Part 1: Els glucòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa indueixen l'apoptosi de les cèl·lules de carcinoma hepatocel·lular i milloren l'efecte antitumoral
Mar 25, 2022
Contacte: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, i Jinyao Li, PhD1
Resum
Cistanche tubulosa és un tipus de medicina herbal xinesa i exerceix diverses funcions biològiques. Estudis anteriors ho han demostratGlucòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa(CTPG) presenten efectes antitumorals sobre una varietat de cèl·lules tumorals. Tanmateix, els efectes antitumorals del CTPG sobre les cèl·lules de carcinoma hepatocel·lular (HCC) HepG2 i BEL-7404 encara són difícils de fer. El nostre estudi va demostrar que CTPG va inhibir significativament el creixement de les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 mitjançant la inducció de l'aturada del cicle cel·lular i l'apoptosi, que es va associar amb l'activació de les vies MAPK caracteritzades per la fosforilació regulada de p38, JNK, i ERK1/2 i via dependent dels mitocondris caracteritzada per la reducció del potencial de membrana mitocondrial. L'alliberament del citocrom c i la divisió de la caspasa-3, -7, -9 i PARP es van augmentar posteriorment amb el tractament CTPG. A més, CTPG va suprimir significativament la migració d'HepG2 reduint els nivells de metaloproteinasa de la matriu-2 i els factors de creixement endotelial vascular. Curiosament, CTPG no només va millorar la proliferació d'esplenòcits, sinó que també va reduir l'apoptosi dels esplenòcits induïda pel cisplatí. En el model de ratolí tumoral H22, CTPG combinat amb cisplatí va inhibir encara més el creixement de les cèl·lules H22 i va reduir els efectes secundaris del cisplatí. En conjunt, CTPG va inhibir el creixement de l'HCC mitjançant l'efecte antitumoral directe i l'efecte indirecte de millora immunològic, i va millorar l'eficàcia antitumoral del cisplatí.
Paraules clau Glucòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa, apoptosi, via MAPK, via dependent dels mitocondris, cisplatí, millora immunològica
Cistanche té l'efecte antitumoral.
Feu clic a productes Cistanche i Cistanches
Introducció
Es va preveure que el càncer de fetge fos el sisè càncer més diagnosticat i la quarta causa de mort per càncer a tot el món el 2018, amb uns 841 000 casos nous i 782.000 morts anuals al sud-est asiàtic (Mongòlia, Cambodja i Vietnam). .1 A la Xina, el càncer de fetge va ser la tercera causa de mort relacionada amb el càncer el 2015.2 Més del 90 per cent dels càncers de fetge primaris són carcinomes hepatocel·lulars (HCC) a tot el món. Actualment, l'hepatectomia, el trasplantament hepàtic i l'ablació percutània són els principals mètodes per al tractament de l'HCC. Malauradament, aquests tractaments són efectius per al 30% dels pacients diagnosticats de càncer de fetge precoç, mentre que els pacients diagnosticats de càncer de fetge avançat (que representen un 40%) han de confiar en un tractament pal·liatiu per allargar el seu temps de supervivència.3,4 Sorafenib en combinació amb hepàtics. La quimioembòlia arterial és una teràpia pal·liativa important i comuna per a la majoria dels pacients amb HCC avançat a la regió d'Àsia-Pacífic5. producció i promou l'apoptosi de les cèl·lules tumorals. El sorafenib allarga significativament el temps de supervivència del pacient entre 3 i 5 mesos, però té efectes secundaris greus i està estretament relacionat amb l'aparició de resistència als medicaments.6 Per tant, és urgent desenvolupar nous fàrmacs o estratègies per al CHC.
La medicina tradicional xinesa (MTC) sola o en combinació amb altres estratègies s'ha utilitzat per tractar l'HCC i ha mostrat beneficis clínics, com ara un temps de supervivència prolongat, una millor qualitat de vida, una reducció de reaccions adverses, etc.7,8.Cistancheés un TCM que conté glicòsids feniletanoides (PhG), iridoides, lignina i polisacàrids que té diverses funcions biològiques, com ara funcions antioxidació, antiinflamació, antienvelliment, millora de la memòria i millora immune.9 Els PhG s'han considerat com a els principals components actius de Cistanche i tenen múltiples funcions, com ara antioxidació, antiinflamació, anti-apoptosi, hepatoprotecció i neuroprotecció.10-12 El nostre grup havia informat queCistancheglicòsids feniletanoides tubulosa(CTPG) podria inhibir el creixement de cèl·lules de melanoma B16-F10, cèl·lules Eca-109 de carcinoma d'esòfag i cèl·lules HCC H22 mitjançant vies de senyalització extrínseques o intrínseques in vitro o in vivo; a més, el CTPG va tenir un efecte immunoestimulador.13-15
En aquest estudi, hem investigat l'efecte antitumoral i el mecanisme de CTPG a les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 in vitro, hem analitzat la funció immunomoduladora de CTPG in vitro i in vivo i hem avaluat més l'efecte terapèutic de CTPG combinat amb la quimioteràpia. fàrmac cisplatí en ratolins tumorals HCC H22 in vivo. Vam trobar que CTPG podria inhibir el creixement de cèl·lules HepG2 i BEL-7404 mitjançant l'apoptosi dependent dels mitocondris i la via de senyalització MAPK. CTPG va inhibir significativament la migració de cèl·lules HepG2 reduint els nivells de metaloproteinasa de la matriu -2 (MMP-2) i el factor de creixement endotelial vascular (VEGF). A més, el CTPG va promoure la proliferació i l'activació de cèl·lules immunitàries i va millorar la immunitat dels ratolins. És important destacar que CTPG combinat amb cisplatí pot inhibir encara més el creixement de cèl·lules H22 in vivo i reduir els efectes secundaris del cisplatí.
Cistanche millora la immunitat.
Materials i mètodes
Animals
Es van comprar BALB/c mascles d'entre 6 i 8 setmanes d'edat, els ratolins Kunming i les femelles C57BL/6 al Centre de Laboratori d'Animals de la Universitat Mèdica de Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Xina) i es van allotjar en una instal·lació d'animals de la Universitat de Xinjiang amb temperatura ambient. (RT) de 25±3 graus, i un període clar-fosc de 12/12 hores.
Línies cel·lulars i cultiu cel·lular
Les cèl·lules H22 murines es van comprar a Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Xina) i les cèl·lules humanes HCC HepG2 i BEL-7404 es van obtenir del laboratori clau de recursos biològics i enginyeria genètica de Xinjiang, Universitat de Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Xina) i cultivat en medi RPMI 1640 (Gibco, EUA) o medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) (Gibco) que conté un 10% de sèrum fetal boví inactivat per calor (MRC, Xina), 1% L- glutamina (100 mM), 100 U/mL de penicil·lina i 100 ug/mL d'estreptomicina a 37 graus en una atmosfera humidificada d'un 5% de CO2.
Cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC)
Els principals compostos de CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Xangai, Xina) es van qualificar i quantificar per HPLC com s'ha informat anteriorment.13 Es va utilitzar una columna ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5 μm) i la fase mòbil consistia en una solució d'àcid fòrmic al 0,2% i metanol amb un gradient del 23% al 31%. Es va injectar una mostra de 10 μL i es va detectar a 330 nm. Els estàndards d'echinacòsid i acteòsid (Yuanye, Xangai, Xina) es van utilitzar per analitzar els components de CTPG.
equinacòsid
Anàlisi de la viabilitat cel·lular
Els efectes antitumorals de CTPG sobre les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 es van avaluar mitjançant MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-bromur de H-tetrazoli). Les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 es van xapar en plaques 96-pous (5 × 104 cèl·lules/pou) i es van tractar amb 0, 2{00, 400 i 600 ug/mL CTPG durant 24 i 48 hores, respectivament, després de 24 hores d'incubació a 37 graus. Es va utilitzar uns 35 ug/ml de cisplatí (Yuanye) com a control positiu. A continuació, es van afegir 100 μL de MTT (0, 5 mg/ml, diluït en medi sense medi FBS) a cada pou i es van cultivar durant 3 hores a 37 graus i 5 per cent de CO2. Després de la incubació, les plaques es van centrifugar a 1200 rpm durant 7 minuts, es va eliminar el medi i es van afegir 200 ug/mL de DMSO a cada pou per dissoldre els cristalls de formazà formats. Els valors de OD490 es van mesurar amb un 96-lector de microplaques de pou (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). Per avaluar els efectes del CTPG sobre els esplenòcits, les cèl·lules es van aïllar de ratolins C57BL/6 i es van placar en plaques 96-pous a una densitat d'1 × 105 cèl·lules/pou. Els esplenòcits es van tractar amb 0, 200, 400 i 600 ug/ml durant 24, 48 i 72 hores, respectivament. La viabilitat cel·lular es va calcular amb la fórmula següent: viabilitat cel·lular (per cent)=(tractat amb OD/no tractat) × 100 per cent .
Detecció de Ki-67
La detecció de Ki{{0}} es va fer segons el nostre estudi anterior.16 En resum, les cèl·lules BEL-7404 es van tractar amb diferents concentracions (0, 200, 400 i 600 ug/mL) de CTPG o cisplatí (35 ug/ml). Després de 24 hores, les cèl·lules es van recollir i rentar amb PBS, després es van fixar i permeabilitzar amb Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, EUA) segons les instruccions del fabricant. La tinció intracel·lular es va realitzar mitjançant anticossos Ki-67 conjugats amb FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) durant 15 minuts a RT. Les mostres es van analitzar mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur, CA, EUA).
Anàlisi de l'apoptosi cel·lular i del cicle cel·lular
Les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 es van sembrar a una densitat de 2,5 × 105 cèl·lules/plat i es van incubar a 37 graus durant la nit. Les cèl·lules es van tripsinitzar i es van recollir per centrifugació després del tractament amb diverses concentracions de CTPG o es van tractar prèviament amb inhibidor de caspasa (Z-VAD-FMK) o inhibidor de caspasa -3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Xina) durant 2 hores abans. Tractament CTPG. Després de 24 hores, es va detectar l'apoptosi mitjançant citometria de flux. En resum, les cèl·lules recollides es van rentar amb PBS fred (Gibco) i es van tornar a suspendre en un tampó d'unió a l'annexina amb 2, 5 μL d'Annexina V-FITC i 5 μL de solució de tinció de PI-PE (Solarbio, Pequín, Xina) i després les cèl·lules es van incubar a RT. a les fosques durant 15 minuts. Per a l'anàlisi de la distribució del cicle cel·lular, les cèl·lules es van recollir després del tractament amb CTPG i es van fixar en etanol fred al 70 per cent a 4 graus durant 30 minuts. Les cèl·lules es van tacar amb PI (BD Biosciences) a la foscor durant 30 minuts. Les mostres es van analitzar mitjançant un citòmetre de flux (BD FACSCalibur). Es van detectar nivells d'expressió d'apoptosi cel·lular i proteïnes relacionades amb el cicle mitjançant Western blot.
Western Blot
Western blot es va fer segons el nostre estudi anterior. 17HCC es van tractar amb CTPG durant 24 hores. Després de rentar dues vegades amb PBS fred amb gel, es van recollir totes les cèl·lules adherents i flotants i es van lisar al tampó de lisi RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) durant 20minuts sobre gel. Després de la centrifugació a 12000 rpm 4 graus durant 10 minuts, es va determinar la concentració de proteïnes mitjançant un kit d'assaig d'àcid bicinchonínic (Thermo Fisher Scientific, EUA) segons les instruccions del fabricant. La mateixa concentració de proteïnes es va separar amb un 12% de SDS-PAGE i es va transferir a membranes de PVDF. Després de rentar-se amb tampó PBST (PBS amb un 0,05% de Tween-20), les membranes es van bloquejar amb un 5% de llet sense greix a 37 graus durant 1 hora i després es van incubar amb els anticossos primaris (Cell Signaling Technology, MA, EUA) a les dilucions adequades durant la nit a 4 graus. Després de rentar-se 3 vegades amb PBST, la membrana es va incubar amb els corresponents anticossos secundaris conjugats amb HRP (eBioscience) durant 2 hores a 37 graus. Les proteïnes diana es van detectar mitjançant un kit d'assaig ECL (Beyotime). Les dades d'escaneig en escala de grisos es van obtenir mitjançant Image J.
Anàlisi del potencial de la membrana mitocondrial (Δψm)
Δψm es va determinar mitjançant un colorant JC-1 permeable a la membrana (Beyotime). Breument, les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 200, 400 i 600ug/mL) durant 24 hores. Totes les cèl·lules es van recollir i es van rentar amb tampó de rentat JC-1. Les cèl·lules es van tacar amb la sonda fluorescent JC-1 segons les instruccions del fabricant durant 20 minuts a temperatura ambiente. Després de rentar-se dues vegades amb PBS, es van analitzar totes les mostres mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 Tinció
La tinció de Hoechst 33342 es va fer segons el nostre estudi anterior.16 Els canvis morfològics dels nuclis es van examinar mitjançant el colorant d'unió a l'ADN permeable a la membrana Hoechst 33342 (Beyotime). Breument, les cèl·lules es van inocular en una placa de 6-pou a la concentració d'1 × 105 cèl·lules/pou en medi de 2 ml. En arribar al 70% al 80% de confluència, les cèl·lules es van tractar amb 200, 400 i 600 ug/ml de CTPG o cisplatí durant 24 hores. Les cèl·lules es van rentar amb PBS i es van fixar amb un 4% de paraformaldehid fred a 4 graus durant 10 minuts. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van tacar amb Hoechst 33342 a 4 graus durant 10 minuts. Les mostres es van observar mitjançant un microscopi invertit de fluorescència (Nikon Eclipse Ti-E, Japó).
extracte de cistanche
Assaig de migració
La migració de cèl·lules HCC es va detectar mitjançant l'assaig de cicatrització de ferides. En resum, les cèl·lules HepG2 (2 × 104/pou) es van sembrar en una placa 24-pou. Després d'arribar al 80 per cent de confluència, el centre de cada pou es va ratllar una vegada amb una punta de pipeta de 20 μL. Després del rentat amb PBS, les cèl·lules es van tractar amb cisplatí (35 ug/mL) o diferents concentracions (0, 200, 400 i 600 ug/mL) de CTPG a 37 graus. Després de 24 hores, es van prendre imatges de cada mostra sota un microscopi (Nikon Eclipse Ti-E). Les distàncies mitjanes de la migració cel·lular es van analitzar per la imatge J. El percentatge de cicatrització de ferides es va calcular mitjançant l'equació: cicatrització de ferides (per cent)=(1-àrea de rascada al punt de temps indicat/àrea de rascada a 0 hores) × 100 per cent. Els nivells d'expressió de proteïnes relacionades amb la migració cel·lular MMP-2 i VEGF es van detectar mitjançant Western blot.
Proliferació i apoptosi dels esplenòcits
Per a l'anàlisi de la proliferació, es van aïllar esplenòcits de 3 ratolins C57BL/6 i es van tacar amb CFSE (eBioscience). Les cèl·lules marcades amb CFSE es van inocular en plaques de 24-pous a una densitat de 2 × 106 cèl·lules en 1 ml de medi per pou i es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (200, 400 i 600 ug/mL) o es van combinar amb 35 ug. /mL de cisplatí durant 72 hores. L'anàlisi de citometria de flux es va realitzar després de la tinció amb CD3-APC i CD19-PE (BD Biosciences). Per a l'anàlisi de l'apoptosi, els esplenòcits es van inocular en plaques de 24-pous a una densitat de 2 × 106 cèl·lules en 1 ml de medi per pou i es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (200, 400 i 600 ug/mL) o es van combinar amb cisplatina durant 24 hores. L'anàlisi de citometria de flux es va realitzar després de la tinció amb 2, 5 μl d'annexina V-FITC i 5 μl de solució PI-PE.
Avaluació de la Seguretat i Activitats Immunoestimuladores de CTPG In Vivo
Per avaluar les activitats immunoestimuladores in vivo de CTPG, els ratolins Kunming mascles de 6 a 8 setmanes es van dividir aleatòriament en 7 grups (5 ratolins/grup). La injecció subcutània (sc, 200, 400 mg/kg), la injecció intraperitoneal (ip, 200, 400 mg/kg) i l'administració intragàstrica (ig, 200, 400 mg/kg) es van aplicar cada 2 dies per un total de 7 vegades. , mentre que el grup control no va rebre cap tractament. Els ratolins han pesat cada dos dies i l'estat dels ratolins es va observar cada dia. Després del tractament amb CTPG, es van separar i pesar els òrgans dels ratolins. Els índexs d'òrgans es van calcular segons la fórmula: índex d'òrgans=pes de l'òrgan (mg)/pes corporal (g). Els esplenòcits es van recollir, es van comptar i es van tacar amb anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC o anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Les mostres es van detectar mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur).
Eficàcia antitumoral de CTPG combinat amb cisplatina en ratolins portadors de tumors H22 Al voltant de ratolins mascles BALB / c d'entre 6 i 8 setmanes d'edat es van injectar per via subcutània amb cèl·lules H22 (1.0 × 106 per ratolí en 100 μL de PBS). Quan els volums del tumor van assolir aproximadament 60 mm3, els ratolins portadors de tumors es van dividir aleatòriament en 4 grups (6 ratolins/grup) i es van tractar amb cisplatina (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatina (4 mg/kg) més CTPG ( 400 mg/kg), o sense tractament (grup control), respectivament. Els ratolins tumorals es van injectar intraperitonealment amb CTPG els dies 5è, 7è, 9è, 11è i 13è, respectivament. El cisplatí es va injectar per via intravenosa els dies 7 i 11. El volum del tumor i el pes corporal es van mesurar cada dos dies. El volum del tumor es va calcular de la següent manera: volum del tumor (V)=a × b2/2, en el qual a i b representen el diàmetre més llarg i el més curt d'un tumor mesurat amb un calibre vernier, respectivament. El 20è dia es van aïllar i ponderar òrgans i tumors. Els esplenòcits es van recollir, es van comptar i es van tacar amb anti-CD3-APC i anti-CD19-PE o anti-CD4-FITC i anti-CD8-APC o anti-CD11b-PE i anti-Gr-1-APC o anti-CD4-FITC, anti-CD{25-APC i anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Posteriorment, es van analitzar les freqüències i el nombre de cèl·lules mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur).
Cistanche millora l'efecte antitumoral i millora la immunitat.
Per a més informació, feu clic a la imatge.
Anàlisi estadística
Totes les dades es van expressar com a mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM). L'anàlisi estadística es va dur a terme mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional o bidireccional (ANOVA) mitjançant el programari Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">
