Extracció de glicòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa mitjançant extracció d'homogeneïtzació de cisalla d'alta velocitat

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei i Ruili Guo

Antecedents:

Cistanche tubulosaés una coneguda medicina tradicional xinesa originària de Xinjiang. Es troba àmpliament distribuït al nord d'Àfrica, Índia, etc. Objectiu: El principal component bioactiu deC. tubulosasón glicòsids feniletanoides (PhG). L'echinacòsid i l'acteòsid són els components indicatius per a la determinació de PhG i s'utilitzen principalment per a la protecció del fetge, la protecció immune, etc. Per tant, és molt important extreure els PhG de C. tubulosa. Mètodes: en aquest estudi, es van comparar els mètodes d'extracció assistida per ultrasons (UAE), extracció assistida per microones (MAE) i extracció d'homogeneïtzació de cisalla d'alta velocitat (HSHE). A més, es van optimitzar les condicions d'extracció del mètode HSHE. Resultats: els resultats van mostrar que el mètode HSHE era millor que els mètodes dels Emirats Àrabs Units i el MAE, i els paràmetres d'extracció òptims de l'HSHE eren una concentració d'etanol del 50 per cent, una temperatura d'extracció de 70 graus, una velocitat de rotació de 16000 rpm, un temps d'extracció de 2 min, una relació sòlid-líquid d'1:9 i un cicle d'extracció. Els rendiments d'equinacòsid i acteòsid van ser de l'1,366 i el 0,519 per cent, respectivament, i les taxes de transferència d'equinacòsid i acteòsid van arribar al 87 i al 94 per cent, respectivament. Conclusions: Es pot concloure que el mètode HSHE és una tècnica senzilla, ràpida i eficient per extreure PhGs de C. tubulosa. Destacats: s'ha investigat un mètode HSHE eficient i ecològic per a l'extracció de PhG de C. tubulosa. Es van obtenir les condicions òptimes del mètode HSHE per a l'extracció de PhG de C. tubulosa. Aquesta investigació proporciona un nou mètode per a l'extracció industrial de PhGsC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaés una medicina tradicional xinesa comuna que s'origina a Xinjiang. Es distribueix àmpliament al nord d'Àfrica, la península Aràbiga, el Pakistan i l'Índia i es va registrar oficialment a la Farmacopea Xinesa el 2010. El principal component bioactiu deC. tubulosasón glicòsids feniletanoides (PhGs), una classe de productes naturals solubles en aigua que inclouen equinacòsid, acteòsid, isoacteòsid i 2-acetilacteòsid (1, 2). L'estructura dels PhG consisteix en fragments d'àcid cinàmic i hidroxifeniletil, tots dos units a una -glucopiranosa mitjançant enllaços èster i glicosídics, respectivament (3). Els estudis farmacològics han demostrat que els PhG de C. tubulosa tenen moltes funcions medicinals, com ara efectes antifatiga (4), neuroprotectors (5-7), protectors del fetge (8-10) i efectes immunoprotectors (11). Per tant, l'extracció efectiva de PhG de C. tubulosa és de gran importància per al desenvolupament i la utilització de productes naturals.

Els mètodes d'extracció tradicionals actuals de PhG són l'extracció per reflux calent, l'extracció assistida per ultrasons (UAE) i l'extracció assistida per microones (MAE; 12-16). Aquests mètodes tenen diferents inconvenients, com ara baixa eficiència, temps d'extracció llargs i costos elevats. En comparació amb els mètodes tradicionals, el mètode d'extracció d'homogeneïtzació de cisalla d'alta velocitat (HSHE) és un mètode d'extracció nou i emergent i té els avantatges de temps d'extracció més ràpids, menys residus de dissolvent, rendiments més elevats, dispositiu més senzill i operació més fàcil (17). El principi de funcionament del mètode HSHE es basa en un tallador interior giratori accionat per un motor d'alta velocitat. Els talladors interiors i exteriors produeixen una potent força de cisalla per trencar i barrejar les mostres. Mentrestant, el tallador amb rotació a alta velocitat provoca diferències de pressió entre les cavitats interior i exterior del tallador, donant lloc a una transferència de massa entre les mostres i els dissolvents. Amb la combinació d'alta força de cisalla, força de col·lisió, pressió i altres forces, es pot aconseguir ràpidament un equilibri soluble entre mostres sòlides i dissolvents (18). Així, el procés d'extracció de HSHE es pot completar en pocs minuts, i fins i tot en desenes de segons (19-22).

Recentment, s'ha explorat l'HSHE en l'extracció de components bioactius de diversos productes naturals (23–25). Cheng et al. va utilitzar HSHE per extreure cinc lignans del fruit de Schisandra Chinensis (26). Els resultats van mostrar que les condicions òptimes eren una concentració d'etanol del 75 per cent, un temps d'extracció d'1 min, una relació sòlid-líquid d'1:19, una tensió d'extracció de 180 V i una partícula de mostra. mida de 120 malles. El rendiment total dels cinc lignans va ser de 13,89 ± 0,014 mg/g en les condicions optimitzades. Tang et al. va utilitzar HSHE per obtenir oli bioactiu a partir de llavors de perilla (27). Les condicions òptimes eren un temps d'extracció de 2 min, una relació sòlid-líquid d'1:10, una tensió d'extracció de 150 V i dos cicles d'extracció. El rendiment de l'oli de llavors de perilla va arribar al 59,3 per cent. Els resultats anteriors indiquen que HSHE té els avantatges de temps d'extracció curts, baixos costos i alts rendiments. No obstant això, hi ha una manca d'investigació sobre l'extracció de PhG per part de HSHE.

En el present estudi, HSHE es va utilitzar per explorar la seva aplicació potencial en l'extracció de PhGsC. tubulosa. El rendiment de PhG es va determinar per HPLC. Els tres mètodes d'extracció, HSHE, UAE i MAE, es van comparar en les mateixes condicions. Es van investigar els efectes de la concentració d'etanol, la temperatura d'extracció, la velocitat de rotació, el temps d'extracció, la relació sòlid-líquid i el nombre de cicles d'extracció del rendiment. Es comparen i es comenten els avantatges i inconvenients d'aquest treball i les referències.

Materials i mètodes

Material i reactius químics

C. tubulosaes va comprar a Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Xina). Els estàndards d'equinacòsid (pureses superiors o iguals al 98 per cent) i acteòsids (pureses superiors o iguals al 98 per cent) es van comprar a Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Xangai, Xina). L'acetonitril, el metanol i l'àcid acètic eren de grau HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). L'etanol de grau analític es va comprar a Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Xina). Durant els experiments es va utilitzar aigua desionitzada.

Anàlisi HPLC

Es va realitzar una anàlisi HPLC en una cromatografia líquida Waters e2695 (Waters, Milford, MA) equipada amb un detector UV/visible 2489 i una columna Symmetry C18 (Waters), 250 × 4,6 mm, mida de partícula de 5 μm. Les concentracions d'equinacòsid i acteòsid es van analitzar mitjançant el mètode HPLC. La fase mòbil constava de (1) acetonitril i (2) una solució aquosa d'àcid acètic glacial al 2%. El programa d'elució del gradient es presenta a la taula 1.

La longitud d'ona detectada era de 330 nm, el cabal era d'1 ml/min, el volum d'injecció era de 10 μL i la temperatura del forn es va establir a 30 graus. El pic cromatogràfic de l'analit es va confirmar comparant el seu temps de retenció amb el dels estàndards. La quantificació es va dur a terme integrant el pic mitjançant un mètode estàndard extern.

La prova de precisió es va dur a terme injectant cinc vegades les mateixes mostres d'extracció. Per a la prova d'estabilitat, es van analitzar les mateixes mostres en increments de 0, 1, 2, 4, 12, 24 i 48 h. Les proves de recuperació d'echinacòsid i acteòsid es van dur a terme afegint els estàndards a les mostres d'extracció. Es van registrar totes les zones pics i els temps de retenció d'echinacòsid i acteòsid. Els resultats de les corbes de calibratge per a equinacòsid i acteòsid es mostren a la taula 2.

Càlcul del Rendiment

L'echinacòsid i l'acteòsid es van utilitzar com a components indicatius per a la determinació de PhG. El rendiment d'echinacòsid o acteòside es va calcular mitjançant l'equació següent:

Y=CV/W×100 per cent (1)

on Y=rendiment d'echinacòsid o acteòsid (per cent); C=concentracions d'equinàcòsid o acteòsid (mg/ml); V=volum de la solució d'extracció (mL); i W=pes de la pols de C. tubulosa (mg).

Mètodes d'extracció de PhGs

Les tiges de C. tubulosa es van triturar per primera vegada amb una mòlta elèctrica (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Xina) i es van filtrar amb un tamís de filtre (aproximadament 380 μm). A continuació, la pols de C. tubulosa es va assecar al forn a 70 graus fins que el pes era constant. Es van barrejar cinc grams de pols de C. tubulosa amb el dissolvent d'extracció i es van col·locar en una ampolla d'extracció. Després, la barreja líquida es va preescalfar (30-80 graus) durant 5 minuts en un bany d'aigua a temperatura constant (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Xina).

(a) Mètode HSHE.—HSHE es va dur a terme mitjançant un sistema FA25 (FLUKO Co., Ltd, Xangai, Xina), que consistia en el tallador giratori, el motor d'alta velocitat i el controlador. La velocitat de rotació del tallador interior es va regular en el rang de 10.000 a 28.000 rpm i els temps d'extracció es van ajustar en el rang de 2 a 15 min.

(b) Mètode dels Emirats Àrabs Units: cinc grams de mostra seca i 300 ml de metanol es van pesar amb precisió i es van afegir a una ampolla d'extracció. L'ampolla d'extracció es va submergir en un bany d'ultrasons i es va dur a terme a una potència d'ultrasons de 300 W durant 10 min. La temperatura d'extracció es va establir a 30 graus.

(c) Mètode MAE. - Cinc grams de mostra seca i 300 ml de metanol es van pesar amb precisió i es van afegir a una ampolla d'extracció. L'ampolla d'extracció es va introduir al reactor de microones i es va dur a terme a 180 W durant 10 min. La temperatura d'extracció es va establir a 30 graus.

El mètode HSHE es va comparar amb els mètodes dels Emirats Àrabs Units i el MAE amb el mateix dissolvent d'extracció, temps d'extracció, temperatura d'extracció, relació sòlid-líquid i número de cicle d'extracció. La solució d'extracció es va filtrar per una membrana 0.22 μm i es va analitzar mitjançant HPLC per determinar les concentracions d'echinacòsid i acteòsid. Tots els processos d'extracció es van repetir tres vegades

Determinació de tarifes de transferència

Basant-se en el mètode estàndard de la Farmacopea de la Xina 2015, es va determinar el contingut d'echinacòsid i acteòsid en pols de C. tubulosa (28). Es van pesar amb precisió un gram de pols de C. tubulosa i 50 ml de metanol al 50 per cent i es van afegir en un matràs aforat marró de 50 ml. La mescla líquida es va pesar i es va posar en remull durant 30 min. A continuació, es va submergir el matràs aforat marró en un bany d'ultrasons i es va dur a terme a una potència ultrasònica de 250 W i una freqüència de 35 kHz durant 40 min. La barreja líquida es va tornar a pesar i es va afegir un 50 per cent de metanol per subministrar la pèrdua de dissolvent. La solució d'extracció es va filtrar per una membrana de 0, 22 μm i es va analitzar mitjançant HPLC per determinar les concentracions d'echinacòsid i acteòsid. Els processos d'extracció es van repetir tres vegades.

Les taxes de transferència d'echinacòsid o acteòside es van calcular mitjançant l'equació següent:

X= M1/M2 × 100 per cent (2)

on X=taxa de transferència d'equinacòsid o acteòsid (per cent); M1=qualitat de l'equinacòsid o acteòsid en l'extracte (mg); i M2=qualitat d'echinacòsid o acteòsid en pols de C. tubulosa (mg).

Resultats i discussió

Validació del Mètode HPLC

Els perfils HPLC d'echinacòsid i acteòside de C. tubulosa mitjançant HSHE es mostren a la figura 1. La RSD de les àrees màximes d'echinacòsid i acteòside va ser de l'1,89 i l'1,40 per cent, respectivament. Els resultats van mostrar que el mètode HPLC té una bona precisió en l'anàlisi quantitativa de l'echinacòsid i l'acteòsid. En diversos moments (0-48 h), els RSD de les zones màximes d'echinacòsid i acteòside van ser de l'1, 71 i 1, 7 0 per cent, respectivament, cosa que indica que la mostra era estable en 48 h. La recuperació d'echinacòsid i acteòsid va ser del 99,3 i del 99,1 per cent, respectivament, i la seva RSD va ser del 0,70 i del 0,67 per cent, respectivament, la qual cosa va confirmar la fiabilitat del mètode HPLC.

Comparació dels diferents mètodes d'extracció

Es va realitzar una comparació del mètode HSHE amb els mètodes MAE i Emirats Àrabs Units pel que fa als rendiments d'equinacòsid i acteòsid, els resultats de la qual es mostren a la figura 2. Es va observar que els rendiments d'equinacòsid i acteòsid obtinguts per HSHE eren superiors als obtinguts. tant pel MAE com pels Emirats Àrabs Units. En comparació amb MAE, els rendiments d'echinacòsid i acteòsid obtinguts per HSHE van ser més grans en un 20,5 i un 20,8 per cent, respectivament. I en comparació amb els Emirats Àrabs Units, els rendiments d'echinacòsid i acteòsid obtinguts per HSHE van ser més grans en un 6,6 i un 7,4 per cent, respectivament. Aquests resultats indiquen que HSHE pot augmentar significativament els rendiments de PhG.

Optimització del Mètode HSHE

Els paràmetres d'extracció de PhG per HSHE inclouen la concentració d'etanol, la temperatura d'extracció, la velocitat de rotació, el temps d'extracció, la relació sòlid-líquid i el nombre de cicles d'extracció (26, 29).

Efecte de la concentració d'etanol en l'extracció de PhG

La concentració d'etanol és un factor important que afecta els rendiments de PhG. Com es mostra a la figura 3, es van investigar els rendiments d'echinacòsid i acteòside de C. tubulosa a diferents concentracions d'etanol. Va revelar que el rendiment d'equinacòsid va augmentar del 0 al 3{0 per cent i després va disminuir del 30 al 90 per cent amb l'augment de les concentracions d'etanol. El rendiment d'acteòsid va augmentar del 0 al 70 per cent i després va disminuir del 70 al 90 per cent amb l'augment de les concentracions d'etanol. Quan la concentració d'etanol era del 50 per cent, la suma dels rendiments d'echinacòsid i acteòsid era al màxim. Les diferents concentracions d'etanol tenen polaritats diferents, la qual cosa condueix a diferents solubilitats d'equinacòsid i acteòsid. Així, la concentració òptima d'etanol era del 50 per cent.

Efecte de la velocitat de rotació en l'extracció de PhG

La figura 5 mostra els efectes de diferents velocitats de rotació sobre els rendiments de PhG. Els rendiments d'echinacòsid i acteòsid van augmentar amb l'augment de la velocitat de rotació. L'augment de la velocitat de rotació pot augmentar la força de cisalla del tallador interior i exterior, augmentant així els rendiments de PhG. La velocitat de rotació òptima era de 16.000 rpm.

Efecte del temps d'extracció sobre l'extracció de PhG

Els rendiments d'equinacòsid i acteòsid sota els diferents temps d'extracció es mostren a la figura 6. Els rendiments d'echinacòsid i acteòside eren estables amb l'augment dels temps d'extracció. Per tant, es pot concloure que els PhG es poden extreure completament de C. tubulosa en 2 min, i el temps d'extracció òptim va ser de 2 min.

Efecte de la relació sòlid-líquid en l'extracció de PhG

Tal com es mostra a la figura 7, es van discutir els rendiments d'echinacòsid i acteòsid sota les diferents relacions sòlid-líquid. Els rendiments d'equinacòsid i acteòsid van augmentar d'1:3 a 1:9 i es van mantenir estables d'1:9 a 1:24. Com que una petita quantitat de dissolvent d'extracció no pot dissoldre completament l'echinacòsid i l'acteòsid, es van reduir les taxes de transferència de massa. L'extracció excessiva de dissolvents va provocar residus innecessaris. Per tant, la relació òptima sòlid-líquid era 1:9.

Efecte del nombre de cicles d'extracció sobre l'extracció de PhG

La figura 8 mostra que els efectes d'una sèrie de cicles d'extracció sobre els rendiments de PhG. Els rendiments d'equinacòsid i acteòsid van augmentar amb l'augment del nombre de cicles d'extracció. Tanmateix, els temps d'extracció van augmentar notablement amb l'augment dels cicles d'extracció i es va consumir més energia. El nombre òptim de cicles d'extracció era un.

Comparació del mètode HSHE amb altres mètodes d'extracció per extreure PhG

Els resultats del mètode HSHE en comparació amb altres mètodes d'extracció per extreure PhG de C. tubulosa es mostren a la taula 3. HSHE és més senzill i més fàcil que els mètodes d'acoblament, com ara l'extracció aquosa bifàsica assistida per ultrasons i la tecnologia d'extracció per microones ultrasòniques. mètodes. A més, la pressió d'extracció de HSHE és inferior al mètode d'extracció de líquid a pressió i les condicions de funcionament del primer són més segures. Més important encara, es pot veure a la taula 3 que HSHE mostra el temps d'extracció més curt i el menor consum de dissolvent entre tots els mètodes d'extracció. Es pot concloure que el mètode HSHE té molts avantatges com ara alta eficiència, condicions de funcionament suaus, nivells de consum baixos, equips senzills i fàcil operació per a l'extracció de productes naturals.

Conclusions

En aquest estudi, s'ha investigat un mètode HSHE eficient i ecològic per a l'extracció de PhG de C. tubulosa. En comparació amb els mètodes dels Emirats Àrabs Units i el MAE, el nou mètode HSHE produeix un major rendiment de PhGs en les mateixes condicions. En comparació amb el mètode MAE, els rendiments d'equinacòsid i acteòsid es van augmentar un 20,5 i un 20,8 per cent, respectivament. I en comparació amb els Emirats Àrabs Units, els rendiments d'equinacòsid i acteòsid es van incrementar un 6,6 i un 7,4 per cent, respectivament. Es van optimitzar els paràmetres d'extracció de HSHE de PhG de C. tubulosa. Sota els paràmetres optimitzats, els rendiments d'echinacòsid i acteòside van arribar a l'1,366 i el 0,519 per cent, respectivament, i les taxes de transferència d'equinacòsid i acteòsid van assolir el 87 i el 94 per cent, respectivament. El mètode HSHE té els avantatges d'una alta eficiència, condicions de funcionament suaus, baixos nivells de consum, equips senzills, fàcil operació i baixos costos. Aquesta investigació proporciona un nou mètode per a l'extracció industrial de PhGs de C. tubulosa.