Xican Li 1,2,*,† ID , Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 i Dongfeng Chen 3,4

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com

1 Escola de Medicina Xinesa d'Herbes, Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou, Guangzhou 510006, Xina; xieyulu1900@163.com (YX); xiehongxh1@163.com (HX); 15622178307@163.com (QG); 15228738137@163.com (PX); pandiphd@163.com (YM)

2 Laboratori de recerca i desenvolupament innovador de TCM, Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou,

Guangzhou 510006, Xina

3 Escola de Ciències Mèdiques Bàsiques, Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou, Guangzhou 510006, Xina; ys1090992678@163.com (KL); chen888@gzucm.edu.cn (DC)

4 El Centre de Recerca de Medicina Integrativa Bàsica, Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou,

Guangzhou 510006, Xina

5 School of Basic Medical Science, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510007, Xina

6 Escola de Medicina de Zhongshan, Universitat Sun Yat-sen, Carretera Zhongshan núm. 74. 2, Guangzhou 510080, Xina; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Departament d'Histologia i Embriologia, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Xina;

† Aquests autors van contribuir per igual a aquest treball.

Rebut: 24 de gener de 2018; Acceptat: 20 de febrer de 2018; Publicat: 23 de febrer de 2018

Resum: L'estudi va intentar explorar el paper dels residus de sucre i els mecanismes dels fenòlicsfenilpropanoideantioxidants. Acteòsid, juntament amb el seu apiosid forsithoside B i ramnòsid

poliumòsid, es van investigar comparativament mitjançant diversos assaigs antioxidants. En tres assajos basats en la transferència d'electrons (ET) (FRAP, CUPRAC, PTIO·-rescavenging a pH 4,5), els nivells relatius d'antioxidants es van determinar aproximadament comacteòsid >forsitòsid B > poliumòsid. Aquest ordre també es va observar a

Assaig d'eliminació de PTIO· implicat en la transferència de H més a pH 7,4 i en tres assaigs d'eliminació de radicals implicats en múltiples vies, és a dir, ABTS més eliminació de ·, eliminació de DPPH· i eliminació de ·O2. En els espectres UV-vis, cadascun d'ells mostrava un desplaçament al vermell a 335 364 nm i dos pics febles (480 i 719 nm), quan es barrejaven amb Fe2 més; malgrat això,acteòsidva donar l'absorció més feble.

En l'anàlisi de cromatografia líquida d'ultra rendiment juntament amb l'anàlisi d'espectrometria de masses en tàndem en temps de vol de quadripols d'ionització amb electrospray (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS), no es va trobar cap pic de formació d'adductes de radicals (RAF). L'assaig MTT va revelar que el poliumòsid presentava la més alta viabilitat de les cèl·lules mare mesenquimals derivades de la medul·la òssia amb estrès oxidatiu. En conclusió,acteòsid, el forsitòsid B i el poliumòsid poden estar implicats en múltiples vies per exercir l'acció antioxidant, incloent ET, transferència de H més o quelant Fe2 més, però no RAF. La transferència d'ET i H més es pot veure obstaculitzada per fragments de ramnosil i apiosil; tanmateix, el potencial quelant Fe2 més es pot millorar amb dos residus de sucre (especialment el fragment ramnosil). L'efecte general dels fragments ramnosil i apiosil és millorar els efectes antioxidants o citoprotectors.

Paraules clau:acteòsid; apiosil; forsitòsid B;fenilpropanoideglicòsids; poliumòsid; ramnosil

cistanche té l'efecte d'antioxidació

1. Introducció

Recentment, acteòsid (verbascoside, figura 1), un fenòlicfenilpropanoideglucòsidque es produeix a la verva i altres plantes [1], es va trobar que millorava l'eficiència de la transferència nuclear de cèl·lules somàtiques canines (SCNT) durant el procés de clonació de gossos [2]. A més, l'acteòsid podria protegir les cèl·lules SH-SY5Y del neuroblastoma humà contra el dany induït per l'amiloide [3] i els fibroblasts de la pell humana contra el dany induït pels raigs X [4]. El seu apioside forsitoside B (figura 1) també es distribueix a les plantes [5] i s'ha observat que exerceix potents efectes neuroprotectors amb una finestra de temps terapèutica favorable [6]. Es creu que aquests efectes beneficiosos sobre cèl·lules i teixits estan associats a la protecció d'algunes biomolècules, com els lípids i l'ADN. De fet, s'ha demostrat que l'acteòsid i el seu anàleg cistanòsid F inhibeixen la peroxidació lipídica mitocondrial a les rates [7]. Se sap que la peroxidació lipídica és el resultat de l'estrès oxidatiu cel·lular i, en última instància, d'espècies reactives d'oxigen (ROS).

Figura 1. Les estructures (esquerra) i els models de bola i pal basats en la conformació preferent (dreta) de tres naturalsfenilpropanoideglicòsids(acteòsid, forsitòsid B i poliumòsid).

Des del punt de vista de la protecció de l'ADN, l'acteòsid i els seus derivats poden reparar ràpidament els radicals d'ADN, com ara la 2'-desoxiadenosina-5'-monofosfat (dAMP) i la 2'-desoxiguanosina-5'-monofosfat (dGMP) [ 8]. Aquests radicals desoxinucleòtids secundaris poden danyar més oxidativament les cèl·lules que condueixen a mutagènesi i carcinogènesi [9]. L'estudi biofísic va indicar que l'acteòsid i els seus derivats podrien acoblar-se a solcs menors de l'ADN i reparar ràpidament aquest dany oxidatiu de l'ADN [10]. El model de pal de bola basat en la conformació preferent proposa (Figura 1, dreta) que aquestes molècules són prolates i poden arribar fàcilment al bucle d'ADN i, per tant, són capaços de reparar ràpidament el dany dels radicals d'ADN [8].

Tanmateix, des del punt de vista de la bioquímica, la reparació es compleix essencialment mitjançant una via d'eliminació de ROS (és a dir, antioxidant). Com s'ha esmentat anteriorment, la generació de cations de radicals desoxinucleòtids és en última instància a partir de l'atac de ROS, inclosos els radicals lliures (per exemple, el radical ·OH [11]) i les molècules oxidants (per exemple, H2O2 [12]). Es creu que l'eliminació de ROS redueix eficaçment l'estat oxidatiu cel·lular [13,14] i millora la qualitat de les cèl·lules mare [12,15]. Per tant, cal estudiar la seva capacitat antioxidant i discutir més a fons els possibles mecanismes.

En aquest estudi, tres fenòlicsfenilpropanoideglicòsids(acteòsid, forsitoside B i poliumòsid) es van investigar comparativament mitjançant diversos assaigs antioxidants, inclòs el 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil{{6 }}assaig d'eliminació de radicals d'òxid (PTIO·), assaig de poder antioxidant reductor d'ions fèrrics (FRAP), assaig de capacitat antioxidant reductora cúprica (CUPRAC), 2,2→-azino-bis(3-etilbenzè-tiazolina{{13 }}assaig d'eliminació de radicals d'àcid sulfònic (ABTS més ·),

1, assaig de 1-difenil-2-picril-hidrazina (DPPH·) i assaig d'eliminació d'·O2, així com anàlisi d'espectres UV quelants Fe2 més. Posteriorment, es van determinar els seus productes de reacció amb DPPH· mitjançant cromatografia líquida d'ultra-performance acoblada a l'anàlisi d'espectrometria de masses en tàndem de temps de vol quadripol d'ionització amb electrospray (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS). Finalment, es va estimar el seu efecte citoprotector cap a les cèl·lules mare mesenquimals derivades de la medul·la òssia (bmMSCs) mitjançant el

Assaig de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil (MTT). Com es veu a la figura 1, la diferència entre els tres fenòlicsfenilpropanoideglicòsids(és a dir, acteòsid, forsitòside B i poliumòsid) és el tipus de glicòsid: forsythoside B és un apiósid de l'acteòside, mentre que el poliumòsid és un ramnòsid de l'acteòside. Així, aquest estudi comparatiu també ajuda a entendre els papers de l'apiosil i el ramnosilantioxidantefectes.

cistanche efecte blanquejador a la pell a l'antioxidació

2. Resultats

2.1. Assajos de reducció de metalls (FRAP i CUPRAC)

En l'estudi, hem realitzat dos assaigs reductors de metalls, és a dir, l'assaig FRAP i l'assaig CUPRAC. Com es mostra a la Supl. A la figura 1, l'acteòsid i els seus derivats van augmentar els percentatges relatius de FRAP (o Cu2 més poder reductor) a 0–10 g/L de manera dependent de la dosi. El seu ordre de nivells relatius de reducció de metalls va disminuir aproximadament en l'ordre d'acteòsid > forsitoside B > poliumòsid (taula 1).

Taula 1. Els valors IC50 de l'acteòsid, el forsitósid B i el poliumòsid en diversosantioxidantsassajos.

2.2. PTIO·-Assaig d'eliminació

El nostre laboratori ha desenvolupat recentment l'assaig PTIO·-scavenging [16]. Es pot utilitzar per avaluar els nivells d'antioxidants i explorar les vies antioxidants. Com es mostra a la Supl. 1, l'acteòsid i els seus derivats podrien eliminar amb èxit PTIO· a pH 4,5 i pH 7,4. Tanmateix, segons els valors d'IC50 de la taula 1, els seus nivells relatius d'eliminació de PTIO· al mateix valor de pH eren diferents entre si. A més, cada acteòsid i els seus derivats presentaven diferents nivells d'eliminació de PTIO· entre pH 4,5 i pH 7,4. En general, els nivells d'eliminació de PTIO· a 7,4 eren més alts que els de pH 4,5.

2.3. ABTS més ·-Scavenging i DPPH·-Scavenging Assays

L'abts plus ·-scavenging i DPPH·-scavenging ara s'utilitzen àmpliament per als estudis antioxidants de compostos o extractes purs. Com es veu a la Supl. 1, l'acteòsid i els seus derivats van augmentar depenent de la concentració els percentatges d'ABTS més ·-depuració o DPPH ·-depuració.

No obstant això, pel que fa als valors d'IC50 de la taula 1, els seus nivells relatius d'ABTS més ·-eliminació es van trobar en l'ordre d'acteòsid> forsithoside B> poliumòsid> Trolox. Un ordre similar també es podria observar en l'assaig d'eliminació de DPPH·.

2.4. UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS Anàlisi de Productes de Reacció DPPH·

El producte de reacció de DPPH· amb cadascun de tresfenilpropanoideglicòsidses va explorar mitjançant l'anàlisi UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. A l'anàlisi (Suppl. 2), cap dels tres glicòsids fenilpropanoides va produir el pic de producte RAF. En comparació, es va trobar que l'àcid cafeic produïa un producte dímer (m/z 359–360, Suppl. 2).

2.5. Anàlisi UV-Vis-Spectra de Fe2 més -Productes quelants

Atès que els espectres UV-vis poden caracteritzar complexos metàl·lics, l'estudi va utilitzar espectres UV-vis per analitzar la possible reacció quelant Fe2 més amb tresfenilpropanoide glicòsids. Com es mostra a la figura 2, cadascun d'ells podria produir un desplaçament batocròmic (335 nm ● 364 nm) en l'espectre UV. Mentrestant, cadascun d'ells podria proporcionar dos pics vis-espectres febles als espectres visibles (480 nm i 719 nm) i donar lloc a un aspecte verd clar. No obstant això, la intensitat màxima va ser en ordre descendent de poliumòsid> forsithoside B> acteòside.

2.6. Assaig d'autooxidació de pirogallol per a l'eliminació d'anions superòxids (·O2.).

El nostre laboratori va millorar l'assaig d'autooxidació del pirogallol el 2012 [17]. S'ha utilitzat per estimar el potencial d'eliminació de ·O2. en el present estudi. Com es veu a la Supl. 1, tots els acteòsids i els seus derivats podrien augmentar en funció de la dosi els percentatges d'eliminació d'O2. Tanmateix, la bioactivitat relativa va disminuir en l'ordre de poliumòsid> forsithoside B> acteòside, segons els valors IC50 de la taula 1.

2.7. Efecte citoprotector cap a bmMSCs amb estrès oxidatiu (assaig MTT)

Per avaluar els efectes citoprotectors de l'acteòsid i els seus derivats, vam realitzar un assaig MTT. En l'assaig, els bmMSC van ser danyats pel reactiu oxidatiu H2O2, els bmMSC danyats van ser tractats per acteòsid i els seus derivats. Els valors A490nm es van utilitzar per avaluar els efectes citoprotectors relatius. Tal com es veu a la taula 2, cada acteòsid i els seus derivats van augmentar depenent de la dosi els valors d'A490nm. Tanmateix, a la mateixa concentració, el poliumòsid va donar els valors més alts d'A490nm.

3. Discussió

Se sap que l'acció antioxidant dels compostos fenòlics naturals està implicada en la transferència d'electrons (ET) [18,19]. Així, alguns assajos de reducció de metalls basats en ET s'han utilitzat àmpliament per avaluar els nivells d'antioxidants de fenòlics, com els assajos FRAP i CUPRAC. Les directrius de l'assaig FRAP s'han de complir amb un pH inferior a 3,6. Un entorn tan àcid ha suprimit amb èxit la ionització de H més dels fenòlics; per tant, l'assaig FRAP es considera un simple procés ET [20, 21]. L'eficàcia de l'acteòsid i els seus derivats en l'assaig FRAP implica que, quan l'acteòside i els seus derivats actuen com aantioxidants, poden utilitzar la via ET per exercir la seva acció antioxidant.

A més, també hem realitzat un assaig CUPRAC en un tampó de pH 7,4. Com es veu a la Supl. A la figura 1, l'acteòsid i els seus derivats van augmentar depenent de la dosi els seus percentatges de potència reductora de Cu2 més, cosa que indica que podrien mantenir-se en potencial ET a pH fisiològic. No obstant això, els seus potencials ET van disminuir en l'ordre següent: acteòsid > forsitoside B > poliumòsid (taula 1). Aquesta dinàmica suggereix clarament que la part d'apiòsil del forsitòsid B i la part de ramnosil del poliumòsid van reduir el potencial ET.

cistancheés un inhibidor de la tirosinasa

Per provar la possibilitat que l'ET es produeixi durant els seus processos d'eliminació de radicals, es va introduir a l'estudi un radical lliure PTIO· centrat en l'oxigen. L'evidència de voltametria cíclica va revelar que l'eliminació de PTIO· per sota de pH 5.0 és una única reacció redox d'electrons [22]. L'observació que l'acteòsid i els seus derivats podrien eliminar de manera eficient el radical PTIO· a pH 4,5, suggereix la possibilitat d'ET durant els seus processos d'eliminació de radicals. Òbviament, aquesta troballa recolza encara més els resultats esmentats anteriorment dels assajos FRAP i CUPRAC, i els resultats anteriors que un electró donador (e) és una característica dels fenòlics.antioxidants[23]. A pH fisiològic de 7,4, però, l'assaig d'eliminació de PTIO no és només una via ET sinó que també inclou una via de transferència de protons (H més). Durant el procés, s'ha suggerit que PTIO accepti H plus dels fenòlics per produir el pic del producte ([PTIO-H] plus) [16]. Com que la transferència de H més sempre va acompanyada d'ET en mecanismes pas a pas o síncrons [24], el producte realista (o final) és una molècula [PTIO-H] [22]. L'eliminació de PTIO· a pH 7,4 (Suppl. 1) implica que l'acteòsid i els seus derivats també posseeixen un potencial de transferència H més. Els valors IC50 (taula 1) van indicar que el

Els potencials relatius de transferència de H més eren en ordre descendent d'acteòsid > forsitòsid B > poliumòsid. Clarament, els fragments d'apiosil i ramnosil també van debilitar el potencial de transferència de H plus durant el procés antioxidant.

Com s'ha comentat anteriorment, durant el procés antioxidant dels fenòlics, ET normalment s'acompanya de la transferència de protons (H més) per formar diversos mecanismes antioxidants [24], com ara la transferència d'àtoms d'hidrogen (HAT) [23,25–27], electrons seqüencials. - transferència de protons (SEPT) [26,27], transferència seqüencial d'electrons amb pèrdua de protons (SPLET) [26] i transferència d'electrons acoblats a protons (PCET) [24–26,28].

Per exemple, l'ABTS més l'eliminació de ·, una reacció dominada per la transferència d'un sol electró (SET) [29], també s'ha demostrat que es veu afectada pels nivells d'H plus recentment [30]. L'ABTS més l'eliminació de · és, per tant, un assaig antioxidant basat en diverses vies [21,31]. El fet que l'acteòsid i els seus derivats puguin eliminar els radicals ABTS més · indica que la seva acció antioxidant també pot estar mediada per vies múltiples. Aquesta hipòtesi es confirma encara més per l'evidència de l'assaig d'eliminació de DPPH·, una reacció que inclou diverses vies HAT, ET, SEPT i PCET [26, 32]. No obstant això, l'anàlisi quantitativa basada en els valors IC50 (taula 1) va revelar que en aspectes d'ABTS basats en vies múltiples més d'eliminació de · i d'eliminació de DPPH ·, l'acteòsid era superior al seu apioside forsythoside B i ramnòsid poliumòsid. Així, es pot deduir que els fragments d'apiosil i ramnosil dificulten els potencials multivia (especialment la transferència d'ET i H més) durant el procés d'eliminació de radicals lliures. Tal com han assenyalat els autors i altres [14, 26], durant el procés antioxidant, també es pot produir una reacció RAF. Per comprovar la possibilitat de la RAF, però, tresfenilpropanoideglicòsidsjuntament amb l'àcid cafeic es van estudiar mitjançant l'anàlisi UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Es va trobar que l'àcid cafeic donava un producte dímer, mentre que tresfenilpropanoideglicòsidsno va produir cap pic de producte RAF.

Aquesta troballa suggereix clarament que tresfenilpropanoideglicòsidsno poden passar per la via RAF per exercir la seva acció antioxidant. Com que tres glicòsids fenilpropanoides es poden considerar com els èsters de l'àcid cafeic (figura 1), aquesta diferència entre l'àcid cafeic i els èsters d'àcid cafeic també indica que una gran part pot dificultar la generació de RAF.

En conjunt, des d'un aspecte d'eliminació de radicals lliures, l'acteòsid i els seus derivats poden experimentar múltiples vies per exercir la seva acció antioxidant. Aquestes vies antioxidants almenys estan implicades en la transferència d'ET i H més (però no RAF). Les nostres troballes estan recolzades en part per l'estudi teòric que l'acteòsid podria exercir l'acció antioxidant a través de la via SPLET. En el procés, l'acteòsid podria desprotonar-se primer (transferència de H més) per produir anió. Es creu que la desprotonació es produeix a les fraccions catecols amb una acidesa feble. Posteriorment, l'anió va donar electrons per donar lloc a la forma de radical fenoxi [33]. Tanmateix, els radicals fenoxi amb conjugació pu són estables fins a cert punt. Per descomptat, en aquest sentit, calen més treballs experimentals en el futur.

Val la pena esmentar que l'estrès oxidatiu cel·lular també pot originar-se a partir de metalls de transició (especialment Fe2 plus). L'ió Fe2 més, però, pot transformar la molècula H2O2 en radicals ·OH més nocius mitjançant la reacció de Fenton (Fe2 més H2O2 ● Fe3 més més ·OH més OH.). Per tant, l'atenuació dels nivells de Fe2 més pot inhibir eficaçment els radicals ·OH per alliberar l'estrès oxidatiu cel·lular. De fet, el ferro quelat per fenòlics naturalsantioxidantsara s'ha convertit en una teràpia eficaç per a algunes malalties d'estrès oxidatiu [34,35].

En el present estudi, l'acteòsid i els seus derivats es van suggerir com a quelants Fe2 més efectius pels canvis en l'espectroscòpia i els colors de la solució (figura 2). No obstant això, l'acteòsid és inferior als dos glucòsids en el fet quelant Fe2 plus i el forsitoside B amb un fragment apiosil és inferior al poliumòsid amb un fragment ramnosil. A partir de la comparació de les seves conformacions preferents (figura 1, dreta), es proposa que la fracció apiosil (o ramnosil) pot ajudar al lligand principal (fenilpropanoidegrup) en quelant Fe2 plus. Aquest efecte sinèrgic, sens dubte, enforteix la capacitat de quelat Fe2 plus i augmenta els pics UV-vis. Tanmateix, el ramnosil és més eficaç que l'apiosil en la seva capacitat de quelat Fe2 més. La diferència es pot atribuir al fet que el ramnosil es presenta en una forma hexocíclica (és a dir,/-L-rhamnopiranosil), mentre que l'apiosil es troba en una forma pentacíclica (és a dir, -D-apiofuransil). Se sap que una forma hexocíclica és més gran i més estable. Per tant, el ramnosil hexocíclic és més eficaç en comparació amb l'apiosil pentacíclic en la seva capacitat de quelat Fe2 més.

Per provar si l'acteòsid i els seus derivats poden eliminar ROS, vam realitzar un assaig d'autooxidació de pirogallol. Com es veu a la Supl. 1, tots podrien eliminar eficaçment el ·O2. radical, un ROS típic que es produeix a les cèl·lules. No obstant això, la bioactivitat relativa va disminuir en l'ordre poliumòsid> forsithoside B> acteòside. Aquest ordre també és paral·lel al dels efectes citoprotectors (taula 2). Aquesta troballa indica que l'efecte general de la part de ramnosil o la part d'apiosil és millorar els efectes citoprotectors o d'eliminació de ROS.

cistanchetenir elfunciódeblanqueigpell

4. Materials i Mètodes

4.1. Química i Animals

L'acteòsid (número CAS: 61276-17-3, 97 per cent), el forsitòsid B (número CAS: 81525-13-5, 97 per cent) es van obtenir de BioBioPha (Kunming, Xina, Suppl. 3). El nostre equip va aïllar poliumosida (número CAS: 94079-81-9, 97 per cent) de l'herba tradicional xinesa Callicarpa pei HT Chang (Suppl. 3). L'àcid DPPH·, (o)-6-hidroxil{-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílic (Trolox), 2,9-dimetil{{ 16}},10-fenantrolina (neocuproïna), 2,4,6-tripiridiltriazina (TPTZ) i pirogallol es van comprar a Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Xangai, Xina). (NH4)2ABTS [2,2→-azinobis (3-etilbenzè-tiazolina-6-sal diamoni de l'àcid sulfònic)] es va obtenir d'Amresco Chemical Co. (Solon, OH, EUA). El radical PTIO· es va comprar a TCI Development Co., Ltd. (Xangai, Xina). L'àcid cafeic es va comprar a l'Institut Nacional per al Control de Productes Farmacèutics i Biològics (Beijing, Xina). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum boví fetal (FBS) i la tripsina es van comprar a Gibco (Grand Island, NY, EUA). El kit d'assaig d'annexina V/iodur de propidi (PI) es va comprar a Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Tots els altres reactius eren de grau analític.

Es van obtenir rates Sprague-Dawley (SD) de 4 setmanes d'edat del Centre d'Animals de la Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou. El protocol d'aquest experiment es va realitzar sota la supervisió del Comitè Institucional d'Ètica Animal de la Universitat de Xinès de Guangzhou (número d'aprovació 20170306A).

4.2. Assajos de reducció de metalls (FRAP i CUPRAC)

Els assaigs de reducció de metalls inclouen l'assaig de potència reductora de Fe3 plus i l'assaig de potència reductora de Cu2 més. L'assaig de reducció de Fe3 plus va ser establert per Benzie i Strain i s'anomena formalment FRAP [20]. El protocol experimental d'aquest assaig es va descriure en un informe anterior [9]. Breument, el reactiu FRAP es va preparar recentment barrejant 10 mM de TPTZ, 20 mM de FeCl3 i un tampó d'acetat 0,25 M en una proporció d'1:1:10 a pH 3,6. La mostra de prova (x=4-20 L, 0,05 mg/mL) es va afegir a (20, x) L d'etanol al 95 per cent seguit de 80 L de reactiu FRAP. Després d'una incubació de 30-min a temperatura ambient, es va mesurar l'absorbància a 595 nm mitjançant un lector de microplaques (Multiskan FC, Thermo Scientific, Xangai, Xina). El poder reductor relatiu de la mostra es va calcular mitjançant la fórmula següent:

on Amax era l'absorbància màxima de la barreja de reacció amb la mostra, i Amin és l'absorbància mínima de la prova. A és l'absorbància de la mostra.

El poder reductor de Cu2 més també pot caracteritzar el nivell d'antioxidants i, per tant, s'anomena CUPRAC. Aquest assaig es va dur a terme segons un mètode publicat anteriorment [36]. Breument, 12 L de solució aquosa de CuSO4 (10 mmol/L), 12 L de solució etanòlica de neocuproïna (7,5 mmol/L) i (75, x) L de solució tampó CH3COONH4 ({0). 1 mol/L, pH 7,5) es van afegir als pous amb diferents volums de mostra (0,05 mg/mL, 4-20 L). L'absorbància a 450 nm després de 30 min es va mesurar mitjançant el lector de microplaques esmentat anteriorment. La potència relativa de CUPRAC es va calcular mitjançant la fórmula de FRAP. Amax era l'absorbància màxima de la mescla de reacció amb el sample, i Amin és l'absorbància mínima de la prova. A és l'absorbància de la mostra.

cistanchetenen els efectes de blanquejar la pell

Si us plau, feu clic aquí per a la part 2