Part 1: Cistanòside de Cistanche Herba millora el dany reproductiu masculí induït per la hipòxia mitjançant la supressió de l'estrès oxidatiu
Mar 26, 2022
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Resum:L'evidència creixent mostra que la hipòxia és una causa d'infertilitat masculina i la hipòxia pot estar relacionada amb l'estrès oxidatiu (SO). Cistanòsid (Cis) és un compost de glicòsid feniletanoide que es pot extreure de CistanchesHerba i posseeix diverses funcions biològiques. Aquest estudi tenia com a objectiu investigar els efectes protectors del dany reproductiu de Cis induït per la hipòxia i explorar els mecanismes subjacents específics. Es van construir models experimentals d'hipòxia cel·lular i animal i es van avaluar els efectes protectors de diferents subtipus de Cis sobre el sistema reproductor masculí tant in vitro com in vivo. Els resultats van indicar que la hipòxia va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules GC-1 mitjançant l'aturada del cicle cel·lular i l'activació de l'apoptosi, que es van associar amb un augment del sistema operatiu. A més, Cis va mostrar forts efectes antioxidants tant in vitro com in vivo, restaurant significativament les activitats de l'enzim antioxidant. i reduir els nivells d'espècies reactives d'oxigen (ROS) alhora que augmenta la viabilitat cel·lular i disminueix l'apoptosi. És important destacar que els subtipus Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C i Cis-H) estudiats aquí van mostrar certs efectes antioxidants, entre els quals els efectes de Cis-B van ser els més significatius. Aquest estudi demostra que Cis atenua notablement els efectes nocius del sistema operatiu induït per la hipòxia afectant les activitats enzimàtiques antioxidants als testicles i les cèl·lules GC-1.
Paraules clau: Cistanoside, hipòxia hipobàrica, infertilitat masculina, estrès oxidatiu, protecció reproductiva
planta fresca de cistanche
Introducció
Actualment, aproximadament 48,5 milions (15 per cent) de parelles en edat reproductiva a tot el món estan afectades per la infertilitat [1], entre les quals el 40-50 per cent dels casos s'atribueixen a la infertilitat masculina [2], una condició que està fortament associada amb el medi ambient i l'estil de vida. factors. Les evidències suggereixen que la susceptibilitat dels mamífers a la baixa pressió d'oxigen és un factor causant d'algunes formes d'infertilitat masculina [3]. Com s'ha demostrat en estudis anteriors, l'espermatogènesi es veu alterada i es redueix amb l'exposició a la hipòxia hipobàrica [4-7].
Per explorar el mecanisme subjacent, els estudis han demostrat que l'exposició a la hipòxia hipobàrica augmenta la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) [8, 9]. ROS té un paper important en el sistema reproductor masculí. A nivells baixos, són necessaris per a la capacitació espermàtica, la reacció acrosoma i la fusió espermatozoide-oòcit [10]. Tanmateix, l'excés de ROS pot induir danys a l'ADN mitocondrial i espermanuclear i danys peroxidatius de la membrana plasmàtica, que són factors etiològics importants per a l'augment del risc d'infertilitat masculina [11, 12]. Per tant, l'acumulació de ROS induïda per la hipòxia podria ser una de les causes de la infertilitat masculina.
Cistanches Herba, una planta medicinal parasitària perenne, es distribueix àmpliament en zones àrides [13] i s'utilitza àmpliament a causa de les seves activitats farmacològiques [14-17]. Entre tots els continguts efectius de Cistanches Herba, els PhG s'han considerat com el principal component actiu. Fins ara, s'han aïllat 34 PhG de les plantes de Cistanches [13]. Cistanoside (Cis), PhG anactiu aïllat de Cistanches Herba, ha rebut atenció pels seus efectes antioxidants.
Tenint en compte els efectes antioxidants de Cis i el paper de les ROS en la infertilitat masculina induïda per la hipòxia, Cis es considera un candidat potencial a fàrmac per al tractament de la infertilitat masculina induïda per la hipòxia. Tanmateix, pocs informes han abordat els efectes antioxidants de Cis extret de Cistanches Herba en el tractament de la infertilitat masculina induïda per la hipòxia o les vies de senyalització implicades. En aquest estudi, es van construir models experimentals d'hipòxia in vitro i in vivo i es van avaluar els components dels efectes de diferents Cis.
Cistanche té aefecte de producció reproductiva.
Materials i mètodes
Cultiu cel·lular i reactiu
La línia cel·lular d'espermatogònies de ratolí GC-1spg(GC-1) es va comprar a la American TypeCulture Collection (ATCC) i es va cultivar en DMEM (Invitrogen, EUA) complementada amb un 10% de sèrum fetalboví, un 1% de L- glutamina (100 mM), penicil·lina (100 U/mL) i estreptomicina (100 ug/mL) a 37 graus en una incubadora humidificada amb un 5 per cent de CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) es va comprar a Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Xina).
Assaig de viabilitat cel·lular
La viabilitat cel·lular es va provar mitjançant l'assaig del kit de recompte de cèl·lules{{0}}(CCK-8). En resum, les cèl·lules GC-1 es van sembrar en plaques de 96-pous a 1,5 × 103 per pou i es van cultivar a 37 graus durant 24 h. A continuació, les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions (20 per cent, 15 per cent, 10 per cent, 5 per cent) d'oxigen o diferents concentracions (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C). , Cis-H) durant el temps requerit. A continuació, es va descartar el sobrenedant i es van detectar la viabilitat cel·lular mitjançant un kit CCK-8 (DojindoJapan). L'absorbància de cada pou es va mesurar a 450 nm mitjançant un lector de microplaques (BioRad USA). Finalment, les viabilitats cel·lulars es van calcular segons la fórmula següent:
Viabilitat cel·lular=(grup ODexperimental - grup ODblank)/(grup ODcontrol - grup ODblank) × 100 per cent .
Anàlisi Western blot
Les cèl·lules o teixits recollits es van homogeneïtzar en tampó RIPA per extreure proteïnes (RIPA BeyotimeXina; Còctel Roche Suïssa). Es van recollir sobrenedants i es va provar la concentració de proteïnes pel mètode BCA (Beyotime). Aproximadament 40 ug de les proteïnes extretes de cada mostra es van separar mitjançant SDS-PAGE i es van electrotransferir a la membrana del filtre de nitrocel·lulosa (NC) (BeyotimeChina). Les membranes del filtre NC es van bloquejar amb llet sense greix al 5% durant 1,5 h i es van incubar amb anticossos específics (anti-PARP 1:1000, anti-Capasa-3 1:1000, anti-Bcl{-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; tots els anticossos es van comprar a Cell Signaling Technology, EUA) durant la nit a 4 graus. A continuació, es van incubar totes les membranes NC amb l'anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de rave picant durant 1, 5 h a temperatura ambient i es van fer imatges amb un sistema d'imatge (Tannon, Xina).
suplements d'extracte de cistanche en pols
Detecció del cicle cel·lular
Es va realitzar un assaig citomètric de flux (FCM) per analitzar el cicle cel·lular. Les cèl·lules es van tractar en diferents condicions durant 72 hores i es van collir. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS, es van fixar en etanol al 75 per cent i es van tacar amb iodur de propidi (PI). Per a cada mostra, es van recollir i analitzar 1 × 104 cèl·lules mitjançant citometria de flux (FACSCalibur, BD Biosciences). A continuació, es va calcular la proporció de cèl·lules de fase G1/S/G2 i l'índex de proliferació [Fase (S més G2)/Fase (G1 més S més G2) × 100 per cent].
Tinció de Ki-67
Les cèl·lules es van cultivar en un plat confocal i es van tractar amb hipòxia o diferents subtipus de Cis durant 72 h. Després de fixar totes les cèl·lules amb un 4% de paraformaldehid, es van incubar amb anticossos anti-Ki-67 (1:200, tecnologia de senyalització cel·lular). Aleshores, totes les cèl·lules es van incubar amb un anticòs IgG anti-conill conjugat CY-3-(1:200, Boster, Xina) i una solució DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). La fluorescència es va observar amb un microscopi confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japó).
Detecció de ROS
La FCM es va introduir per mesurar els nivells intracel·lulars de ROS mitjançant DCFH-DA. Les cèl·lules en suspensió es van sembrar en 6-plaques de pous i es van sotmetre a diferents tractaments. Després de 72 h de tractament, les cèl·lules es van suspendre en DMEM sense sèrum amb 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Aleshores, el contingut de ROS es va determinar mitjançant la classificació de cèl·lules activades per fluorescència en un sistema de citometria de flux Beckman Coulter amb una longitud d'ona d'excitació de 488 nm i una longitud d'ona d'emissió de 525 nm [18].
Determinació de la peroxidació lipídica (LPO)
Es va realitzar l'assaig de substàncies reactives a l'àcid tiobarbitúric (TBARS) per detectar LPO. Tots els passos operatius es van realitzar d'acord amb les instruccions (Sigma USA). Les concentracions es van calcular utilitzant un coeficient d'extinció molar d'1,56 × 105/(M·cm), que es va obtenir utilitzant malondialdehid com a estàndard. Els resultats s'expressen en nmol d'equivalents de MDA/mg de proteïna.
Determinació de les activitats enzimàtiques
Les activitats enzimàtiques es van provar mitjançant kits d'assaig que inclouen glutatió reductasa (GR), glutatió peroxidasa (GPx) i superòxid dismutasa (SOD). Tots els passos operatius es van realitzar d'acord amb les instruccions subministrades (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute Xina).
Animals i protocol experimental
Les rates Wistar mascles madures (180-220 g, 8 anys d'edat) es van obtenir del centre d'animals de la Quarta Universitat de Medicina Militar, Xi'an, Xina. Es va obtenir el permís per utilitzar els animals del Comitè d'Ètica de la Universitat (número de referència). : 20190506). L'experiment animal es va dur a terme seguint les directrius universitàries per a la cura i l'ús d'animals de laboratori.
Es va permetre que totes les rates s'adaptissin durant aproximadament una setmana abans de l'inici de l'experiment. Després de l'aclimatació, les rates es van distribuir aleatòriament en 6 grups amb 5 animals a cada grup. Les rates del grup control es van elevar a pressió normal (PO2: 20 per cent; pressió de l'aire: 101,3 kPa), mentre que les rates del model i els grups de tractament es van criar en una cambra d'oxigen a baixa pressió (pressió interna de 61,6 kPa, equivalent a una alçada de 4000 metres sobre el nivell del mar; PO2: 14,55 per cent) per simular un entorn hipòxic a gran altitud. Totes les rates tenien accés gratuït al menjar i l'aigua en gàbies de plàstic a 22 ± 2 graus i condicions d'humitat amb un cicle de llum/foscor automàtic de 12-h. Les rates del model i dels grups tractats amb Cis van romandre en condicions hipobàriques, però se'ls va transferir condicions tonormobàriques cada 96 hores, moment en què se'ls va proporcionar menjar i aigua i es van netejar les gàbies. La durada de la transició d'hipobàric a hipobàric va ser d'aproximadament 2 h. Tots els grups de tractament es van tractar amb el Cis corresponent (8 mg/kg/d) mitjançant sonda oral durant 8 setmanes, mentre que les rates control i model es van tractar amb un volum d'aigua igual.
Després de 8 setmanes, les rates es van sacrificar sota anestèsia. Es van separar i pesar els testicles, l'epidídim i les vesícules seminals i es va calcular l'índex orgànic d'acord amb la fórmula següent: (pes de l'òrgan/pes de l'animal) × 100 per cent. Posteriorment, es van recollir espermatozoides a l'epidídim i es va provar la seva motilitat i activitat acrosoenzima. De la mateixa manera, es van recollir teixits testiculars per a estudis histopatològics i detecció de ROS, LPO i enzima antioxidant.
Avaluació de la taxa d'espermatozoides vius
L'epidídim es va incisar amb unes tisores quirúrgiques i la suspensió d'esperma es va preparar en solució salina normal. Per avaluar la taxa d'esperma en viu, es van barrejar acuradament 5 μL de la suspensió d'esperma amb un volum igual d'eosina-Ystain. Després es van comptar els espermatozoides al microscopi lleuger. Les taxes d'espermatozoides vius es van avaluar calculant tant els espermatozoides tenyits (espermatozoides) com els no tacats (espermatozoides vius).
Cistanche tubulosa en polsaugmenta lataxes d'espermatozoides vius.
Per a més informació, feu clic aquí.
Determinació de l'activitat enzimàtica de l'acrosoma espermàtic
L'assaig de l'activitat enzimàtica de l'acrosoma espermàtic es va utilitzar per avaluar els acrosomes espermàtics [19]. Els resultats de cada grup es van calcular mitjançant la fórmula següent: Activitat enzimàtica de l'acrosoma (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank group)/(247,5 × 10) × 106.
Anàlisi estadística
Totes les dades quantitatives s'expressen com a mitjana ± SD i es van analitzar mitjançant el programari SPSS 22.0. Es va utilitzar la prova t de Independent Student per comparar les dades entre dos grups. *Pàg< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">