fase de prova, es van poder explorar ambdós braços, però només el braç oposat (no explorat) va ser esquer, de manera que els ratolins havien d'alternar ubicacions entre la mostra i les fases de prova. Els ratolins van ser sotmesos a 10 assaigs (mostra + prova) per dia, durant 10 dies consecutius, i la taxa d'èxit diària es va calcular com el nombre d'assaigs correctes dividit pel nombre total d'assaigs.

Anàlisis histològics post mortem

Després de completar les proves de comportament, els ratolins van ser anestesiats profundament amb una barreja de ketamina/xilazina/acepromazina (100, 16, 3 mg/kg, respectivament, injecció intraperitoneal) i es van perfondre transcardialment amb un 4% de paraformaldehid (PFA) en PBS. Els cervells es van extreure i es van fixar durant la nit en PFA a 4 graus i posteriorment es van rentar en PBS durant 24 hores addicionals a 4 graus. Els cervells i les seccions es van crioprotegir en una solució d'etilenglicol al 30%, glicerol al 30% i PBS al 40% fins que s'utilitzaven. A continuació, es va seccionar cada cervell a 50 µm mitjançant un vibratom: cada secció es va recollir seqüencialment en 4 tubs diferents d'1,5 ml per permetre anàlisis diferents. (localització d'elèctrodes, immunohistoquímica).

Immunohistologia. Utilitzant un tub de seccions cerebrals recollides (25% de mostreig) per a cada anàlisi, les seccions es van rentar durant 3 × 5 min en PBS per eliminar la solució crioprotectora. Les seccions es van incubar durant la nit amb PGT (0,45% gelatina i 0,25% Tritó en PBS) a 4 graus. A continuació, les rodanxes es van incubar amb anticossos primaris: o bé 1:200 cabratanti-colina-acetil -transferasa de Millipore o IgG1 anti-PVmonoclonal de ratolí 1:500 de Sigma-Aldrich en PGT a temperatura ambient durant 48 h o 2 h respectivament. Després de rentats de 10, 20 i 30 min, es van incubar seccions amb anticossos secundaris [1:2000 donkeyanti-goat acoblat amb Alexa 488 o 1:500 cabra anti-ratolí IgG1 acoblat a Alexa 488 (Life Technologies)] a PGT per a 45 min. Després de rentats de 10, 20 i 30 minuts en PBS, es van muntar seccions sobre portaobjectes i es van cobrir permanentment amb un mitjà de muntatge Fluoromount que contenia DAPI. En aquest estudi només es van incloure ratolins amb la col·locació d'implants confirmada histològicament. Per a GRINlenses, la superfície de la lent havia de ser<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Anàlisi de dades

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 a la pista lineal).

Seguiment automatitzat del comportament. Per extreure informació sobre la posició, la velocitat i la direcció del cap dels ratolins, hem utilitzat DeepLabCut70,71. Breument, vam entrenar un model per detectar les orelles, el nas, el cos i la base de la cua dels ratolins. La direcció del cap es va estimar utilitzant l'angle entre cada orella o el nas i el cos, depenent de la disponibilitat de mesura. Les dades d'ubicació es van interpolar a la freqüència de mostreig d'imatges de calci mitjançant interpolació lineal. La velocitat es va extreure calculant Δd/Δt on d és la distància i el temps t i, posteriorment, es va suavitzar el resultat aplicant un filtre gaussià amb sigma=33 ms per eliminar els artefactes de detecció. Els senyals de velocitat es van utilitzar per identificar períodes d'activitat locomotora i calcular el lloc, el temps i la modulació de distància de l'activitat específicament per a aquests períodes.

Anàlisi d'imatges de calci. L'anàlisi de dades d'imatge de calci es va realitzar mitjançant MATLAB 2020a i Python 3.8.4. Els enregistraments de vídeo es van analitzar mitjançant el pipeline Miniscope Analysis (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Breument, es va aplicar la correcció de moviment rígida (rotació i traducció) mitjançant NoRMCorre72, i els vídeos es van mostrejar espacialment (3 ×) abans de la concatenació. Les traces de calci es van extreure mitjançant CNMFe51 mitjançant els paràmetres següents: gSig=3 píxels (amplada del nucli gaussià), gSiz=20 píxels (diàmetre aproximat de la neurona), fons_model='anell', algorisme_espacial='hals', min_corr=0,8 (llindar de correlació de píxels mínim), min_PNR {{17 }} (llindar mínim de relació pic-soroll).

Les traces de calci en brut es van filtrar per eliminar les fluctuacions d'alta freqüència i es van binaritzar: breument, les neurones es van considerar actives quan l'amplitud normalitzada del senyal de calci superava les dues desviacions estàndard i la derivada de primer ordre estava per sobre de 0 (vegeu la ref. 52 per a més detalls). sobre la metodologia52). Per extreure les neurones ajustant-se a variables específiques, es van agrupar la ubicació, el temps i la distància (ubicació: contenidors de 3 cm; temps: contenidors d'1 s; distància: contenidors de 3 cm). A partir de senyals binaritzats, vam calcular la probabilitat marginal que les cèl·lules estiguin actives P Að Þ que utilitzem com a intermediari de l'activitat neuronal. Més important encara, deduïm la probabilitat d'activitat o la "probabilitat d'estar actiu donat l'estat de variable" PA j Si utilitzant variables agrupades:

on M és el nombre total d'estats de comportament possibles i P(Si∩Aj) és la probabilitat conjunta que l'animal estigui a la safata I simultàniament amb el nivell d'activitat j (0 o 1). Per avaluar la importància del valor MI obtingut, vam generar 1000 substituts barrejats mitjançant permutacions circulars aleatòries. Hem escollit permutacions circulars perquè eliminen la relació temporal entre l'activitat neuronal i el comportament, tot preservant l'estructura temporal dels transitoris de calci i, per tant, donen lloc a resultats més conservadors (a diferència de l'aleatorització completa de cada punt de dades, que augmenta el valor significatiu dels resultats). Com que els substituts barrejats no es distribuïen sistemàticament de manera normal, vam utilitzar un enfocament no paramètric on el valor p (pN) correspon al nombre de punts de dades de la distribució barrejada que és més gran que les dades reals per a cada bin, dividit pel nombre de permutacions52. 73.

Per determinar la modulació de les cèl·lules mitjançant estimulacions optogenètiques, vam utilitzar un enfocament similar, però vam calcular l'IM entre l'activitat neuronal i els senyals d'estimulació binaritzats (tractats així com un estat de comportament). A continuació, es va utilitzar el mateix procediment de barreja circular per extreure la significació estadística.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, es va generar un conjunt de dades d'entrenament utilitzant el 90% de les dades. El 10% restant de les dades es va utilitzar per fer proves. Es va calcular un error de descodificació utilitzant 50 substituts bootstrapped i un grup de 160 cel·les utilitzant punts de dades escollits aleatòriament amb substitució. Se suposa que cada neurona és independent una de l'altra, cosa que a la pràctica no és així i provoca majors errors de reconstrucció, però disminueix el temps de càlcul. La probabilitat posterior de la població es va derivar de la següent equació:

Seguiment de cel·les durant diversos dies. Les neurones es van fer un seguiment durant diversos dies mitjançant CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Breument, les petjades espacials es van alinear mitjançant una alineació rígida per corregir les rotacions i les traduccions. Després de l'alineació, vam considerar que els conjunts de cèl·lules candidates eren la mateixa neurona si la seva distància màxima era<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Anàlisi electrofisiològica. L'anàlisi de dades electrofisiològiques es va realitzar mitjançant MATLAB 2020a utilitzant tant el processament del senyal com la caixa d'eines wavelet. La convolució d'onades es va aplicar als senyals LFP mitjançant wavelets complexes de Morlet ('cmor1–1,5' a MATLAB) quan es requeria una precisió tant en el domini del temps com de la freqüència. La convolució de Fourier de la finestra mòbil (finestra de 2 s a la banda theta, finestra de 5 s a la banda gamma, passos de moviment de 10 ms) es va utilitzar quan la precisió del domini de freqüència es va privilegiar sobre la precisió del domini del temps (p. L'anàlisi de les densitats espectrals de potència es va realitzar quan els ratolins corrien a 5 cm s-1 o més, tret que es descrigui el contrari.

Força d'oscil·lació. El sistema operatiu es va calcular com la relació de la densitat espectral de potència acumulada al voltant de la freqüència d'oscil·lació màxima ± 1 Hz amb la potència de banda acumulada a la banda theta (4-12 Hz). Aquesta mètrica es converteix en 1 quan tota la densitat espectral de potència cau dins de la freqüència màxima d'oscil·lació (per exemple, 8 Hz si s'estimula a aquesta freqüència).

Detecció i anàlisi de SWRs. Per controlar els SWR, es va permetre als ratolins explorar lliurement un camp obert durant 1 0 min durant la gravació. Les estimulacions (revoltes o 8 Hz) es van realitzar amb un paradigma de 5 s ON, 5 s OFF. Només es van considerar períodes de tranquil·litat per a l'anàlisi. Per a això, vam calcular la relació de puntuació z de la potència theta/delta després de filtrar per a cada banda de freqüència, realitzant una transformada Hilbert i només vam considerar els períodes en què el valor resultant era inferior a 0. Per detectar els SWR, vam filtrar els senyals LFP entre 150 i 250. Banda de freqüència Hz i, posteriorment, puntuació z. Les ondulacions es van detectar mitjançant la funció findpeaks a MATLAB, amb els paràmetres següents: llindar=4 sd,minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0,03 s.

Referències

1. Colgin, LL Ritmes de la xarxa de l'hipocamp. Nat. Reverent Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Desinhibició de cèl·lules hipocampalpiramidals de rata per aferents GABAergic del septum. J. Physiol.500, 463–474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. i Somogyi, P. Objectius sinàptics de projeccions septals medials a l'hipocamp i escorces extrahipocampals del ratolí. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Propietats d'activació de neurones identificades anatòmicament al septe medial de rats restringits anestesiats i no anestesiats. J. Neurosci. 26, 9038–9046 (2006).

5. Scotty, F. et al. Propietats electrofisiològiques diferents de les neurones septohipocampals de rata glutamatèrgica, colinèrgica i GABAèrgica: noves implicacions per a la ritmicitat de l'hipocamp. J. Physiol. 551.927–943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. i Williams, S. Una xarxa funcional de neurones glutamatèrgiques a l'envà medial i l'àrea de la banda diagonal. J.Physiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. et al. Interneurones de parvalbúmina de l'activitat de la població de l'hipocamp amb freqüència theta. Neurona 86, 1277–1289 (2015).

8. Etter, G. et al. L'estimulació gamma optogenètica rescata les alteracions de la memòria en un model de ratolí amb malaltia d'Alzheimer. Nat. Commun. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. et al. Els circuits neuronals de l'hipocamp responen al ritme optogenètic de les freqüències theta generant freqüències d'oscil·lació accelerades. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. et al. Les oscil·lacions theta regulen la velocitat de locomoció mitjançant una via de l'hipocamp a l'envà lateral. Nat. Commun. 6.8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com