PART 1 Preparació i avaluació del lliurament transdèrmic basat en microemulsió de glucòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3* i et al.

Resum.

L'objectiu principal del present estudi era desenvolupar una nova formulació de microemulsió (ME) per oferirglucòsid feniletanoide de cistanche(PG) per al seu ús en clarificadors de la pell i protectors solars. La fase d'oli es va seleccionar en funció de la solubilitat del fàrmac, mentre que el tensioactiu i el cosurfactant es van seleccionar i es van seleccionar en funció de la seva capacitat de solubilització i l'eficiència amb què van formar ME. Es van construir diagrames de fases pseudoternàries per avaluar les regions ME i es van seleccionar cinc formulacions de ME d'oli en aigua com a vehicles. Es van realitzar experiments de penetració de la pell in vitro per optimitzar la formulació de ME i avaluar-ne la permeabilitat en comparació amb la de la solució salina. Les propietats fisicoquímiques del ME optimitzat i la capacitat de permeabilitat del PG(glicòsid feniletanoide de cistanche) lliurats per aquest ME també van ser investigats. La formulació de ME optimitzada estava composta per miristat d'isopropil (7 per cent, p/p), Cremorfor EL (21 per cent, p/p), propilenglicol (7 per cent, p/p) i aigua (65 per cent, p/p). La quantitat acumulada de PG(glicòsid feniletanoide de cistanche) el que va penetrar a través de la pell del ratolí extirpada quan el portava ME era aproximadament 1, 68 vegades més que quan el PG només es transportava amb solució salina. La quantitat acumulada de PG a la microemulsió (4149,650±37,3 µg·cm{-2) va ser significativament més gran que la de PG a la solució salina (2288,63±20,9 µg·) cm-2). A més, el coeficient de permeabilitat va indicar que la microemulsió optimitzada era un portador més eficient per al lliurament transdèrmic de PG que la solució de control (8,87±0,49 cm/hx10-3 vs. 5,41±0,12 cm/hx10-3). En conjunt, la capacitat de penetració de la PG transportada per ME es va augmentar significativament en comparació amb la solució salina.

cistanche

Introducció

herba cistanche,una herba tònica distribuïda habitualment a les regions desèrtiques, s'ha utilitzat freqüentment en la medicina tradicional xinesa. Fins ara, s'han realitzat múltiples estudis per investigar les seves propietats biofarmacèutiques, com ara la millora de la memòria, la potència sexual, l'eliminació de radicals lliures i l'activitat anti-envelliment (1). El component principal de H. cistanche ésglucòsid feniletanoide (PG). Estudis anteriors han revelat que la PG inhibeix l'activitat de la tirosinasa, l'enzim que limita la velocitat per a la síntesi de melanina en el cos humà (2). A més, PG(glicòsid feniletanoide de cistanche) S'ha informat que és responsable de l'eliminació de radicals 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (3) i de la protecció dels queratinòcits de la radiació ultraviolada (UV). Per tant, aquest component pot tenir potencial en la despigmentació de la pell. La medicació tòpica s'ha utilitzat habitualment en els camps cosmètics, amb el fàrmac lliurat directament a la superfície corporal (4). Les microemulsions (ME) són un nou sistema de lliurament de fàrmacs compost convencionalment per oli, tensioactiu, cosurfactant i fases aquoses (5) i s'ha informat que milloren la velocitat i l'absorció de fàrmacs lipòfils (6). A més, a causa de la seva solubilitat satisfactòria, baixa irritació de la pell i alta permeabilitat, s'espera que s'utilitzi en el lliurament de fàrmacs tòpics (7,8). Segons el que sabem, s'han realitzat pocs estudis on PG es va lliurar mitjançant medicaments tòpics mitjançant microemulsió. En el present estudi, es va establir un sistema de lliurament de nanoemulsió d'oli en aigua (O / W) per a l'administració transdèrmica i es va incorporar PG a la nanoemulsió (9, 10). Mentrestant, es va realitzar la preparació i caracterització de la nanoemulsió basada en PG investigant l'alliberament transdèrmic in vitro.

Materials i mètodes Reactius.

Cremorphor EL i miristat d'isopropil (IPM) es van comprar a Sigma Aldrich; Merck Millipore (Darmstadt, Alemanya). L'etanol, l'àcid oleic (OA) i el Tween-80 es van comprar a Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Xina). L'oleat d'etil es va comprar a Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Xangai, Xina). Tots els productes químics i dissolvents utilitzats eren de grau de reactiu analític. Preparació i avaluació del lliurament transdèrmic basat en microemulsió de glucòsids feniletanoides Cistanche tubulosa JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1, MEI WANG2 i JUMPING HU{{{9} } Departament de Farmàcia, El Primer Hospital Afiliat; 2 Departament de Medicina Natural, Facultat de Farmàcia, Universitat Mèdica de Xinjiang, Urumqi, Xinjiang 830011; 3 Departament de Farmàcia, Hospital Kanghua, Dongguan, Guangdong 523003, PR Xina Rebut el 2 de desembre de 2015; Acceptat el 29 de novembre de 2016, DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Correspondència a: Dr. Junping Hu, Departament de Medicina Natural, Facultat de Farmàcia, Universitat Mèdica de Xinjiang, 393 Xinyi Road, Urumqi, Xinjiang 830011, PR Xina Correu electrònic: hujp: 0551 @yeah.net * Va contribuir de la mateixa manera Paraules clau: glucòsid feniletanoide, microemulsió, lliurament transdèrmic, alleugeriment de la pell, protector solar yang et al: PG BASAT EN ME PER A APLICACIÓ COSMÈTICA 1110 Preparació de PhG. PhG(glicòsid feniletanoide de cistanche) es va preparar tal com es descriu habitualment (11).

L'assecat a l'aireC. tubulosaes va alimentar i es va extreure per percolació amb un 80 per cent d'EtOH. El percolat es va evaporar a pressió, seguit de la filtració del fluid residual. El filtrat es va concentrar i es va cromatografiar en una columna de resina macroporosa SP-825 utilitzant 0, 30, 50, 70 i 90 per cent d'EtOH en aigua com a eluents. Els eluents EtOH del 30-50 percentatge es van concentrar i es van assecar per obtenir una fracció rica en PhG. L'espectrofotometria UV va indicar el contingut del PhG(glicòsid feniletanoide de cistanche) era del 87,6 per cent. Detecció d'olis, tensioactius i cotensioactius per a ME. Es van realitzar proves de solubilitat per seleccionar components adequats per a la preparació d'una formulació de ME amb una alta capacitat de càrrega de fàrmacs. En aquest procés, es va afegir una quantitat excessiva de PG a 4 ml de cadascun dels reactius següents: IPM, parafina líquida, OA, Cremophor EL, Tween-80, etanol absolut, propilenglicol, glicerina i PEG400. , respectivament. Després d'això, la barreja resultant es va agitar recíprocament a 37 °C durant 72 h, seguida de centrifugació a 12.830 xg durant 10 min. Posteriorment, el pellet es va tornar a suspendre en metanol i es va determinar el PG mitjançant espectrofotometria UV a 333 nm. Les solucions diluïdes adequades d'olis, tensioactius i codisolvents en metanol van servir com a control en blanc. Construcció del diagrama de fases. Per obtenir un rang de concentració de components per al límit de la microemulsió existent, es van construir diagrames de fase pseudoternaris mitjançant un mètode de valoració d'aigua tal com es va descriure anteriorment (12). Es van preparar diagrames trifàsics amb proporcions de pes 1:3, 1:1 i 3:1 de tensioactiu a cosurfactant. La fase d'oli i la barreja de tensioactius es van barrejar a les proporcions de pes d'1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 i 9:1. . La barreja d'oli i tensioactiu es van barrejar de manera homogènia i es van diluir gota a gota amb aigua purificada sota agitació magnètica (300 rpm) a temperatura ambient fins que es va obtenir ME transparent. Es va registrar la concentració de components per completar el diagrama de fase pseudoternària. A partir d'aquests diagrames, es van seleccionar les concentracions adequades de materials per a la preparació de ME basat en PG. Preparació de ME i la solució aquosa de PG. Es van seleccionar un total de 5 ME (ME1-5) segons els diagrames de fases amb una relació de pes tensioactiu: cosurfactant de 3:1 (taula I). Es van preparar sistemes de microemulsió barrejant oli amb la barreja de tensioactiu i cotensioactiu, i es va afegir aigua amb precisió a les fases oleoses amb agitació magnètica (300 r/min) a 37 °C. Els sistemes es van equilibrar mitjançant una suau agitació magnètica durant 30 min seguida de la dissolució de la quantitat adequada de PG sota ultrasons. La solució aquosa es va preparar amb el mateix contingut de PG dissolt en aigua purificada. Caracterització de la microemulsió. La mida mitjana de les gotes i l'índex de polidispersitat dels ME es van avaluar mitjançant espectroscòpia de correlació de fotons (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Regne Unit). Totes les mostres es van diluir amb aigua en una proporció 1:5 i es van filtrar a través d'un filtre de 0,22 µm. La prova es va realitzar en una cambra termostàtica a 25˚C per triplicat. La morfologia de les microemulsions de PG es va observar mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Tòquio, Japó). Breument, es va dipositar una gota de mostra diluïda sobre una graella de coure recoberta de pel·lícula, seguida de la tinció amb una gota de solució aquosa d'àcid fosfotúngstic al 2%.

Els diàmetres de gotes mitjans de les microemulsions es van determinar mitjançant un instrument d'espectroscòpia de correlació de fotons (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, EUA) a temperatura ambient. La viscositat dels vehicles ME es va mesurar a 25˚C, utilitzant el viscosímetre digital NDJ-8S (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Xangai, Xina) amb un núm. 1 rotor posat a 60 rpm. Determinació del pH. Els valors de pH dels ME es van determinar a 25 °C mitjançant l'acidímetre digital Phs-3C (Shanghai REX Instruments Factory, Xangai, Xina). Els índexs de refracció es van mesurar amb un refractòmetre Abbe termostàtic (Optical Instrument Factory, Xangai, Xina). Preparació dels teixits de la pell. Els ratolins Kunming mascles que pesen 20 g es van comprar al Centre d'Animals Experimentals de la Universitat Mèdica de Xinjiang (Xinjiang, Xina). 10 ratolins (6 setmanes d'edat) van ser sotmesos a alimentació adaptativa durant 1 setmana en un cicle de 12 h de llum/12 h de foscor, a temperatura ambient (24±2˚C), amb una humitat del 50±15 per cent. Tots els animals tenien accés a una dieta estàndard i aigua. El cabell es va treure amb una talladora elèctrica. Després de l'anestèsia terminal amb hidrat de cloral (10 per cent) mitjançant injecció subcutània, es van extirpar teixits de la pell de la regió abdominal i es van eliminar el greix subcutani i el teixit connectiu. Els teixits es van col·locar a la nevera a 4ºC durant la nit. Els protocols d'estudi van ser aprovats pel Comitè Ètic de la Universitat Mèdica de Xinjiang (Xinjiang, Xina). Estudi de permeació in vitro. Els experiments de permeació es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment (12). La pell extirpada es va fixar entre el donant i la cambra receptora d'una cèl·lula de difusió vertical amb una àrea de difusió efectiva de 2,8 cm2. La cambra del receptor es va omplir amb solució salina normal i fresca. La cèl·lula de difusió es va mantenir a 37 °C mitjançant un bany d'aigua de recirculació i la solució a les cambres del receptor es va agitar contínuament a 200 rpm. Després d'això, la formulació de prova (1,0 ml) es va col·locar suaument a la cambra del donant. Posteriorment, es van retirar 3 ml de la solució a la cambra del receptor i es van substituir per un volum igual de solució salina normal fresca a intervals predeterminats (0, 2, 4, 6, 8, 10 i 24 h). La mostra obtinguda de la cambra receptora es va utilitzar per determinar PG(glicòsid feniletanoide de cistanche)nivells mitjançant espectroscòpia UV a una longitud d'ona de 333 nm. La quantitat acumulada de PG que va penetrar a través de la pell del ratolí extirpada es va calcular segons la fórmula següent:

On Qn era la quantitat acumulada en un moment determinat t, Cn és la concentració de fàrmac de la solució receptora a cada temps de mostreig, Ci és la concentració de fàrmac de la mostra, S és l'àrea de difusió efectiva (S{{0 }},8 cm2), i V0 i Vi són els volums de la solució receptora i de la mostra, respectivament. La quantitat acumulada (Qn) de PG(glicòsid feniletanoide de cistanche)impregnat es va representar en funció del temps (t) per a cada formulació. La taxa de permeació de PG en estat estacionari (Jss, µg/cm-2 /h-1) a través de la pell del ratolí es va calcular a partir del pendent de la part lineal de les trames del temps Qnversus. El coeficient de permeabilitat (Kp, cm/h) es va calcular segons la fórmula següent:

On Kp és el coeficient de permeabilitat, Jss és l'eflux calculat en estat estacionari i C0representa la concentració de fàrmac que es va mantenir constant al vehicle. Estudi de retenció de pell. Les seccions següents detallen la comparació del comportament de permeació ex vivo, la quantitat acumulada, la taxa de permeabilitat, el coeficient de permeabilitat i les característiques de retenció de la pell entre les formulacions de ME optimitzades (contingut de PG, 2 per cent, p/p) i la solució aquosa. Al final de l'experiment de permeació, es va determinar el nivell de fàrmac residual a la pell mitjançant un mètode d'homogeneïtzació. Després del rentat amb solució salina normal, la pell es va tallar en petites seccions i es va col·locar en un tub de vidre que contenia 3 ml de metanol en un bany de gel. La mostra es va homogeneïtzar amb una velocitat de 12000 r/min. rpm durant 2 min, i després es centrifuga a 12.830 xg horitzontalment durant 30 min a 25 °C. El sobrenedant es va fer passar per un filtre microporós (0,45 µm) i el PG(glicòsid feniletanoide de cistanche)Els nivells del sobrenedant es van determinar mitjançant espectroscòpia UV a una longitud d'ona de 333 nm. Estudi d'estabilitat. L'estabilitat física del ME carregat amb PG es va investigar mitjançant la claredat, l'anàlisi de la mida de les partícules i la separació de fases, que es va observar a 2-8˚C i a temperatura ambient durant 3 mesos. La centrifugació es va realitzar a 12.830 xg durant 30 min a 25 °C per avaluar l'estabilitat física de ME. La separació de fases i la concentració de PG es van investigar mensualment per jutjar la temperatura òptima d'emmagatzematge. L'estabilitat química es va avaluar en formulacions carregades de fàrmacs, emmagatzemades a 2-8˚C i a temperatura ambient, amb el contingut de PG determinat per espectrofotometria UV a 333 nm. Test de sensibilitat de la pell. Es van realitzar proves de sensibilitat de la pell en conills (que pesen 2,02,5 kg) per avaluar el potencial irritant de l'aplicació tòpica de la formulació desenvolupada tal com s'ha descrit anteriorment (13). Nou conills d'Holanda (16 setmanes d'edat; un pes de 2,0-2,5 kg; 5 mascles i 4 femelles) es van obtenir del Centre d'Animals Experimentals de la Universitat Mèdica de Xinjiang. Els animals van ser sotmesos a una alimentació adaptativa durant 1 setmana en un cicle de 12 h de llum/12 h de foscor, a temperatura ambient (24 ± 2 °C), amb una humitat del 50 ± 15 per cent. Tots els animals tenien accés a una dieta estàndard i aigua. Per al sacrifici es va utilitzar l'embòlia aèria. Els protocols utilitzats en el present estudi van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de la Universitat Mèdica de Xinjiang (Xinjiang, Xina). Els pèls de la part posterior es van eliminar ~ 24 h abans de l'administració de les formulacions ME. Els animals es van dividir en els grups següents: Un grup ME optimitzat (n=3), amb administració tòpica de ME optimitzat que contenia un 2% (p/p) de PG; un grup salí PG (n=3), amb administració tòpica de solució salina que conté un 2% (p/p) de PG; i grup de solució salina control (n=3), subjecte a administració tòpica de solució salina normal. L'administració es va realitzar dues vegades al dia durant 5 dies. Els animals es van observar per detectar qualsevol signe de picor o canvis a la pell, incloent eritema, pàpules, descamació i sequedat (14). Després de la retirada del fàrmac, es va continuar l'observació per a administracions simples o múltiples durant 3 dies. Les puntuacions d'irritació de l'àrea de prova es van avaluar jutjant l'extensió de l'eritema i l'edema segons els criteris següents: 1, cap reacció visible; 2, una reacció lleu; 3, una reacció moderada i 4, una reacció severa (15,16). Finalment, es van calcular les puntuacions totals d'irritació per a cada condició mitjançant l'equació següent:

Anàlisi estadística. Les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard. L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida de la prova de diferència menys significativa. Les dades es van analitzar mitjançant la versió 19 del programari SPSS.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, EUA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultats i discussió

Detecció d'olis, tensioactius i co-tensioactius per a ME. PG(glicòsid feniletanoide de cistanche)era gairebé insoluble en parafina líquida i àcid oleic, però es va observar una solubilitat moderada en IPM (taula II). L'IPM augmenta el coeficient de difusió a la pell i provoca un augment del coeficient de permeació (17,18). A més, l'IPM es selecciona habitualment per a la preparació de ME a causa de les seves conegudes propietats de millora de la penetració i biocompatibilitat. La selecció de tensioactius és fonamental per a la formulació exitosa de ME, ja que contribueix a la reducció de la tensió interfacial formant una pel·lícula a la interfície aigua-oli (19). En el present estudi, PG va mostrar una major solubilitat en Cremophor-EL (40,193 mg/ml; Taula II) en comparació amb Tween-80 (28,051 mg/ml; Taula II). Per tant, CremophorEL es va seleccionar per utilitzar-lo en estudis posteriors a causa del seu perfil de solubilitat i el seu baix nivell de toxicitat com a tensioactiu no iònic. A més, la seva solució aquosa va demostrar una bona solubilitat de PG. La solubilitat més alta de PG entre els cosurfactants es va observar en el propilenglicol (48,714 mg/ml; Taula II). A més, el propilenglicol té la capacitat de formar ME amb IPM i CremophorEL. En conjunt, es van utilitzar IPM, CremophorEL i propilenglicol com a fase d'oli, tensioactiu i cosurfactant, respectivament, per a la formulació de ME carregats amb PG. Construcció de diagrames de fase pseudoternaris. En el present estudi, es van construir diagrames de fase per seleccionar el rang de concentració de components per a les microemulsions, i les àrees marcades indiquen la regió O/WME clara (Fig. 1). Anteriorment s'ha informat d'una estreta relació entre l'efecte d'hidratació de l'estrat còrni i la permeació dèrmica (20), i l'activitat termodinàmica dels fàrmacs en els ME va ser una força impulsora important de l'alliberament i la penetració de fàrmacs a la pell (20,21). ). Es va demostrar que l'activitat termodinàmica dels fàrmacs en ME amb un contingut més baix de mescles de tensioactius és una força impulsora important per a l'alliberament i la penetració del fàrmac a la pell (22,23).

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 eren tèrboles i inestables (Fig. 2).

Les composicions finals de ME1-5 es mostren a la Taula I. Preparació i caracterització de ME. Les propietats físiques de ME1-5 es mostren a la taula III. Els sistemes dispersos eren macroscòpicament idèntics, homogenis i transparents, sense precipitats. La mida mitjana de les gotes d'aquests ME oscil·lava entre 30,56 i 79,21 nm (Fig. 3; Taula III), amb valors de l'índex de polidispersitat que oscil·laven entre 0,187 i 0,321 (Taula III). Això indicava un ME uniforme amb una distribució de mida estreta. A més, la mida de les gotes va augmentar en proporció amb el contingut d'oli, però va disminuir amb el contingut de la barreja de tensioactius. Aquest fenomen es pot atribuir a l'expansió del nucli d'oli ME i l'alta concentració de tensioactius que redueix amb força la tensió interfacial oli-aigua per reduir la mida de les gotes. A més, la viscositat del ME es va elevar com a resultat de l'augment del nivell de tensioactiu i la disminució de l'aigua. Els valors de pH de tots els ME es trobaven dins de l'interval adequat de 5,0-7,5 (taula III) i, per tant, eren compatibles amb els dels teixits de la pell. Pel que fa a l'estabilitat física, no es va observar cap separació de fases, trencament o precipitació de fàrmacs en cap dels ME provats, cosa que indica que els ME posseïen una estabilitat termodinàmica satisfactòria contra la centrifugació. La prova de solubilitat del colorant va revelar que un colorant soluble en aigua (taronja de metil) es distribuïa uniformement per tot el sistema ME, la qual cosa implicava que el ME format era de tipus O/W (dades no mostrades). Les micrografies van revelar gotes ME5 individuals separades amb un contorn esfèric (Fig. 4). Estudi de permeació cutània Exvivo. Els perfils de permeació de tots els vehicles provats van seguir una cinètica d'alliberament d'ordre zero (26, 27) i ME5 va proporcionar el flux transdèrmic més alt de PG (86.795±{0.23 µg/cm{{28} }} /h-1; Fig. 5; Taula III). En el present estudi, es van determinar els efectes del contingut d'oli i la barreja de tensioactius sobre la permeació de la pell de PG. Els resultats van indicar que els tensioactius milloren la permeació de la pell augmentant la fluïdesa de la membrana, la solubilització del fàrmac i l'extracció de lípids de l'estrat còrni. La taxa de permeació de ME5 (86,795±0,23µg/cm{-2 /h{-1) va augmentar significativament en comparació amb les taxes de permeació de ME1 (69,57±{ {48}},78, P{=0.0{094), ME2 (44,326±0},84, P{{{50}} .0052), ME3 (79,859±0,12, P=0,039) i ME4 (58,332±0,39 µg/cm-2 /h-1 , P=0.0063, Fig. 5; Taula III) Això va ser coherent amb els resultats d'un estudi anterior, en què l'activitat termodinàmica de la càrrega de fàrmacs ME pot disminuir amb l'augment dels nivells de tensioactius (12,28). ). La viscositat de ME5 (30,43±0,12 mPa.s) va ser menor en comparació amb l'altre ME1 (80,51±0,87 mPa.s, P=0.0076), ME2 (47,52±0,54 mPa.s, P{{88). }},0089), ME3 (60,49±1,34 mPa.s, P=0,0094) i ME4 (43,27±0,21 mPa.s, P{=0,0059).