La galectina-3 té efectes antinecroptòtics i antiapoptòtics en la necrosi tubular aguda induïda pel cisplatí

Contacte: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama et al

Dosificació de Cistanche tubulosa per a la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra

Resum

Antecedents/Objectius:Agutronyóla lesió (AKI) és una càrrega de salut pública amb un augment de la morbiditat, la mortalitat i el cost de l'atenció sanitària. S'associa amb un augment del risc de desenvolupament crònicronyómalaltia i mort. La necrosi tubular aguda (ATN) és la causa més freqüent d'IRA. L'apoptosi i la necrosi dels teixits tenen un paper important en l'ATN. Se sap que la galectina 3 (GAL-3), una lectina que s'uneix a galactòsids beta, té un paper en la inflamació, l'apoptosi i l'estrès oxidatiu, però el seu paper en la necrosi tubular aguda induïda pel cisplatí no està clarament dilucidat.

Mètodes:Es van utilitzar ratolins C57B6-J i C57BL-6 -GAL-3 mascles per induir ATN mitjançant un model de ratolí cisplatí de necrosi tubular aguda. Proteïnes d'expressió GAL-3, apoptòtiques, necròtiques i necroptòtiquesronyonses van mesurar mitjançant tècniques d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims, histològics i immunohistoquímics. Les dades es van presentar com a mitjana ± SE Diferències estadísticament significatives (p<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Resultats:Hi va haver un augment significatiu de GAL-3 aronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els seus ratolins control. A més, hi va haver percentatges significativament més alts d'ATN, nivells més alts d'urea plasmàtica i creatinina i nivells més alts de catepsina B i catepsina D, en elronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí. De la mateixa manera, hi va haver nivells significativament més alts de proteïnes de necroptosi RIPK1, RIPK3 i MLKL enronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí. A més, hi havia nivells significativament més alts deronyóproteïnes pro-apoptòtiques; va escindir la caspasa-3, va escindir PARP, TRAIL i FAS en ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí.

Conclusió:GAL-3 pot afectar la supervivència i la mort cel·lular mitjançant la seva interacció amb proteïnes necroptòtiques, apoptòtiques i pro-supervivència dels túbuls renals durant la necrosi tubular aguda induïda pel cisplatí.

Paraules clau: Ronyó• Necrosi tubular aguda • Cisplatí • Galectina-3 • Necroptosi • Apoptosi

Introducció

Agutronyóla lesió (AKI) es caracteritza per una reducció brusca deronyófunció basada en una elevació del nivell de creatinina sèrica, una reducció de la producció d'orina, la necessitat de teràpia de substitució renal o una combinació d'aquests factors [1].

ElRonyóLa guia de pràctica clínica per a l'IRA per a la millora de la malaltia (KDIGO) defineix l'IRA com un augment de la creatinina sèrica en un valor superior o igual a 0,3 mg/dl (superior o igual a 26,5 µmol/l) dins 48 hores; o un augment de la creatinina sèrica superior o igual a 1,5 vegades la línia de base, que se sap o es suposa que s'ha produït durant els 7 dies anteriors; o volum d'orina<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

La necrosi tubular aguda (ATN) és una causa freqüent d'IRA [3]. Els delictes isquèmics i nefrotòxics són les principals causes d'ATN [3]. Malgrat els amplis estudis sobre ATN, que inclouen lesions cel·lulars, mort cel·lular i regeneració, els mecanismes subjacents no estan clarament definits.

L'apoptosi és una forma de mort cel·lular programada mediada per caspases. Informes significatius han demostrat que l'apoptosi té un paper important en l'ATN [3, 4]. D'altra banda, la necrosi és una forma de mort cel·lular caracteritzada per la permeabilització primerenca de la membrana plasmàtica, la inflamació dels orgànuls i la desintegració del contingut cel·lular [5]. La necrosi es produeix amb freqüència quan les cèl·lules es veuen desafiades amb un estrès extern excessiu. La necrosi s'ha considerat tradicionalment com a passiva i no programada; per tant, s'havien fet molt pocs esforços per investigar el mecanisme de la necrosi, malgrat la seva prevalença en malalties humanes [5]. Un tipus de necrosi ben reconegut és la necroptosi [5]. La necroptosi és una mort cel·lular programada no apoptòtica induïda per una sèrie d'estímuls extracel·lulars, com el factor de necrosi tumoral (TNF) [5]. Es va definir originalment com la mort cel·lular caracteritzada per la morfologia de la mort cel·lular necròtica amb l'activació concomitant de la serina/treonina-proteïna quinasa 1 (RIPK1) que interacciona amb el receptor. RIPK1 activa la serina/treonina-proteïna quinasa 3 que interacciona amb el receptor (RIPK3) per formar un complex anomenat necrosoma [6]. Més tard, el RIPK3 activat adquireix la capacitat de fosforilar i activar un domini de llinatge mixt quinasa (MLKL) [6]. Les molècules MLKL fosforilades són capaces de formar oligòmers per facilitar la seva translocació a la membrana cel·lular mitjançant la unió als lípids de fosfatidilinositol i la cardiolipina. Els oligòmers MLKL translocats actuen com a canals a la membrana cel·lular per induir l'entrada de sodi i l'eflux d'ions de potassi [7] o, alternativament, una afluència d'ions de calci [8]. D'ambdues maneres, això conduirà a la mort de les cèl·lules necròtiques mitjançant la permeabilització i la ruptura de la membrana plasmàtica, donant lloc al vessament del contingut intracel·lular a l'òrgan.

En aquest projecte, hem utilitzat cisplatina (Cis) per induir necrosi tubular aguda. Cis té una àmplia gamma d'efectes antitumorals i s'ha utilitzat per tractar diversos tumors malignes [9]. No obstant això, la nefrotoxicitat és el principal efecte secundari i es caracteritza per una necrosi de cèl·lules tubulars renals, dany tissular, disfunció renal i aguda.ronyófracàs [10]. Malgrat les diverses mesures que s'han pres per superar la lesió renal, gairebé el 4-23 per cent dels pacients es veuen afectats per AKI [11]. Els mecanismes coneguts de lesió renal induïda per cisplatí inclouen l'apoptosi, l'estrès oxidatiu i la resposta inflamatòria a causa de la lesió directa a les cèl·lules epitelials tubulars renals i als vasos renals [12].

La galectina-3 (GAL-3), proteïna de 35 kDa, és una quimera única que té un domini de reconeixement de carbohidrats C-terminal (CRD) connectat a un domini N-terminal llarg (ND) [13]. ].GAL-3 es troba a la superfície cel·lular, al citoplasma i al nucli de les cèl·lules, així com a la matriu extracel·lular [13].

GAL-3 intracel·lular ha estat implicat en la proliferació cel·lular i en els mecanismes anti-apoptòtics [14, 15]. Afecta les proteïnes K-Ras i Akt i, per tant, també regula la supervivència de la diferenciació i la mort [14, 15]. Mentre que, el GAL extracel·lular-3 media l'adhesió cèl·lula-cèl·lula, la interacció i la senyalització cèl·lula-matriu, la inflamació i l'apoptosi [16].

S'ha demostrat que GAL-3 es trasllada des del citosol o del nucli als mitocondris després de l'exposició a estímuls apoptòtics i bloqueja els canvis en el potencial de la membrana mitocondrial, evitant així l'apoptosi [17]. Els estudis també han demostrat que GAL-3 pot inhibir l'apoptosi induïda pel TNF mitjançant l'activació d'AKT [18]. Altres estudis han demostrat que GAL-3 i Beclin1 estan implicats en dues vies coordinades de mort cel·lular programada, apoptosi i autofàgia [18]. En aquest projecte, es planteja la hipòtesi que GAL-3 té un paper protector sobre l'epiteli tubular renal en lesió tubular aguda. Hem utilitzat un model murí de lesió tubular aguda per investigar el paper protector de GAL-3 en la lesió tubular aguda induïda per cisplatí mitjançant la mesura de les funcions renals (urea plasmàtica i creatinina).ronyóproteïnes de necroptosi (RIP-1, RIP-3 i MLKL), proteïnes de necrosi (catepsina D i catepsina B), proteïnes d'apoptosi (caspasa escindida-3, PARP escindida, TRAIL i FAS) , i marcadors de supervivència de cèl·lules (p-NF-κB, beta-catenina i Wnt), utilitzant assaig immunoabsorbent lligat a enzims estàndard, analitzador bioquímic, procediments histològics i immunohistoquímics.

Materials i mètodes

Hem utilitzat un model experimental de ratolí d'agutronyólesió que s'ha descrit àmpliament a la literatura i s'ha utilitzat per estudiar les agudesronyólesions en laboratoris de tot el món [19].

Model de ratolí de necrosi tubular aguda

Es van utilitzar ratolins C57BL/6 i C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO) amb un pes de 25-30 g. Els ratolins es van mantenir amb una dieta estàndard. Els ratolins es van allotjar cinc per gàbia sota un horari de llum i foscor de 12-h durant almenys 1 setmana abans de l'administració de Cisplatina.

El cisplatí (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, ÀUSTRIA) es va utilitzar recentment el dia de l'administració a una concentració de 0,5 mg/ml. Als ratolins se'ls va donar 30 mg/kg de pes corporal de cisplatí [11] o un vehicle (solució salina normal) intraperitoneal (IP), després del qual els ratolins van tornar a tenir accés lliure al menjar i l'aigua. El mètode d'eutanàsia va començar amb una injecció intraperitoneal de fàrmacs anestèsics, que incloïa una combinació de ketamina (100 mg/kg) i xilazina (10 mg/kg), després es van extreure els ronyons i es van recollir mostres de sang 96 hores després de l'administració de cisplatí. La sang es va recollir en vacutainers EDTA.RonyonsDesprés es van resecar, es van rentar en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) freda amb gel, la meitat de cada ronyó es va congelar immediatament en nitrogen líquid i després es va emmagatzemar en un congelador de -80 graus. L'altra meitat es va fixar immediatament en una solució salina formal tamponada al 10 per cent durant 24 hores. La sang recollida es va centrifugar a 3000 RPM durant 15 minuts. El plasma es va recollir, es va dividir en alíquotes i es va emmagatzemar a -80 graus fins a una anàlisi posterior.

Processament de mostres per a l'extracció de proteïnes

Es va extreure la proteïna totalronyómostres homogeneitzant amb tampó de lisi i recollint el sobrenedant després de la centrifugació. Per al lisat cel·lular total, les mostres de ronyó es van descongelar, es van pesar i es van posar en un tampó de lisi fred que contenia 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, EDTA 3 mM, glicerofosfat 20 mM, NaF 25 mM, 1 per cent de Tritó X{-100, 10 per cent p/v de glicerol i comprimit inhibidor de la proteasa (inhibidor complet de la proteasa de Roche pastilles de còctel). Els ronyons es van homogeneïtzar sobre gel mitjançant un homogeneïtzador (IKA T25 Ultra Turrax). A continuació, es van centrifugar les mostres a 14000 RPM durant 15 minuts a 4 graus, el sobrenedant es va recollir, es va repartir en alíquotes i es va emmagatzemar a -80 graus fins a una anàlisi posterior. L'extracció de proteïnes nuclears i citoplasmàtiques es va fer seguint el protocol descrit en un altre lloc [19]. Breument, les mostres de ronyó es van descongelar en gel, es van pesar i homogeneïtzar en gel amb tampó que contenia Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l , Fluorur de fenilmetansulfonil (PMSF) 0,5 mmol/l, sacarosa 0,32 mmol/l, ditiotreitol (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP{-40) 0,5 per cent i còctel inhibidor de proteasa 1 per cent. Els homogeneïts es van centrifugar a 800 RPM durant 10 minuts. El sobrenedant es va eliminar i es va mantenir com a fraccions citoplasmàtiques. El pellet es va rentar dues vegades amb tampó d'homogeneïtzació sense NP{34}} i es va tornar a suspendre amb un tampó baix en sal que contenia HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol. /l. Glicerol 25 per cent, PMSF 0,5 mmol/l i DTT 0,5 mmol/l. Després de la incubació en gel durant 5 minuts, un volum igual de tampó d'alta sal que conté HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Es va afegir glicerol 25 per cent, PMSF 0,5 mmol/l, DTT 0,5 mmol/l, NP-40 1 per cent i còctel d'inhibidor de proteasa 1 per cent, la barreja es va incubar en gel durant 30 minuts, es va centrifugar a 14.000 rpm durant 15 minuts a 4 graus i els sobrenedants es van guardar com a fracció nuclear. La concentració total de proteïnes es va determinar mitjançant el mètode d'assaig de proteïnes BCA (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Processament de mostres per a histologia

Els ronyons es van extirpar, es van rentar amb PBS fred amb gel i es van pesar. Cadascúronyóes va seccionar en dues meitats, i cada meitat era un casset i es va fixar directament en formalina tamponada al 10%. Les seccions es van deshidratar en concentracions creixents d'etanol, es van netejar amb xilè i es van incrustar amb parafina. Es van preparar seccions de tres µm a partir de blocs de parafina i es van tacar amb hematoxilina i eosina i taques de Schiff d'àcid periòdic (PAS) mitjançant procediments estàndard [20]. Les seccions tacades van ser avaluades per l'histopatòleg que va participar en aquest projecte.

Immunohistoquímica

Les seccions de cinc µm es van desparafinar amb xilè i es van rehidratar amb alcohol graduat. A continuació, es van col·locar les seccions en una solució de recuperació amb un pH elevat (pH 9) en un bany maria a 95oC durant 20 minuts. A continuació, es van rentar les seccions amb aigua destil·lada durant 5 minuts seguit de tampó TBST durant 5 minuts. A continuació, es van tractar les seccions amb un bloc de peroxidasa durant 10 minuts seguit d'un bloc de proteïnes durant 10 minuts. A continuació, es van incubar les seccions durant una hora a temperatura ambient amb anticòs de caspasa -3 anti-escissió (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA), anticossos PARP anti-escissió (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Tecnologia de senyalització cel·lular, Danvers, MA, EUA), anticossos anti-beta-catenina (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anticossos anti-fosfo-NF-κB (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-Wnt-3 (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-RIPK1 (Rabbit policlonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), anti-RIPK3 (Rabbit policlonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) i anti-MLKL 1 (Rabbit monoclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) . Després de la conjugació amb anticossos primaris, les seccions es van incubar amb anticossos secundaris (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, EUA) durant 20 minuts a temperatura ambient seguit de l'addició de cromogen DAB (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, EUA) i la contratinció es va fer amb hematoxilina. S'han utilitzat controls positius adequats. Per al control negatiu, l'anticossos primari no es va afegir a les seccions. Es van utilitzar controls positius i negatius a cada lot de diapositives tenyides (no es mostra a les figures).

Etiquetatge immunofluorescent

Les seccions de cinc μm es van desparafinar amb xilè i es van rehidratar amb alcohol graduat. Les seccions es van col·locar en una solució de recuperació amb un pH elevat (pH 9) en un bany maria a 95 graus durant 20 minuts. A continuació, es van rentar les seccions amb aigua destil·lada durant 5 minuts seguit de tampó TBST durant 5 minuts. A continuació, es van incubar les seccions amb anticossos anti-GAL-3 (Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA), anti-RIPK1 (Rabbit policlonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), anti-RIPK3 1 (Rabbit policlonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) i anti-MLKL 1 (Rabbit monoclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) durant la nit a temperatura ambient. Les seccions es van incubar posteriorment amb anticòs anti-conill Alexa Fluor 488 (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, EUA, 1:100). Finalment, es van muntar seccions en suports de muntatge solubles en aigua DAPI (Abcam, Cambridge, MA, EUA) i es van veure amb un microscopi fluorescent Olympus. Es van utilitzar seccions de control positiu adequades. Per al control negatiu, l'anticossos primari no es va afegir a les seccions i tot el procediment es va dur a terme de la mateixa manera que s'ha esmentat anteriorment. Es van utilitzar controls positius i negatius a cada lot de diapositives tenyides (no es mostra a les figures).

Anàlisi morfomètrica

L'anàlisi morfomètrica de la necrosi tubular aguda va ser realitzada per dos investigadors participants en aquest estudi. L'anàlisi morfomètrica de l'expressió de caspasa-3 escindida, PARP escindida, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenina a les cèl·lules tubulars renals es va fer mitjançant el programari ImageJ (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). L'etiquetatge de caspasa escindida-3, PARP escindida, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt{-3, beta-catenina, es va determinar comptant el nombre de cèl·lules positives d'alta potència seleccionada aleatòriament camps (HPF) al ronyó. El nombre mitjà de cel·les positives es convertirà de per HPF a per mm2 (cada mm2= 4HPF). Per a caspasa escindida-3, PARP escindida, RIPK1, RIPK3 i Wnt-3, etiquetatge, es van considerar les cel·les

positiu quan hi havia un patró de tinció citoplasmàtica. Per a l'etiquetatge MLKL, les cèl·lules es van considerar positives quan hi havia un patró de tinció membranosa i citoplasmàtica. Per a l'etiquetatge de fosfo-NFK-B i Beta-Catenina, les cèl·lules es van considerar positives quan hi havia un patró de tinció nuclear.

Assaig immunoabsorbent lligat a enzims

RonyóLes concentracions de GAL-3, catepsina D, catepsina B, caspasa clivada-3, TRAIL i FAS es van determinar mitjançant el kit de desenvolupament d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). ) per ELISA sandvitx, utilitzant el procediment estàndard segons les instruccions del fabricant. Les concentracions de PARP escindides per ronyó es van determinar mitjançant el kit Elisa de la tecnologia de senyalització cel·lular (Danvers, MA, EUA) per a l'entrepà Elisa, mitjançant un procediment estàndard segons les instruccions del fabricant. Les concentracions renals de RIPK1, RIPK3 i MLKL es van determinar mitjançant els kits Elisa MyBioSource (San Diego, CA, EUA) per a sandvitx Elisa, mitjançant un procediment estàndard segons les instruccions del fabricant. Les lectures d'absorbància es van fer a 450 nm, utilitzant un 96-espectrofotòmetre de plaques de pou (lector Elisa de microplaques BioTek ELx800, Winooski, VT, EUA). Les concentracions de GAL-3, catepsina D, catepsina B, caspasa escindida-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, PARP escindida i FAS en mostres de ronyó es van determinar per interpolació a partir d'una corba estàndard. Els nivells es van normalitzar a les concentracions totals de proteïnes.

Anàlisi estadística

Totes les anàlisis estadístiques es van fer utilitzant Graph Pad Prism Software versió 5. Es van aconseguir múltiples comparacions entre els diferents grups mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA), seguida de proves de rang múltiple post hoc de Newman Keuls. Les comparacions entre dos grups es van aconseguir mitjançant la prova t de Student. Les dades es presenten en mitjana ± error estàndard (SE). Els valors P <0,05 es="" consideren="">

Resultats

Necrosi tubular aguda induïda per cisplatí

El grup salvatge GAL-3 tractat amb cisplatí mostra ATN que implica (67,29 per cent ± 2,392) de parènquima renal (Fig. 1) amb pèrdua de vores de raspall, inflor de cèl·lules tubulars, caiguda de cèl·lules intratubulars, secrecions intratubulars i mitosi ( Fig. 2B i 3B).

El grup GAL-3 KO tractat amb cisplatí mostra ATN que implica (78,54 per cent ± 0,8120) de parènquima renal (Fig. 1) amb pèrdua de vores de raspall, inflor de cèl·lules tubulars, caiguda de cèl·lules intratubulars, secrecions intratubulars i mitosi (Fig. 2D i 3D).

Hi ha un percentatge significativament més alt d'ATNronyonsen ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 s'expressa en necrosi tubular aguda

Hi ha un augment significatiu de la concentració de fracció citoplasmàtica de GAL-3 aronyonsen el grup salvatge GAL-3 tractat amb cisplatí (6084 ± 587,3 pg/mg) en comparació amb el grup control salvatge GAL{-3 (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">ronyonsen estat salvatge GAL-3 tractat amb cisplatí

grup (841,8 ± 41,11 pg/mg) en comparació amb el grup control salvatge GAL-3 (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Tinció immunofluorescent del representantronyóLes seccions han mostrat una expressió significativament més alta de GAL-3 als túbuls renals afectats per la necrosi tubular aguda (Fig. 4B-D) en comparació amb els ratolins control salvatge GAL-3 (Fig. 4A).

GAL-3 és un mediador antinecroptòtic

Serina/treonina-proteïna quinasa 1 que interacciona amb el receptor (RIPK1). Hi va haver un augment significatiu de la concentració de RIPK-1 (55,33 ± 3,766 pg/mg) enronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Les comparacions múltiples entre els quatre grups experimentals utilitzant ANOVA unidireccional, seguida de la prova post hoc de Newman-Keuls van ser estadísticament significatives (P<>

La tinció immunohistoquímica de RIPK-1 va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules que expressaven RIPK-1 aronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="">

Serina/treonina-proteïna quinasa 3 que interacciona amb el receptor (RIPK3). Hi va haver un augment significatiu de la concentració de RIPK-3 (616,4 ± 27,07 pg/mg) als ronyons de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (17,46 ± 7,002 pg/mg), (Pàg<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">ronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

La tinció immunohistoquímica de RIPK-3 va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules que expressaven RIPK-3 en ronyons de ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí ( P<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Llinatge mixt de domini quinasa (MLKL). Hi va haver un augment significatiu de la concentració de MLKL (71,46 ± 1,757 pg/mg) enronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (23,30 ± 0,5897pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Cathepsin B. Hi va haver un augment significatiu de la concentració de catepsina-B aronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (55,79 ± 4,141 pg/mg) en comparació amb els ratolins control salvatges GAL{-3 (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">ronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí (85,87 ± 9,220 pg/mg en comparació amb els ratolins control salvatge GAL{-3 (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Les comparacions múltiples entre els quatre grups experimentals utilitzant ANOVA unidireccional, seguida de la prova post hoc de Newman-Keuls van ser estadísticament significatives (P<>

catepsina-D. Hi va haver un augment significatiu de la concentració de catepsina-Dronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (5145 ± 286,1 pg/mg) en comparació amb els ratolins control salvatges GAL{-3 (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">ronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí (6695 ± 587,7 pg/mg) en comparació amb els ratolins control salvatge GAL{-3 (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Les comparacions múltiples entre els quatre grups experimentals utilitzant ANOVA unidireccional, seguida de la prova post hoc de Newman-Keuls van ser estadísticament significatives (P<>

GAL-3 és un mediador anti-apoptòtic

Caspasa escindida-3. Hi va haver un augment significatiu de la concentració de caspasa-3 clivada (4665 ± 330,9 pg/mg) alronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinció immunohistoquímica de la caspasa escindida-3 va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules apoptòtiques als ronyons de ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

PARP tallat. Hi va haver un augment significatiu de la concentració de PARP clivat (1446 ± 56,97 pg/mg) en elronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinció immunohistoquímica per a PARP escindit va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules positives als ronyons de ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Lligand inductor de l'apoptosi relacionat amb el TNF (TRAIL). Hi va haver un augment significatiu de la concentració de TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) enronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (86,14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinció immunohistoquímica per a la caspasa escindida-3 va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules apoptòtiques aronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

PARP tallat. Hi va haver un augment significatiu de la concentració de PARP escindida (1446 ± 56,97 pg/mg) als ronyons dels ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/ mg), (Pàg<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">ronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control GAL{-3 KO (236,1 ± 11.86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinció immunohistoquímica per a PARP escindit va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules positives enronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Lligand inductor de l'apoptosi relacionat amb el TNF (TRAIL). Hi va haver un augment significatiu de la concentració de TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) als ronyons de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL{-3 (86,14 ± 2,879 pg/mg), (Pàg<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">ronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Llegenda FAS.Hi va haver un augment significatiu de la concentració de FAS (332,5 ± 6,395 pg/mg) en elronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL-3 (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">ronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control GAL-3 KO (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Les comparacions múltiples entre els quatre grups experimentals utilitzant ANOVA unidireccional, seguida de la prova post hoc de Newman-Keuls van ser estadísticament significatives (P<>

GAL-3 i senyals de supervivència

NF-κB.La tinció immunohistoquímica de fòsfor-NF-κB va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules tacades amb fòsfor-NF-κB aronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí que de ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta Catenina.La tinció immunohistoquímica per a beta-catenina va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules tacades amb beta-catenina aronyonsde ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí que de ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.La tinció immunohistoquímica de Wnt-3a va mostrar un nombre significativament més gran de cèl·lules tacades amb Wnt-3a als ronyons de ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí que GAL-3 ratolins KO (P<0.001), (fig.="" 12="">

Urea plasmàticaHi va haver un augment significatiu de la concentració d'urea plasmàtica (23,88 ± 6,715 mmol/L) en els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL{-3 (6,688 ± 0. 6066 mmol/L), (Pàg<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Les comparacions múltiples entre els quatre grups experimentals utilitzant ANOVA unidireccional, seguida de la prova post hoc de Newman-Keuls van ser estadísticament significatives (P<>

Creatinina plasmàtica

Hi va haver un augment significatiu de la concentració de creatinina plasmàtica (48,42 ± 3,992 umol/L) en els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí en comparació amb els ratolins control salvatges GAL{-3 (13,27 ± 0. 3106 umol/L), (Pàg<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Discussió

Agutronyóles lesions són un problema de salut comú a tot el món. Cada any, hi ha uns 13,3 milions de casos agutsronyólesió (AKI). Una càrrega que s'està tornant especialment elevada als països emergents [21]. A nivell mundial, hi ha 1,7 milions de morts a l'any causades per AKI. A partir d'això, al voltant d'1,4 milions es produeixen als països d'ingressos baixos i mitjans [21]. L'AKI sovint es pot prevenir i tractar amb només unes poques conseqüències per a la salut a llarg termini, si n'hi ha cap. La identificació dels principals mecanismes i actors que participen en el desenvolupament de l'IRA es reflectirà en la millora de l'atenció als pacients i la minimització de la mortalitat i la morbiditat.

Hem demostrat un augment significatiu de la concentració de GAL-3 aronyonssotmesos a AKI. També hem demostrat una expressió significativament més alta de GAL-3 en túbuls renals afectats per necrosi tubular aguda en ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí que en túbuls renals del grup control tractat amb solució salina. Tant les concentracions citoplasmàtiques com les nuclears de GAL-3 augmenten significativament als túbuls renals després de l'ATN en comparació amb els ratolins tractats amb solució salina. L'augment del nivell de GAL-3 als túbuls renals lesionats suggereix que GAL-3 és un jugador important en l'ATN.

També hem utilitzat ratolins GAL-3 KO per investigar el paper mecanicista de GAL-3 a ATN. Això ens ajuda a mirar de prop les modulacions de les proteïnes pro-apoptòtiques, pro-necroptòtiques i de supervivència en presència i absència de GAL-3 i determina si GAL-3 té algun efecte o no en aquests canvis. .

Hem demostrat un percentatge significativament més gran de túbuls afectats per ATN en ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí. Els nostres resultats també han demostrat un augment significatiu de la catepsina B i la catepsina D als ronyons afectats per ATN. A més, hi ha nivells significativament més alts de catepsina B i catepsina Dronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí. Les catepsines tenen un paper important en les vies de senyalització que condueixen a la mort de cèl·lules apoptòtiques i necròtiques, degradant diferents substrats i/o contribuint a la desestabilització mitocondrial [22]. Les proteases lisosomals, la catepsina B i la catepsina D s'expressen abundantment als ronyons [23].

La catepsina B, una cisteïna proteinasa que té una activitat òptima en un ambient àcid, participa en molts processos fisiològics i patològics. Digereix proteïnes i enzims estructurals a la cèl·lula, degrada els elements principals de la membrana basal i activa proenzims, hormones i factors de creixement [24]. S'ha observat un augment dels nivells d'expressió i l'activació de la catepsina B a la línia de cèl·lules epitelials tubulars proximals humanes HK-2 sotmeses a apoptosi [25].

La catepsina D s'expressa significativament a les cèl·lules tubulars proximals. La catepsina D és una proteasa aspártica lisosomal clau que és responsable de la degradació de proteïnes i orgànuls per autofàgia-lisosomal, així com durant la necrosi cel·lular i la ruptura de la membrana lisosomal [26]. La catepsina D augmenta significativament en els túbuls lesionats després d'una lesió per isquèmia/reperfusió renal, donant suport a la nostra troballa d'un augment significatiu de la catepsina D enronyonsamb necrosi tubular aguda [27].

Els nivells més alts de catepsina B i D amb un percentatge més alt d'ATNronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí suggereixen GAL-3 com a mediador antinecròtic.

També hem mostrat nivells significativament més alts de proteïnes de necroptosi; RIPK1, RIPK3 i MLKL aronyonsde ratolins tractats amb cisplatí. A més, hem identificat concentracions significativament més altes de RIPK1, RIPK3 i MLKL en ronyons de ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que els ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí.

Els estudis han demostrat que el cisplatí s'associa amb un augment de l'estrès oxidatiu [28]. Generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS), acumulació de productes de peroxidació lipídicaronyons, i es creu que els sistemes antioxidants suprimits són els principals mecanismes de l'AKI induïda per cisplatí [29]. Dins de la cèl·lula, el cisplatí es converteix en una forma altament reactiva que reacciona ràpidament amb molècules antioxidants que contenen tiol com el glutatió [30]. El cisplatí també pot causar disfunció mitocondrial i augmentar la producció de ROS a través d'una cadena respiratòria deteriorada [31]. ROS facilita l'autofosforilació de RIPK1 i promou el reclutament de RIPK -3 i la formació de necrosoma [32]. A més, ROS és un inductor crític de la permeabilitat de la membrana lisosomal (LMP) [33].

Cai et al. [34] han demostrat que la LMP mediada per ROS està implicada en la inducció de necroptosi a les cèl·lules del disc intervertebral de conill. De la mateixa manera, la producció de ROS mitocondrial induïda per RIPK1-la segueix la LMP i la disfunció mitocondrial com a resultat d'un bucle de retroalimentació positiva entre Ca2 plus i JNK, que condueix a la necroptosi de les cèl·lules A549 i H1299 [35, 36].

A més, s'ha demostrat que el RIPK3 regulat a la necroptosi indueix l'estrès del reticle endoplasmàtic que augmenta la concentració cel·lular de Ca2 més i l'expressió de la xantina oxidasa que condueix a la generació de ROS augmentada [37].

Les catepsines B i D són els principals continguts funcionals alliberats dels lisosomes amb un augment de LMP durant el procés de mort cel·lular [34]. L'activació de la catepsina B i D pot augmentar la via necroptòtica [38]. Així, la necroptosi es pot induir de manera independent del receptor [39]. A més, els informes han demostrat que hi ha estímuls addicionals, a part de ROS, catepsina B i D, per a la inducció de necroptosi i aquests inclouen la regulació de la TRAIL i les proteïnes de llegenda FAS [40]. Per tant, l'augment de ROS, ja sigui degut al cisplatí o a la inducció de RIPK1 o RIPK3, pot provocar un augment de la LMP i l'alliberament de catepsina B i D que, al seu torn, augmenten la necroptosi. De la mateixa manera, l'augment de ROS pot activar RIPK1, reclutament de RIPK3, millora de la formació de necrosomes, fosforilació de MLKL, translocació de MLKL fosforilada a la membrana cel·lular que condueix a la mort de les cèl·lules necròtiques mitjançant permeabilització i ruptura de la membrana plasmàtica.

En aquest estudi, creiem que l'augment de ROS, catepsina B, catepsina D, TRAIL i FAS estan implicats en la inducció de necroptosi en ATN.

Per determinar el paper de GAL-3 en la necroptosi, hem mesurat les concentracions de RIPK1, RIPk3 i MLKL en presència i absència de GAL-3 mitjançant GAL-3 salvatge i GAL{{5 }} KO ratolins.

Les concentracions significativament més altes de RIPK1, RIPK3 i MLKL en els ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en els ratolins GAL-3 tractats amb cisplatí indiquen que l'eliminació de GAL-3 s'associa amb un augment significatiu de les proteïnes de la necroptosi, cosa que suggereix un paper antinecroptòtic de GAL-3.

A més, hem mostrat nivells significativament més alts de proteïnes pro-apoptòtiques; caspasa escindida-3, PARP, TRAIL, FAS i cossos apoptòtics escinditsronyonsseguint ATN.

Durant l'ATN, la permeabilització de la membrana lisosomal permet la translocació de la catepsina D i la catepsina B del lisosoma al citosol on pot exercir la seva funció pro-apoptòtica. La catepsina citosòlica D escinda la proteïna Bid a tBid provocant la inserció de la proteïna Bax a la membrana mitocondrial. Això condueix a l'alliberament del citocrom c dels mitocondris al citosol i l'activació de les pro-caspases 9 i 3 [41]. En aquest estudi, tant la tinció immunofluorescent com la concentració de proteïnes han mostrat una expressió significativament més alta de GAL-3 intracel·lular, tant fraccions citoplasmàtiques com nuclears, en ATN enronyonsde ratolins salvatges GAL-3 en comparació amb els ratolins control.

Així, els nivells més alts de proteïnes pro-apoptòtiques; va escindir caspasa-3, TRAIL, FAS i cossos apoptòticsronyonsde ratolins GAL-3 KO tractats amb cisplatí que en ratolins salvatges GAL-3 tractats amb cisplatí suggereix un paper antiapoptòtic de GAL-3. S'ha trobat que GAL-3 està implicat de manera crítica en l'apoptosi depenent de la seva localització subcel·lular. Els estudis han demostrat que el GAL-3 intracel·lular pot inhibir l'apoptosi [42-44]. En suport del paper anti-apoptòtic de GAL-3, hem identificat un nombre significativament més gran de cèl·lules que expressen proteïnes fosfo-NF-κB, beta-catenina i Wnt als ronyons de GAL tractats amb cisplatí{{15} } ratolins salvatges que els ratolins GAL-3 KO. NF-κB és un factor de transcripció que juga un paper important en la regulació de la inflamació, la proliferació cel·lular i la supervivència cel·lular. La fosforilació té un paper crític en l'activació de NF-κB aigües avall de tots aquests estímuls [45]. Ara NF-κB es reconeix com un important contribuent a la supervivència cel·lular i la protecció de l'apoptosi [46]. S'ha demostrat que les proteïnes Wnt tenen efectes protectors sobre les cèl·lules lesionades mitjançant la seva funció anti-apoptòtica mitjançant l'activació de -catenina i c-Myc [47].

Wu et al. també han mostrat un augment significatiu de p-NF-κB aronyonsamb ATN [48]. Wang et al. també han demostrat una regulació positiva de la via de senyalització Wnt/-catenina en lesions renals agudes [49]. Els estudis han demostrat que NF-κB està implicat en la inducció de GAL-3 [50], així com GAL-3 està implicat en l'activació de NF-κB [51]. Curiosament, s'ha trobat que GAL-3 és un nou soci d'unió de -catenina [52].

Aquestes troballes suggereixen que el paper anti-apoptòtic de GAL-3 també es pot mediar mitjançant l'activació de les vies NF-κB i Wnt/-catenina. GAL-3 sembla enllaçar aquestes vies de transducció de senyals favorables a la supervivència investigades al nostre estudi. Aquestes vies també tenen interferències entre elles a diversos nivells. Els jugadors de la via Wnt/-catenina modulen molts dels seus efectes mitjançant la interacció amb NF-κB i recíprocament NF-κB també influeix en la via de senyalització Wnt/-catenina [53]. Per tant, és comprensible que GAL-3 tingui un paper de connector central en les vies de transducció del senyal de supervivència.

El nostre estudi demostra que la presència o absència de GAL-3 intracel·lular està associada a canvis significatius en les proteïnes proapoptòtiques, pronecroptòtiques i de supervivència en l'ATN induïda per cisplatí i que els nivells elevats de GAL-3 als túbuls renals són mediant un entorn antiapoptòtic, antinecroptòtic i de supervivència que pot donar forma al curs futur de la malaltia. Això suggereix un paper protector de GAL-3 en l'ATN induït per cisplatí agut, que està recolzat per nivells plasmàtics significativament més baixos d'urea i creatinina en ratolins tractats amb cisplatí GAL-3 salvatge que GAL-3 Ratolins tractats amb cisplatí KO (Fig. 13).

Conclusió

GAL-3 pot afectar la supervivència i la mort cel·lular mitjançant la seva interacció amb proteïnes necroptòtiques, apoptòtiques i pro-supervivència dels túbuls renals durant la necrosi tubular aguda induïda pel cisplatí.

Agraïments

Aportacions de l'autor

Tots els autors van revisar i aprovar la versió enviada del manuscrit. SA va introduir el concepte, dissenyar l'estudi, analitzar i interpretar les dades, dissenyar les xifres i redactar el document. GJ va realitzar experiments amb animals i tècnica ELISA, MS va realitzar tincions immunohistoquímices i immunofluorescents i processament de teixits relacionats. HT va realitzar experiments amb animals i tècnica ELISA. JY va realitzar una anàlisi bioquímica de la funció renal i va enviar les dades obtingudes.

Declaració de divulgació

Els autors declaren no tenir interessos en competència.

Referències

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Lesió renal aguda: una preocupació global creixent. Lancet 2013;382:170-179.

2 KDIGO: Guia de pràctica clínica per a la lesió renal aguda. Kidney Int 2012;2:1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Evidència morfològica, bioquímica i molecular d'apoptosi durant la fase de reperfusió després de breus períodes d'isquèmia renal Am J Pathol 1992;140:831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptosi en lesions d'isquèmia/reperfusió d'al·lografts renals humans. Trasplantament 1998;66:872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Inhibidor químic de la mort de cèl·lules no apoptòtiques amb potencial terapèutic per a lesions cerebrals isquèmiques. Nat Chem Biol 2005;1:112–119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Mecanismes moleculars de la necroptosi: una explosió cel·lular ordenada. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700–714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Song Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: la translocació de proteïnes semblants al domini de llinatge cinasa mixt a la membrana plasmàtica condueix a cèl·lules necròtiques mort. Cell Res 2014;24:105–121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: La translocació de la membrana plasmàtica de la proteïna MLKL trimeritzada és necessària per a la necroptosi induïda per TNF. Nat Cell Biol 2014;16:55–65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: un profàrmac polimèric de cisplatina basat en pullulan per a la teràpia dirigida contra el carcinoma hepatocel·lular. Int J Pharm 2015;483:89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Nefrotoxicitat del cisplatí: mecanismes i estratègies renoprotectores. Kidney Int 2008;73:994–1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: Els efectes protectors del maltol sobre la nefrotoxicitat induïda per cisplatí a través de les vies de senyalització PI3K/Akt i p53 mediades per AMPK. Ciència Rep 2018;8:15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: Fisiopatologia de la lesió renal aguda induïda per cisplatí. Biomed Res Int 2014;2014:1–17.

13 Hughes RC: Secreció de la família de les galectines de proteïnes d'unió a carbohidrats de mamífers. Biochim Biophys Acta 1999;1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Funcions intracel·lulars de les galectines. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: L'alteració del patró d'expressió citoplasmàtic/nuclear de la galectina-3 es correlaciona amb la progressió del carcinoma de pròstata. Int J Cancer 2000;89:361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: regulació de l'apoptosi induïda per galectina-3-de cèl·lules Jurkat tant per O-glicans com per N-glicans al CD45. FEBS Lett 2013;587:3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: La sobreexpressió de galectina-3 protegeix de l'apoptosi millorant les propietats d'adhesió cel·lular. Int J Cancer 2000;85:545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: la galectina -3 inhibeix l'apoptosi induïda per lligands que indueix l'apoptosi relacionada amb el factor de necrosi tumoral activant Akt a la bufeta humana. cèl·lules de carcinoma. Cancer Res 2005;65:7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: La galectina-3 s'expressa al miocardi molt primerenc després d'un infart de miocardi. Cardiovasc Pathol 2015;24:213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 media el tubular renal Apoptosi de cèl·lules epitelials en lesió renal aguda induïda per endotoxines. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: accés mundial al tractament per a la malaltia renal en fase terminal: una revisió sistemàtica. Lancet 2015;385:1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: senyalització de proteases en la mort cel·lular: caspases versus catepsines de cisteïna. FEBS Lett 2007;581:2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Alliberament d'enzims lisosòmics en ronyons de gos perfusos hipodèrmicament. Cryobiology 1984;21:521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: La fracció de catepsina B activa a un pH fisiològic de 7,5 té una importància pronòstica en el carcinoma de cèl·lules escamoses del pulmó humà. Br J Cancer 1997;75:1137–1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: Participació de la catepsina B en l'apoptosi induïda per emodina a HK-2 Cèl · lules. Toxicol Lett 2008;181:196–204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: La manca de catepsina D a les cèl·lules tubulars proximals renals va provocar un augment de la sensibilitat contra la lesió per isquèmia/reperfusió renal. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Insuficiència renal aguda. Lancet 2005;365:417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: El cisplatí genera estrès oxidatiu que va acompanyat de canvis ràpids en el metabolisme central del carboni. Ciència Rep 2018;8:4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Efectes de diferents dosis d'oxigen hiperbàric sobre la nefrotoxicitat induïda per cisplatí. Insuficiència renal 2007;29:257–263.

30 Siddik ZH: Cisplatina: manera d'acció citotòxica i base molecular de resistència. Oncogen 2003;22:7265–7279.