Part 1: L'oligosacàrid de llet humana 2/-fucosil·lactosa indueix la neuroprotecció de l'ictus d'hemorràgia intracerebral

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 i Seong-Jin Yu1*

1Centre d'Investigació Neuropsiquiàtrica, National Health Research Institutes, Zhunan 35053, Taiwan;

pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);

baee@nhri.edu.tw (E.-KB)

2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Corea; yhsong@aptech.biz (YS);

jongwon.yoon91@gmail.com (JY)

Correspondència: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: més 886-37206166 (ext. 36710)

Resum:

L'hemorràgia intracerebral (ICH) es produeix quan els vasos sanguinis cerebrals es trenquen, provocant inflamació i mort cel·lular. 2-La fucosil·lactosa (2FL), un oligosacàrid de la llet humana, té potents efectes antiapoptòtics i antiinflamatoris. L'objectiu d'aquest estudi era examinar l'efecte protector de 2FL en models cel·lulars i de rosegadors d'ICH. L'hemin es va afegir a una cortical primària de rataneuronali cocultiu de microglia BV2 per simular ICH in vitro. Les immunoreactivitats IBA1 i MAP2 es van utilitzar per determinar la inflamació ineuronalsupervivència. L'hemina va augmentar significativament IBA1, mentre que va reduir la immunoreactivitat de MAP2. 2FL va antagonitzar significativament ambdues respostes. A continuació, es va examinar l'efecte protector de 2FL en un model ICH de rata. L'administració intracerebral de col·lagenasa tipus VII va reduir l'activitat locomotora a camp obert. El posttractament precoç amb 2FL va millorar significativament l'activitat locomotora. Es van recollir teixits cerebrals per a la immunohistoquímica i l'anàlisi qRT-PCR. 2FL va reduir la immunoreactivitat IBA1 i CD4 a l'estriat lesionat. 2FL va regular a la baixa l'expressió dels marcadors d'estrès ER (PERK i CHOP), mentre que va regular els marcadors de macròfags M2 (CD206 i TGF) al cervell lesionat. En conjunt, les nostres dades donen suport que 2FL té unneuroprotectorefecte contra la ICH mitjançant la inhibició deneuroinflammaciói estrès ER. 2FL pot tenir implicacions clíniques per al tractament de l'HIC.

Paraules clau: 2-fucosil·lactosa; hemorràgia intracerebral ictus; inflamació; reticle endoplàsmic

efectes de l'extracte de cistanche: tractar les neuromalalties

Si us plau, feu clic aquí per a la part 2

1. Introducció

L'hemorràgia intracerebral (HIC) és una importantneurològictrastorn associat a un alt risc de mort en adults [1,2]. ICH constitueix el 10-15 per cent de tots els casos d'ictus agut [3]. Alguns estudis epidemiològics han donat suport a les disparitats de gènere en pacients amb ICH [4] o malalties cerebrovasculars [5]. Una petita part dels pacients amb ICH desenvolupa la síndrome lacunar hemorràgica [6]. El tractament actual de l'HIC se centra a controlar l'hemorràgia, eliminar el coàgul de sang i alleujar la pressió intracranial causada per l'hemorràgia. No hi ha cap teràpia farmacològica eficaç per a la HIC.

La inflamació té un paper crític en la ICH induïdaneurodegeneració. Després de l'aparició de l'HIC, les cèl·lules sanguínies entren al parènquima cerebral, activen la microglia i inicien la producció de citocines proinflamatòries [7,8]. Hemin, un subproducte de l'hemoglobina, provocaneuronalmort i indueix apoptosi i inflamació [9,10]. Diversos estudis han recolzat l'eficàcia del tractament antiinflamatori en models animals d'HIC [11,12]. Recentment hem demostrat que el posttractament precoç amb un antagonista de CXCR4 CX807 va inhibir la inflamació i va millorar la funció conductual en rates experimentals ICH [13]. Aquestes dades suggereixen que la teràpia antiinflamatòria pot reduir el dany cerebral

després de l'ICH.

La llet materna humana conté nutrició i diversos ingredients bioactius crítics [14], per exemple, oligosacàrids de la llet humana (HMO) [15]. La 2′-fucosil·lactosa (2FL) és un oligosacàrid important de la llet humana. El lliurament oral de 2FL ha milloratmemòriai aprenentatge en rates [16,17]. A més, 2FL va suprimir l'expressió de CD14 induïda per lipopolisacàrids i la inflamació als enteròcits humans [18]. Recentment vam informar que 2FL es va mitigarneuroinflammacióen un cervell que pateix un ictus isquèmic [19]. Aquestes dades suggereixen que 2FL és un potent agent antiinflamatori i, per tant, pot ser útil per al tractament de l'HIC.

L'objectiu d'aquest estudi era examinar les accions protectores neuronals de 2FL en models cel·lulars i animals d'ICH. L'hemin es va utilitzar per simular ICH en cultiu cel·lular [20]. Hem demostrat que 2FL antagonitzava l'activació de la microglia mediada per l'hemina. La col·lagenasa de tipus VII es va utilitzar per generar ICH focal en rates adultes [13]. Vam trobar que 2FL va mitigar significativament l'activació de la microglia induïda per ICH, la infiltració de CD4 més limfòcits i l'estrès ER al cervell lesionat i va millorar la funció conductual. Les nostres dades donen suport que 2FL té unneuroprotectorefecte contra ICH.

efectes de l'extracte de cistanche

2. Resultats

2.1. 2FL Neurodegeneració mediada per hemina reduïda en neurones corticals primàries i cocultura de microglia BV2

L'efecte protector de 2FL es va examinar per primera vegada en un model cel·lular d'una hemorràgia cerebral. Cortical primàrianeuronali els cocultius de microglia BV2 es van tractar amb hemina (10 uM) durant 48 h (vegeu la línia de temps a la figura 1E). Hemin atenuatneuronalmarcador MAP2 (figura 1A), mentre que augmentava el marcador de microglia IBA1 (figura 1B). Aquestes respostes van ser antagonitzades per 2FL (1 uM, figura 1A, B). Les immunoreactivitats de MAP2 i IBA1 es van analitzar encara més mesurant la densitat de píxels de marcadors específics. Com es veu a la figura 1C, D, l'hemina va reduir significativament la immunoreactivitat de MAP2 (Map2-ir) i va augmentar IBA1-ir (p <0).00 1,="" anova="" unidireccional,="" n="6" a="" cada="" grup).="" aquestes="" respostes="" van="" ser="" antagonitzades="" significativament="" per="" 2fl="" (map2:="" p=""><0,001, f2,="" 14="115.863;" iba1:="" p=""><0,001, f2,="" 15="134,644," anova="">

F

Figura 1. Elneuroprotectorefecte de 2FL en una cortical primàrianeuronai cocultiu de microglia BV2. (A) Les fotomicrografies representatives demostren que l'hemina va reduir la immunoreactivitat de MAP2 (-ir). La coadministració amb 2FL va antagonitzar la pèrdua de MAP-ir mediada per hemina. (B) Hemin va augmentar IBA1-ir. Coadministració amb 2FL reduït IBA1-ir. (C,D) La densitat de píxels de MAP2-ir o IBA{{10}}ir es va analitzar mitjançant el programari NIS Elements AR 5.11. (C) 2FL va antagonitzar significativament la pèrdua de MAP2-ir mediada per hemina. (D) 2FL va atenuar significativament l'activitat IBA1 induïda per l'hemina. (E) Cronologia de l'experiment. * p < 0,05.="" barra="" d'escala="100">

benefici de l'extracte de cistanche

2.2. Posttractament amb 2FL Activitat locomotora millorada en rates ICH

A continuació, es va examinar l'efecte protector de 2FL en un model animal d'ICH. A un total de 14 rates mascles adults se'ls va administrar estereotàcticament una dosi baixa (0,5 unitats/uL × 1 uL) de col·lagenasa tipus VII per induir una hemorràgia cerebral a l'estriat dret. 2FL (400 mg/kg/d, ip, n=7) o vehicle (salina, ip, n=7) ​​es va administrar diàriament durant 5 dies, començant 1 dia després de l'ictus (vegeu la línia de temps a Figura 2G). Aleshores, 2 hores després de l'última injecció de 2FL o vehicle el dia 5, els animals es van col·locar individualment en cambres d'activitat infraroja durant 30 min. Es va examinar el comportament locomotor a camp obert durant 30 min. Vam trobar que 2FL va augmentar significativament l'activitat vertical (VACTV, figura 2A), la distància total recorreguda (TOTDIST, figura 2B), el temps vertical (VTIME, figura 2C), l'activitat horitzontal (HACTV, figura 2D), el temps de moviment (MOVTME, figura 2E). ), i el número de moviment (MOVNO, figura 2F). Les estadístiques detallades (ANOVA bidireccional més proves post hoc de Newman-Keuls (NK)) es mostren a la taula 1.

Figura 2. El posttractament amb 2FL millora les funcions neuronals en rates ICH. Les rates adultes van ser tractades amb col·lagenasa tipus VII a D0 (G, cronologia). 2FL o vehicle es va donar sistemàticament diàriament durant 5 dies. El comportament locomotor es va examinar el D5. 2FL va millorar significativament (A) activitat vertical, (B) distància total recorreguda, (C) temps vertical, (D) activitat horitzontal, (E) temps de moviment i (F) moviment

nombre. n {{0}} a cada grup. * p <0.05, anova="" bidireccional;="" #="" p=""><0,05, prova="" nk="" post="">

Taula 1. Diferències significatives en els comportaments locomotors entre ICH més veh i ICH més 2FL.

2.3. Posttractament precoç amb activació microglial reduïda de 2FL a la regió perilesionada

Vuit rates ICH (2FL, n=4; Veh, n=4) van ser sacrificades i perfusades per a la immunohistoquímica IBA1 després de la prova de comportament el dia 5. L'IBA1-ir típic es mostra a la figura 3. L'IBA1-ir es va millorar a la zona perilesionada de l'estriat (figura 3B), en comparació amb els llocs corresponents a l'estriat no lesionat contralateral (figura 3A) en rates d'ictus que rebien veh. Amb una gran magnificació, es van trobar cèl·lules microglials desramificades o ameboides a la zona lesionada (figura 3B, insert), mentre que la microglia en repòs que presentava una morfologia ramificada es va trobar a l'estriat no lesionat (figura 3A, insert). El tractament amb 2FL va reduir IBA1-ir i va restaurar parcialment la ramificació morfològica de la micròglia (figura 3C, insert). IBA1-ir es va quantificar i es va fer una mitjana en tres seccions cerebrals consecutives amb una comissura anterior visualitzada en tots els animals. 2FL va reduir significativament l'IBA1-o al cervell ICH (figura 3D, p <0.001, f2,="" 12="50.357," anova="">

Figura 3. La 2FL després del tractament precoç va reduir l'activació de la microglia a l'estriat lesionat. Els animals van rebre vehicle o 2FL després de la injecció de col·lagenasa dels dies 1 al 5. Els animals van ser sacrificats el dia 5. Es va trobar una immunoreactivitat IBA1 millorada amb morfologia desramificada a l'estriat lesionat (B vs. A). El tractament amb 2FL va reduir la immunoreactivitat de l'IBA (C vs. B). (D) 2FL va reduir significativament la immunoreactivitat IBA1 al cervell lesionat. * p <0,05, anova="" unidireccional="" més="" prova="">

2.4. 2FL CD4 mitigada més infiltració de limfòcits al cervell lesionat

L'administració de col·lagenasa millora la infiltració de CD4 més limfòcits a l'estriat lesionat (figura 4B). Gairebé no es van trobar cèl·lules CD4 a l'estriat no lesionat (figura 4A). La infiltració de cèl·lules CD4 a l'estriat lesionat es va mitigar amb el tractament 2FL (figura 4C vs. figura 4B; p <{9}}.001, f2,="" 6="173.485," anova="" unidireccional,="" figura="">

Figura 4. Posttractament amb 2FL reduït CD4 més infiltració de limfòcits al cervell lesionat. Les fotomicrografies representatives demostren la immunoreactivitat de CD4 a (A) l'estriat no lesionat i (B) l'estriat lesionat d'un vehicle receptor de rata amb una magnificació baixa (calibració=50 um) i alta (inserció, calibració=10). um), així com (C) l'estriat lesionat d'una rata que rep 2FL. (D) 2FL va reduir significativament el CD{{10}}ir al cervell lesionat (* p <0, 001,="">

manera ANOVA).

2.5. 2FL va alterar de manera diferencial l'expressió dels marcadors inflamatoris M1 i M2 en cervells ICH

Els teixits estriatals es van recollir de vuit rates (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) el dia 5. Es va examinar l'expressió dels marcadors inflamatoris M1/M2 mitjançant qRT-PCR. ICH va augmentar significativament l'expressió del marcador M1 CD86 (figura 5A, p=0.005) i dels marcadors M2 CD206 i TGF (figura 5B, C, p=0.005). 2FL no va alterar l'expressió de CD86 (figura 5A, p=0.356, ANOVA bidireccional). Tanmateix, va augmentar significativament l'expressió de CD206 (figura 5B) i TGF al costat lesionat (p <0, 05,="" prova="">

benefici de l'extracte de cistanche

2.6. 2FL va alterar l'expressió de l'estrès ER i els marcadors apoptòtics als cervells ICH

L'expressió de l'estrès ER i els marcadors apoptòtics es va examinar en vuit rates (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL va reduir significativament l'expressió de PERK (Figura 6A, p=0.016), IRE1 (Figura 6B, p=0.018), CHOP (Figura 6C, p=0.032) i SigmaR1 (Figura 6D, p=0.017) a l'estriat lesionat. 2FL no va alterar l'expressió de BIP (Figura 6E, p=0.841) i ATF6 (Figura 6F, p=0.403). A més, l'expressió de caspasa3 es va reduir significativament per 2FL (figura 6G, p=0.029, prova t).

Figura 5. 2FL va regular l'expressió dels marcadors M2 en cervells ICH. ICH va augmentar significativament l'expressió del marcador (A) M1 CD86 i dels marcadors M2 (B) CD206 i (C) TGF (# p=0.005, bidireccional ANOVA). (A) 2FL va regular significativament l'expressió de (B) CD206 i (C) TGF, però no (A) CD86, a l'estriat lesionat (* p <0, 05,="" prova="">

Figura 6. 2FL va suprimir l'expressió d'estrès ER i marcadors apoptòtics. L'expressió de (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 i (G) caspasa3 va ser inhibida significativament per 2FL en cervells hemorràgics. L'expressió de (E) BIP i (F) ATF6 no va ser alterada per 2FL. * p < 0.05.="" er,="" reticle="" endoplasmàtic;="" perk,="" proteïna="" quinasa="" r-like="" er="" kinase;="" ire1,="" enzim="" 1="" que="" requereix="" inositol;="" chop,="" proteïna="" homòloga="" d'unió="" a="" la="" proteïna="" potenciadora="" de="" ccaat;="" sigmar1,="" receptor="" sigma="" 1;="" atf6,="" activant="" el="" factor="" de="" transcripció="">

suplement de cistanche