Part 2: Els glucòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa indueixen l'apoptosi de les cèl·lules de carcinoma hepatocel·lular i milloren l'efecte antitumoral
Mar 25, 2022
Contacte:ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, i Jinyao Li, PhD1
FEU CLIC AQUÍ PER APART 1
Resultats
CTPG va inhibir la proliferació de cèl·lules HCC in vitro
Els components de CTPG es van qualificar i quantificar per HPLC mitjançant estàndards d'equinacòsid i acteòsid (figura suplementària 1A), que eren els components principals dels glucòsids feniletanoides deCistanche.18 Segons els temps de retenció màxims i les àrees màximes, el CTPG contenia un 28 per cent d'echinacòsid i un 9,9 per cent d'acteòsid. A més, el contingut de polisacàrids en CTPG va ser del 34,8 per cent pel mètode d'àcid fenol-sulfúric.19 L'assaig MTT va demostrar que CTPG va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules BEL-7404 i HepG2 de manera dependent de la dosi i del temps ( Figura 1A). De manera consistent, la proliferació de cèl·lules BEL-7404 es va inhibir significativament pel tractament CTPG, que es va analitzar mitjançant la tinció de Ki-67 (figura 1B). L'efecte del CTPG sobre la proliferació d'esplenòcits in vitro també es va analitzar mitjançant un assaig MTT. Vam observar que CTPG va millorar la proliferació d'esplenòcits de manera dependent de la dosi (figura 1C).
La via de senyalització de la proteïna quinasa activada per mitògens (MAPK) té un paper fonamental en la supervivència, la diferenciació i la resistència als fàrmacs de les cèl·lules canceroses humanes.20 Per investigar si la via de senyalització MAPK va estar implicada en l'efecte inhibidor del CTPG sobre la proliferació. de cèl·lules HCC, es van analitzar els nivells de fosforilació de diverses proteïnes de la via del senyal MAPK a les cèl·lules HepG2 després del tractament amb CTPG a diferents concentracions i diferents moments. La fosforilació de JNK (P-JNK) i p38 (P-p38) es va millorar en funció de la dosi mitjançant el tractament CTPG. La fosforilació d'ERK (P-ERK) es va regular a la baixa amb un tractament CTPG de 200 i 400 ug/mL, mentre que P-ERK es va regular amb un tractament CTPG de 600 ug/mL (figura 1D). A més, els nivells de P-JNK, P-p38 i P-ERK estaven regulats de manera que depenent del temps (figura 1D). Aquests resultats van suggerir que CTPG podria inhibir la proliferació de cèl·lules HCC a través de la via de senyalització MAPK.
Figura 1. L'efecte del CTPG en la proliferació de cèl·lules i esplenòcits HCC.
Detenció del cicle cel·lular de HCC induïda per CTPG a la fase S
Vam analitzar més si CTPG va inhibir la proliferació cel·lular de HCC mitjançant la inducció de l'aturada del cicle cel·lular. Després del tractament amb CTPG, es va observar una acumulació de cèl·lules BEL-7404 a la fase S de manera dependent de la dosi. De la mateixa manera, CTPG també va induir l'aturada del cicle cel·lular HepG2 a la fase S i les freqüències van augmentar del 40, 66 per cent en el grup control al 61, 90 per cent en el grup tractat amb CTPG de 600 ug/mL (figura 2A). Les ciclines i les quinases dependents de ciclina (CDKs) tenen un paper important en el control i desenvolupament de la divisió cel·lular,21 de les quals es van associar amb la fase G2/M.22 El nivell d'expressió de la ciclina D1 es va reduir depenent de la dosi pel tractament amb CTPG, però va promoure G1 a Progressió de la fase S. També es van reduir els nivells d'expressió de Ciclina B1, CDK1 i CDK2; aquestes proteïnes es van associar amb la fase G2/M (figura 2B). Aquests resultats van suggerir que CTPG va suprimir la proliferació cel·lular de HCC induint l'aturada del cicle cel·lular.
Via d'apoptosi depenent de mitocondris activada per CTPG a les cèl·lules HCC
També vam detectar si CTPG va desencadenar l'apoptosi a les cèl·lules HCC i vam trobar que CTPG induïa l'apoptosi a les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 de manera dependent de la dosi (figura 3A). A més, els nivells d'expressió de Bax i Bcl-2 van augmentar i disminuir pel tractament amb CTPG de manera dependent de la dosi, respectivament (figura 3B). L'apoptosi de les cèl·lules HepG2 es va determinar encara més mitjançant la tinció de Hoechst 33342 després del tractament amb CTPG durant 24 hores. La morfologia nuclear es va observar amb un microscopi de fluorescència invertida. Tal com es mostra a la figura 3C, les cèl·lules HepG2 de control es van tacar de manera homogènia mentre que les cèl·lules HepG2 tractades amb CTPG mostraven condensació i fragmentació de la cromatina de manera dependent de la dosi, que era similar a les cèl·lules HepG2 tractades amb cisplatí. Aquests resultats van indicar que CTPG va induir l'apoptosi de les cèl·lules HCC.
La integritat de la membrana mitocondrial externa està estrictament regulada per la família Bcl-2 i la reducció de Δψm afavoreix l'alliberament del citocrom c que activa la cascada de caspases per induir l'apoptosi.23,24 Quan Δψm disminueix, el JC{{3 El polímer }} (fluorescència vermella) es descompon en monòmers (fluorescència verda).25 Per tant, les cèl·lules Δψmof HCC es van detectar mitjançant una tinció JC-1 després del tractament CTPG durant 24 hores. Tal com es mostra a la figura 4A, la intensitat de fluorescència verda del canal FL-1 es va augmentar en funció de la dosi mitjançant el tractament CTPG, mentre que la intensitat de fluorescència vermella del canal FL-2 es va reduir en funció de la dosi tant en BEL{ {12}} i cèl·lules HepG2. L'observació del microscopi de fluorescència invertida va mostrar un resultat similar (figura 4B), cosa que indica que CTPG redueix el Δψm de les cèl·lules HCC. Posteriorment, vam observar que els nivells de citocrom c van augmentar tant a les cèl·lules BEL-7404 com a les HepG2 després del tractament amb CTPG (figura 4C), que va confirmar encara més la reducció de Δψm a les cèl·lules HCC tractades amb CTPG.
L'alliberament del citocrom c pot activar la caspasa iniciadora-9 per induir l'apoptosi.26 Els resultats de l'assaig Western blot van suggerir que els nivells de caspasa escindida-3, -7 i{{4} } es van augmentar mentre no es va canviar el nivell de caspasa escindida -8 (figura 5). La caspasa activada-3 pot escindir l'enzim reparador de l'ADN de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) per prevenir la reparació de l'ADN i acumular danys a l'ADN.27 També vam observar nivells regulats a l'alça de PARP escindit. El paper de la cascada de caspases en l'apoptosi de les cèl·lules HCC induïda per CTPG es va determinar encara més utilitzant l'inhibidor de la caspasa (Z-VAD-FMK) i l'inhibidor de la caspasa -3 (Ac-DEVD-CHO), respectivament. Z-VAD-FMK va revertir significativament l'apoptosi de les cèl·lules BEL-7404 i HepG2 induïda per CTPG (figura suplementària 1B). De la mateixa manera, Ac-DEVD-CHO també va revertir significativament l'apoptosi de les cèl·lules HepG2 induïda per CTPG (figura suplementària 1C). Els resultats van demostrar que CTPG va induir l'apoptosi de les cèl·lules HCC per via depenent dels mitocondris.
CTPG va suprimir la migració de cèl·lules HCC in vitro
La migració de cèl·lules canceroses es considera un dels processos crítics en la metàstasi tumoral. Per determinar si CTPG afecta la migració de cèl·lules HCC, la motilitat de les cèl·lules HepG2 es va avaluar mitjançant l'assaig de cicatrització de ferides. Com es mostra a les figures 6A i B, la migració de cèl·lules HepG2 es va inhibir significativament pel tractament amb CTPG de manera dependent de la dosi. La família MMP i el VEGF tenen un paper crític en la migració de cèl·lules tumorals.28 Després del tractament amb CTPG durant 24 hores, els nivells de MMP-2 i VEGF es van reduir significativament (figura 6C), cosa que suggereix que CTPG podria suprimir la invasió i la metàstasi. de HCC.
CTPG va millorar la immunitat dels ratolins
S'ha informat queCistanchedeserticolapolisacàridstenirimmunomoduladorsfuncionsinclosa la promoció de la proliferació de limfòcits i l'activació dels macròfags.29 Les cèl·lules T i les cèl·lules B són els principals limfòcits, que medien les respostes immunitàries cel·lulars i humorals, respectivament. CTPG contenia un 34,8 per cent de contingut de polisacàrids. Per tant, vam examinar els efectes del CTPG sobre la proliferació de cèl·lules T i cèl·lules B. Com es mostra a la figura suplementària 2A, CTPG va augmentar significativament la proliferació de cèl·lules T i cèl·lules B de manera dependent de la dosi, fins i tot en presència de cisplatina. Curiosament, CTPG va inhibir significativament l'apoptosi dels esplenòcits induïda pel cisplatí (figura suplementària 2B), cosa que indica que CTPG podria millorar els efectes secundaris del cisplatí en el sistema immunitari dels ratolins.
Es va avaluar més l'efecte immunoestimulador de CTPG en ratolins. Després de la injecció ip, la injecció sc i l'administració ig de CTPG (200 i 400 mg/kg), no hi va haver cap canvi significatiu en l'estat dels ratolins en comparació amb el grup no tractat. El pes corporal dels ratolins tampoc va tenir cap diferència significativa entre els grups tractats amb CTPG i els grups no tractats (figura 7A). Els índexs de cor, fetge, melsa, pulmó, ronyó i tim dels ratolins eren similars entre tots els grups, excepte els índexs de melsa dels ratolins del grup d'injecció ip CTPG de 400 mg/kg (taula 1). Els resultats van suggerir que les dosis seleccionades de CTPG no tenien efectes secundaris en ratolins.
La melsa és un òrgan de defensa immunitari important en els mamífers, i el seu desenvolupament afecta directament la funció immune de l'individu i la capacitat de resistir les malalties. L'índex d'òrgans immunitaris reflecteix el desenvolupament i la funció immune dels òrgans immunitaris. La melsa conté una varietat de cèl·lules immunitàries, incloses les cèl·lules T, les cèl·lules B, les cèl·lules assassines naturals (cèl·lules NK), els macròfags, les cèl·lules dendrítiques (DC) i altres, que tenen un paper important en el sistema immunitari.3{{2} } S'havia informat que els polisacàrids poden augmentar el nombre de cèl·lules immunitàries per millorar la immunitat del cos.31 Com que la injecció ip de CTPG va augmentar significativament l'índex de melsa (va augmentar 0,55 vegades), vam analitzar més el nombre de diversos cèl·lules immunitàries a la melsa. Els resultats van mostrar que la injecció ip de CTPG va augmentar significativament el nombre de cèl·lules T (CD3 més cèl·lules CD19-) (augment de {{10}},49 vegades), cèl·lules B (CD3-CD19 més cèl·lules) (augment 0.49 vegades) i cèl·lules NK (CD3-CD19-CD49b més cèl·lules) (augmentat 1,63 vegades) en comparació amb el grup no tractat. Les cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus, com a subtipus principals de cèl·lules T, tenen un paper important en la resposta immune cel·lular específica de l'antigen.32 Per tant, hem analitzat més el nombre i l'estat d'activació de les cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus a la melsa. Els resultats van indicar que la injecció ip de CTPG no només va augmentar significativament el nombre de cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus (augmentar 0,55 i 0,34 vegades, respectivament), sinó que també va millorar l'estat d'activació de les cèl·lules CD4 més T (CD4). més cèl·lules CD44 més) (augment de 0,84 vegades) (figura 7B), aquests resultats suggereixen que CTPG tenia una funció de millora immune.
Figura 2. Els efectes del CTPG sobre el cicle cel·lular en cèl·lules HCC.
La combinació de CTPG i cisplatí va mostrar un potent efecte antitumoral sobre el model de ratolí tumoral H22
Generalment s'accepta que la quimioteràpia o la radioteràpia poden conduir a un mal pronòstic i induir nombrosos esdeveniments adversos, que poden ser deguts a la supressió del sistema immunitari i al dany dels teixits i òrgans normals. Els polisacàrids de la MTC tenen efectes de millora immune i alleugen el dany dels òrgans immunitaris i les cèl·lules immunitàries causats per la quimioteràpia, per exemple, quitosà33 i polisacàrids de Lycium barbarum.34 El resultat anterior va demostrar que CTPG podria millorar els efectes secundaris del cisplatí en el sistema immunitari. Per tant, es va avaluar l'efecte antitumoral de CTPG combinat amb cisplatí en el model de ratolí tumoral H22. Com es mostra a la figura 8A, el CTPG sol, el cisplatí sol i la combinació de CTPG i cisplatí (CTPG més cisplatí) van suprimir significativament el creixement del tumor H22 en comparació amb el grup control. CTPG més cisplatí van mostrar un efecte inhibidor més fort que el de CTPG i cisplatí sols. El 20è dia, els volums del tumor en els grups de control, cisplatí sol, CTPG sol i CTPG més cis platí van ser d'uns 1707,8, 722,5, 1033,8 i 367,5 mm3, respectivament. El mateix dia, es van recollir els tumors per a l'observació visual (figura 8B) i la comparació de pes (figura 8C). El CTPG més el cisplatí van mostrar millors efectes terapèutics en el model de ratolí tumoral H22 que el CTPG o el cisplatí sols. El pes del tumor al grup CTPG més cisplatina va ser inferior al d'altres grups. Aquests resultats suggereixen que l'activitat antitumoral de CTPG i cisplatí produeix efectes sinèrgics.
Es van mesurar els pesos corporals dels ratolins per reflectir l'estat de salut dels ratolins. El pes corporal va disminuir notablement després del tractament amb cisplatí, cosa que suggereix una toxicitat sistèmica severa induïda pel cisplatí.35 En comparació, el CTPG combinat amb el cisplatí va millorar significativament la pèrdua de pes corporal induïda pel cisplatí, mentre que el CTPG per si sol no va tenir cap efecte significatiu sobre el pes corporal dels ratolins (figura 8D). Els òrgans inclosos la melsa, el cor, el fetge, el pulmó, el ronyó i el tim també es van aïllar per calcular els índexs d'òrgans. En comparació amb el grup no tractat, els índexs de melsa van disminuir i augmentar significativament amb el cisplatí i el CTPG, respectivament. CTPG més cisplatí van recuperar els índexs de melsa en comparació amb el cisplatí sol. Altres índexs d'òrgans no van mostrar diferències significatives entre tots els grups (taula 2).
CTPG combinat amb cisplatí va millorar la immunitat dels ratolins tumorals
Els resultats anteriors van mostrar que CTPG va millorar la immunitat dels ratolins i va inhibir l'apoptosi dels esplenòcits induïda pel cisplatí. Vam investigar més si l'efecte antitumoral de CTPG més cisplatí estava correlacionat amb una immunitat millorada. En el procés d'aparició i desenvolupament del tumor, el sistema immunitari del cos té una funció de vigilància immune important i la immunitat cel·lular mediada per cèl·lules T té un paper clau. Les cèl·lules T CD4 més tenen la funció d'ajudar la immunitat cel·lular i la resposta immune humoral, i les cèl·lules T CD8 més són les principals cèl·lules efectores de la resposta immune, que poden matar específicament les cèl·lules diana i tenir un paper important en la immunitat tumoral i la immunitat antiviral.32 Es van recollir la melsa de ratolins portadors de tumors per detectar el nombre de cèl·lules T i cèl·lules B mitjançant citometria de flux. Les freqüències i el nombre de cèl·lules T incloses les cèl·lules T CD4 més i CD8 més al grup CTPG més cisplatí eren significativament més altes que les del control (augment de 0,55 i 0,7 vegades, respectivament) i grups de cisplatí (augmentat 0, 92 i 1,16 vegades, respectivament) (figura 9A i B). En comparació amb el grup control, el CTPG sol també va augmentar parcialment el nombre de cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus, tot i que no hi va haver cap diferència significativa. Les freqüències i el nombre de cèl·lules B no tenien diferències significatives entre tots els grups.
Les cèl·lules supressores derivades de mieloides (MDSC) i les cèl·lules T reguladores (Tregs) s'expandeixen en els tumors i inhibeixen les respostes immunes antitumorals; suprimeixen l'activació i expansió de les cèl·lules T CD4 plus, la funció de les cèl·lules T efectores, l'activació i/o proliferació i la formació de citocines de les cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus, la proliferació de cèl·lules B i la producció d'immunoglobulines i el canvi de classe, el funcions citotòxiques de les cèl·lules T NK i assassines naturals (NKT), i la funció i maduració de les DC.36-38 Les freqüències i el nombre de MDSC (CD11b més Gr-1 més ), macròfags (CD11b més Gr{{ {9}}-) i Tregs (Tregs naturals: CD4 més CD25 més Foxp3 plus; Tregs induïts: CD4 més CD25-Foxp3 plus) a la melsa de ratolins tumorals es van analitzar mitjançant citometria de flux. En comparació amb el grup control, les freqüències i el nombre de MDSC van disminuir significativament després de la injecció amb cisplatí sol (disminuït 1,56 vegades) o en combinació amb CTPG (disminuït 0,62 vegades). El nombre de macròfags CD11b més Gr-1- també va disminuir significativament tot i que no hi va haver cap canvi significatiu en les seves freqüències (figura 9C). A més, el CTPG sol i el tractament amb CTPG més cisplatí van disminuir significativament les freqüències de Tregs induïts (disminuït 0.33 i 0.37 vegades, respectivament) (figura 9D). Aquests resultats van suggerir que l'efecte antitumoral de CTPG més cisplatí podria estar correlacionat amb la immunitat millorada caracteritzada per l'augment del nombre de cèl·lules T i la disminució del nombre de MDSCs i Tregs.
Cistanche millora la immunitat.
Discussió
S'ha informat que la MTC podria induir l'apoptosi de diverses cèl·lules tumorals a través de diferents vies, com ara el receptor extrínsec de la mort, les vies d'estrès intrínseques mitocondrials i del reticle endoplasmàtic (ER).39 El nostre estudi anterior va demostrar que la subfracció de N-butanol de Brassica rapa L. induïa L'apoptosi de les cèl·lules d'adenocarcinoma pulmonar A54916 i els extractes d'etanol de Pleurotus ferulae cultivats i salvatges van induir l'apoptosi de les cèl·lules H22 mitjançant la via dependent de l'estrès i dels mitocondris ER.17 També vam informar que CTPG va inhibir el creixement de cèl·lules B16-F10 de melanoma i carcinoma d'esòfag cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant una via dependent dels mitocondris.13 L'echinacòsid és un compost important amb moltes activitats biològiques en els PhG. S'havia informat que l'equinacòsid exercia les seves funcions antiproliferatives i proapoptòtiques a la línia cel·lular HepG2 HCC mitjançant la disminució de l'expressió TREM2 i la senyalització PI3K/AKT.40 En el present estudi, vam trobar que CTPG inhibia el creixement de l'HCC HepG2 i BEL{18. }} cèl·lules mitjançant l'activació de la via de senyalització MAPK i la inducció de l'apoptosi mitjançant la via dependent dels mitocondris. Bax i Bcl-2 tenen un paper crític en la via de l'apoptosi dependent dels mitocondris.24 Aquí, vam trobar que CTPG augmentava l'expressió de Bax i reduïa l'expressió de Bcl-2 a HepG2 i BEL{{25} }}, que va provocar la reducció de Δψi l'alliberament del citocrom c per activar la cascada de caspases. Els nivells regulats a l'alça de caspasa escindida-9 i caspasa escindida-3 es van observar després del tractament amb CTPG, mentre que els nivells de caspasa escindida-8 no es van canviar amb el tractament amb CTPG, cosa que suggereix que l'apoptosi de Les cèl·lules HepG2 i BEL-7404 induïdes per CTPG no van ser mediades per la via de senyalització extrínseca. No obstant això, el nostre estudi anterior va demostrar que CTPG va induir l'apoptosi de les cèl·lules H22 a través de vies tant intrínseques com extrínseques.15 Aquests resultats van suggerir que CTPG podria inhibir el creixement de cèl·lules tumorals a través de múltiples dianes i vies.
La TCM s'ha utilitzat àmpliament per tractar el càncer a través de múltiples vies de senyal amb o sense efectes secundaris menors.41 La via de senyalització MAPK està estretament relacionada amb l'aparició, invasió i metàstasi de cèl·lules tumorals, que implica principalment la via p38, la via JNK/SAPK. , i ERK1/2.20 L'activació de p38 i JNK pot induir apoptosi, però l'activació d'ERK1/2 pot ser anti-apoptòtica o pro-apoptòtica depenent de les propietats cel·lulars.42 S'ha informat que CHM va induir l'apoptosi de cèl·lules tumorals mitjançant l'activació de les vies MAPK p38, JNK o ERK.43,44 Vam trobar que CTPG regulava a l'alça els nivells fosforilats de p38, JNK i ERK, cosa que suggereix que la via de senyalització MAPK podria estar implicada en l'apoptosi de les cèl·lules HCC. induït per CTPG.
La quimioteràpia i la radioteràpia poden causar diversos esdeveniments adversos, inclosa la supressió del sistema immunitari. Per tal de millorar l'eficàcia clínica de la quimioteràpia, s'han aprovat polisacàrids naturals com a adjuvants per al tractament del càncer. S'ha informat que la combinació de lentinan i l'agent quimioterapèutic tegafur va millorar l'eficàcia clínica dels pacients amb carcinoma esofàgic millorant la funció immune del pacient.45 En els nostres estudis anteriors, l'efecte inhibidor in vivo del CTPG sobre el creixement del tumor està relacionat amb no només el seu efecte antitumoral directe, però també la seva funció de millora immune.13,15 La funció de millora immune de CTPG podria estar correlacionada amb el seu contingut de polisacàrids. Aquí, es va investigar l'efecte antitumoral in vivo de CTPG més cisplatí. En el model de ratolí tumoral H22, CTPG més cisplatí no només va mostrar el millor efecte antitumoral sinó que també va reduir els efectes secundaris del cisplatí. CTPG més cisplatí va millorar la immunitat dels ratolins portadors de tumors augmentant el nombre de cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus i disminuint el nombre de MDSC i Tregs, que van participar en el microambient inhibidor induït pel tumor, van promoure el creixement del tumor i van inhibir la resposta immune. .46 L'augment del nombre de cèl·lules T es podria corregir amb la seva proliferació promoguda per CTPG i la seva disminució de l'apoptosi protegida per CTPG. Tanmateix, els mecanismes de CTPG per reduir el nombre de MDSC i Tregs necessiten una investigació addicional.
En conclusió, CTPG va induir l'apoptosi a les cèl·lules HCC tant a través de les vies de senyalització dependents de mitocondris com de MAPK in vitro i va inhibir el creixement de l'HCC mitjançant efectes antitumorals directes i una millora immune indirecta en combinació amb cisplatina. CTPG podria servir com a candidat potencial per al tractament de l'HCC.
pastilles de cistanche
Per a més informació, feu clic a la imatge.
