Part 1: la malaltia renal crònica proteïnúrica s'associa amb la vida útil alterada dels glòbuls vermells, la deformabilitat i el metabolisme
Mar 05, 2022
Contacte: emily.li@wecistanche.com
Rosi Bissinger, et al
1Divisió d'Endocrinologia, Diabetologia i Nefrologia, Departament de Medicina Interna, Hospital Universitari de Tübingen, Tübingen, Alemanya;2Departament de Bioquímica i Genètica Molecular, Campus Mèdic Anschutz de la Universitat de Colorado, Aurora, Colorado, EUA;3Divisió d'Hematologia, Universitat de Colorado Denver, Aurora, Colorado, EUA;4Institut de Medicina de l'Esport Molecular i Cel·lular, Universitat de l'Esport alemany de Colònia, Köln, Alemanya;5Institut d'Investigació de la Diabetis i Malalties Metabòliques (IDM) del Helmholtz Center de Munic a la Universitat de Tübingen, Tübingen, Alemanya;6Centre Alemany per a la Recerca de la Diabetis (DZD) de la Universitat de Tübingen, Tübingen, Alemanya;7Centre de Medicina de Transfusió Clínica, Hospital Universitari de Tübingen, Tübingen, Alemanya;8Departament de Patologia, Universitat Eberhard Karls Tübingen, Tübingen, Alemanya;9Departament de Dermatologia, Universitat Eberhard Karls Tübingen, Tübingen, Alemanya;10Institut de Biologia Oral, Facultat d'Odontologia, Universitat d'Oslo, Oslo, Noruega;11Departament de Medicina, Centre Mèdic Universitari Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Alemanya; i12Facultat de Ciències de la Salut, Ontario Tech University, Oshawa, Ontario, Canadà
L'anèmia és una complicació freqüent demalaltia renal crònica, afectant la qualitat de vida dels pacients. Entre diversos factors, com ara la deficiència de ferro i eritropoietina, la reducció de la vida útil dels glòbuls vermells (RBC) s'ha implicat en la patogènesi de l'anèmia. No obstant això, les dades mecàniques sobre la disfunció de RBC in vivomalaltia de ronyómanquen. A continuació, es descriu el desenvolupament de l'anèmia associada a la malaltia renal crònica en ratolins amb malaltia renal proteïnúrica derivada de l'administració de doxorubicina o d'una deficiència de podocina inductible. En ambdós models experimentals, l'anèmia es va manifestar el dia 10 i va progressar al dia 30 malgrat l'augment dels nivells circulants d'eritropoietina i l'eritropoesi a la medul·la òssia i la melsa.
Els eritròcits circulants en ambdós models de ratolí mostraven una morfologia alterada i una deformabilitat sensible a l'osmòtica disminuïda juntament amb una major externalització de la fosfatidilserina a la membrana plasmàtica externa, un segell distintiu de la mort de glòbuls. Etiquetatge per fluorescència de glòbuls vermells el dia 20 de ratolins amb doxorubicina induïdamalaltia de ronyóva revelar una eliminació prematura de la circulació. Les anàlisis metabolòmiques dels eritròcits dels dos models de ratolí van demostrar canvis temporals en les vies de reciclatge redox i el cicle de Lands, un procés de remodelació de lípids de membrana. Pacients anèmics amb proteinuriamalaltia de ronyótenia una proporció més gran de glòbuls vermells positius per a la fosfatidilserina circulant.
Així, les nostres observacions suggereixen que la vida útil reduïda dels eritròcits, mediada per un metabolisme alterat dels eritròcits, la reducció de la deformabilitat dels eritròcits i la mort cel·lular millorada contribueixen al desenvolupament de l'anèmia en proteïnes.malaltia de ronyó.
Kidney International (2021) 100, 1227–1239; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.08.024
PARAULES CLAU:Cistanche, avantatges de Cistanche,malaltia de ronyó, insuficiència renal, malaltia renal crònica, anèmia, mort cel·lular; deformabilitat, cicle de les terres; metabolisme; proteinúria; glòbuls vermells; reciclatge redox
Copyright ª 2021, Societat Internacional de Nefrologia. Publicat per Elsevier Inc. Aquest és un article d'accés obert sota la llicència CC BY-NC-ND
Beneficis de Cistanche funció renal.
Declaració translacional
Aquest estudi demostra que la proteïnamalaltia de ronyóen models murins condueix a l'eliminació prematura de glòbuls vermells (RBC) i, finalment, provoca el desenvolupament d'anèmia. L'augment de la mort de glòbuls també es produeix en pacients ambmalaltia renal crònicai anèmia. La disfunció de glòbuls en el medi urèmic és un mecanisme important per a la pèrdua de glòbuls i el desenvolupament d'anèmia associada a la malaltia renal, independentment de la secreció endògena d'eritropoietina.
El desenvolupament de l'anèmia és una complicació típica dels avançatsmalaltia renal crònica(CKD) i s'associa amb una qualitat de vida deteriorada1 i un augment del risc d'esdeveniments cardiovasculars2i hospitalització,3així com el declivi cognitiu.4 La gravetat de l'anèmia s'ha vist com un predictor independent de la mortalitat tant en pacients amb ERC dependents de diàlisi com en pacients no dependents de diàlisi.5 La fisiopatologia de l'anèmia associada a la malaltia renal és complexa i implica una deficiència de ferro i eritropoietina (EPO) en el context d'inflamació de baix grau, que, al seu torn, compromet l'eritropoesi normal en pacients amb ERC.6 En la ERC avançada, la resposta de l'EPO és inadequada baix en relació amb el grau d'anèmia.7,8L'elevada prevalença de deficiència de ferro concomitant en la CKD és conseqüència de l'homeòstasi del ferro alterada.9 Un mecanisme oblidat de pèrdua de ferro en la ERC és la proteinúria, que pot provocar pèrdues urinàries de ferro unit a la transferrina (fins a 0,3 mg/d) quan la proteinúria arriba al rang nefròtic.10
Another factor that is thought to contribute to anemia in CKD patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >fa 60 anys.6,11,12Un estudi recent que va utilitzar una prova d'alè amb monòxid de carboni va demostrar que la vida útil dels eritròcits va disminuir progressivament de 120 dies en pacients amb ERC en etapa 1 a 60 dies en pacients amb ERC en etapa 5.13En particular, la transfusió de glòbuls al·logènics de donants sans a pacients amb CKD va ser seguida d'una ràpida eliminació dels glòbuls transfosats sense evidència d'hemòlisi.12Un mecanisme plausible per a aquesta observació pot ser l'estimulació d'una mort cel·lular semblant a l'apoptosi en eritròcits anucleats, que denota un patró de lesió en què la integritat de la membrana cel·lular no es veu compromesa i el contingut citoplasmàtic roman intacte.14Els eritròcits que pateixen la mort cel·lular presenten diverses alteracions morfològiques derivades del dany citoesquelètic, com ara la formació de boles superficials, la pèrdua d'elasticitat de la membrana i/o la deshidratació cel·lular.15A nivell molecular, la mort de RBC s'associa amb l'acumulació intracel·lular de Ca2+, l'estat d'energia cel·lular alterat i la ruptura de l'asimetria dels fosfolípids, que finalment condueix a l'externalització de la fosfatidilserina (PS) a la membrana plasmàtica externa.15,16Com a conseqüència, els macròfags i les cèl·lules dendrítiques especialitzades reconeixen ràpidament els eritròcits externs a PS, donant lloc a l'eritrofagocitosi i el seu catabolisme a la melsa i el fetge.17
A causa de la fisiopatologia confusa de l'anèmia associada a la malaltia renal en humans, els estudis en animals estan justificats per identificar els mecanismes que contribueixen. Nefropatia induïda per doxorubicina (DIN) en ratolins 129S1/SvImJ18 i ratolins amb deficiència de podocina inducible (Nphs2Dipod)19Són 2 models que es caracteritzen per la inducció de proteinúria de rang nefròtic en dies, progressió ainsuficiència renaldesprés de 3 setmanes, i la mort en 6 a 7 setmanes.19–21Tots dos models de ratolí recapitulen de manera efectiva totes les etapes de la CKD humana. En el present estudi, hem provat si és progressiuinsuficiència renalen aquests ratolins amb proteinúricmalaltia de ronyóafecta la vida útil dels eritròcits i contribueix a l'anèmia. Paral·lelament, vam examinar el fenotip de glòbuls en sang extreta de pacients amb ERC amb proteinúria de rang nefròtic.
Cistanche tracta la malaltia renal crònica i protegeix el ronyó
MÈTODES
La informació detallada sobre els materials i mètodes es proporciona als Materials i mètodes suplementaris.
Estudis del ratolí
Es van realitzar experiments amb 8-ratolins salvatges 129S1/SvImJ d'una setmana d'edat d'ambdós sexes (Charles River). La DIN es va induir mitjançant una única injecció de doxorubicina (14,5 mg/g de pes corporal), tal com es va descriure anteriorment.18,22Per controlar l'efecte mielotòxic de la doxorubicina no relacionat amb el desenvolupament de nefropatia, els ratolins C57BL/6 resistents a la doxorubicina també van ser sotmesos al mateix protocol de tractament.23 A més, es van realitzar experiments similars en ratolins de 8-setmanes d'edat amb supressió induïble de podocina (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G]8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) o ratolins Nphs2Dipod, que van ser tractats amb doxiciclina durant 14 dies.19Tots els experiments amb animals es van dur a terme segons la Guia dels Instituts Nacionals de Salut per a la cura i l'ús d'animals de laboratori i la Llei alemanya per al benestar dels animals, amb l'aprovació de les autoritats locals (Regierungspräsidium Tübingen, números d'aprovació M12/17 i M17/19G). ).
El disseny experimental dels estudis de ratolí es descriu a la figura suplementària S1.
Pacients
L'estudi del pacient es va realitzar d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki i va ser aprovat pel comitè d'ètica local de l'Hospital Universitari de Tübingen (556/2018BO2). Es van obtenir mostres de sang i orina amb heparina de liti de pacients amb proteinúria de rang nefròtic i taxa de filtració glomerular preservada (GFR; etapes 1-2; n 10) i pacients amb GFR reduït (estadi CKD 3-5; n 15) a la Universitat. Hospital de Tübingen. Com a grup de control, el banc de sang de l'Hospital Universitari de Tübingen va proporcionar sang de voluntaris sans aparellats per edat i sexe (n 25). Totes les mostres humanes es van recollir després del consentiment informat. Les característiques clíniques dels pacients es mostren a la taula 1.
Anàlisis de citometria de flux
Es van determinar diferents paràmetres de mort de cèl·lules RBC mitjançant citometria de flux.14 Per determinar la vida útil de RBC in vivo, es van injectar 25 ml de 5,6-carboxifluoresceïna diacetat succinimidil éster [5(6)-CFDA, SE] colorant a una concentració de 9,96 mM (solubilitzat en dimetilsulfòxid) al retro -plexe orbital de ratolins 129S1/SvImJ de tipus salvatge i injectats amb doxorubicina, tal com es va descriure anteriorment.24 En els moments indicats, es va extreure sang del plexe retroorbital dels ratolins i es va detectar el percentatge de cèl·lules 5(6)-CFDA, SE+ mitjançant l'anàlisi de citometria de flux. Finalment, les dades es van analitzar mitjançant el programari FlowJo (FlowJo LLC).
Deformabilitat de RBC i ektacitometria de gradient osmòtic La deformabilitat de RBC es va mesurar mitjançant l'analitzador de cèl·lules rotacionals òptiques assistides per làser (LORCA MaxSis; RR Mechatronics), que s'ha descrit amb detall en altres llocs.25 Les anàlisis d'ektacitometria de gradient osmòtic (osmoscan) també es van realitzar mitjançant el LORCA MaxSis i es van mesurar la deformabilitat en diverses condicions osmòtiques.26
Exploració histològica
Per a la tinció d'hematoxilina i eosina, la melsa i els fèmurs es van tenyir amb hematoxilina i eosina. Totes les diapositives es van tacar amb l'anticòs primari Ter 119 (BD Pharmingen; dilució 1:500). Per a la tinció periòdica d'àcid-Schiff, es van tenyir rodanxes de 2,5-mm de gruix dels ronyons amb reactiu àcid periòdic-Schiff (Carl Roth) i hematoxilina (abcam). Es va realitzar una tinció de May-Grünwald-Giemsa (mètode Pappenheim) per determinar els canvis de forma dels eritròcits, tal com es va descriure anteriorment.27 L'aïllament dels glomèruls es va fer mitjançant un enfocament de biotinilació i classificació cel·lular.19 Per a la detecció de proteïnes de podocina, es va aplicar un anticòs de Sigma (P0372).19 Es va utilitzar Roti-Mount Fluor Care 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Carl Roth) per tacar els nuclis.
Metabolòmica de cromatografia líquida-espectrometria de masses d'alt rendiment a partir de glòbuls vermells de ratolí
Les anàlisis es van realitzar tal com es va publicar anteriorment.28 Breument, la plataforma analítica utilitza un sistema de cromatografia líquida d'ultra alt rendiment Vanquish (Thermo Fisher Scientific) acoblat en línia a un espectròmetre de masses Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).
Anàlisis estadístics
Les dades es proporcionen com a mitjanes aritmètiques SEM o com a mediana amb un rang interquartil (percentil 25-75) amb n que representa el nombre d'animals utilitzats o pacients inclosos, respectivament. Les dades es van provar per a la normalitat amb la prova Kolmogorov-Smirnov, la prova D' Ag-ostino i la prova Shapiro-Wilk. Les variàncies es van analitzar mitjançant la prova de Bartlett per a les variàncies iguals. GraphPad Prism 8 (programari GraphPad) va realitzar la prova posterior de comparació múltiple de Tukey o Dunn, la prova t de Student no aparellada o la prova U de Mann-Whitney. P <{8}},05 amb="" 2-test="" amb="" cua="" es="" va="" considerar="" estadísticament="" significatiu.="" es="" van="" representar="" gràfics="" addicionals="" mitjançant="" graphpad="" prism="">
RESULTATS
La malaltia renal proteinúrica experimental indueix anèmia en ratolins
Després de la inducció, els ratolins 129S1 / SvImJ amb ratolins DIN i Nphs2Dipod van desenvolupar proteinúria de rang nefròtic (figura 1a i figura suplementària S2C) i progressivainsuficiència renalcaracteritzat per nivells elevats d'urea en plasma a partir del dia 20 (figura 1b i figura suplementària S2D). Durant els primers 10 dies, els ratolins van experimentar un augment de pes corporal amb ascites (figura 1c i figura suplementària S2E), cosa que reflecteix la retenció de sodi causada per l'excreció de serina proteases o proteasúria.18 Després de la reversió espontània de la retenció de sodi, aquests ratolins van perdre pes de manera constant. En ratolins amb DIN i en ratolins Nphs2Dipod, les imatges de microscòpia lleugera, capturades després de 10 dies, van revelar canvis histomorfològics típics consistents amb l'esclerosi glomerular segmentària focal (figura 1d i figura suplementària S2B). Aquests estaven absents en els ratolins C57BL / 6 injectats amb doxorubicina (figura 1d). El tractament amb doxorubicina va induir una forta disminució de l'hemoglobina, el recompte de glòbuls i l'hematocrit (figura 1e–g) a partir del dia 10 en ratolins 129S1/SvImJ i C57BL/6, que en aquests últims es van normalitzar els dies 20 i 30. En canvi, el Els dies 20 i 30, els ratolins 129S1/SvImJ injectats amb doxorubicina i amb dèficit de podocina van desenvolupar una anèmia progressiva, caracteritzada per un volum corpuscular mitjà reduït (figura 1h) i una hemoglobina reduïda (figura suplementària S2F), cosa que suggereix que l'anèmia s'associa amb una progressió progressiva.insuficiència renali no amb el tractament amb doxorubicina per se.
L'anèmia en la malaltia renal proteinúrica experimental no és causada per una eritropoesi compromesa
Els dos models de ratolins anèmics van mostrar un augment significatiu del percentatge de reticulòcits circulants (figura 2a i figura suplementària S3C). Les concentracions d'EPO en plasma es van augmentar dràsticament el dia 10 a 129S1 / SvImJ amb DIN i ratolins C57BL / 6 sans, però es van normalitzar de nou els dies 20 i 30 (figura 2b). En ratolins amb deficiència de podocina, les concentracions plasmàtiques d'EPO van augmentar el dia 10 i es van mantenir augmentades els dies 20 i 30 (figura suplementària S2H). En les anàlisis histològiques de la medul·la òssia i la melsa, el nombre de cèl·lules precursores eritroides en comparació amb els precursors mieloides va augmentar el dia 30 (figura 2d-g), apuntant a l'eritropoesi estimulada en ratolins anèmics 129S1 / SvImJ amb DIN.
La reducció de la vida útil dels eritròcits és la principal causa d'anèmia en la malaltia renal proteïnúrica experimental
L'externalització de PS a la fulla externa de la membrana plasmàtica de RBC és un indicador de la mort cel·lular i un promotor de l'eritrofagocitosi.14 La mort de cèl·lules RBC es va quantificar mitjançant anàlisis de classificació de cèl·lules activades per fluorescència de PS de superfície unida a l'annexina V fluorescent.14 In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}fold més alt el dia 20 en ratolins amb DIN (4,16 per cent T 0.86 per cent ) en comparació amb ratolins sans (1.{{7} }} per cent 0,11 per cent ) (figura 3a). De la mateixa manera, els ratolins Nphs2Dipod van mostrar un augment aproximadament 2- vegades de l'exposició a PS (1,27 per cent de T 0,20 per cent) en comparació amb els ratolins sans (0,58 per cent, 0,05 per cent) el dia 30 (figura suplementària S3A). Se sap que els eritròcits són eliminats de la circulació pels macròfags que resideixen a la melsa.17 Per tant, aquesta observació pot explicar la proporció més alta de melsa/pes corporal dels ratolins Nphs2Dipod (figura suplementària S2G), on es degraden el doble de glòbuls en comparació amb els ratolins C57BL/6 sans.
Com que la proteinúria de rang nefròtic condueix a una disproteinèmia,29 vam investigar més si la mort de cèl·lules RBC millorada pot ser estimulada per un component del plasma de ratolins amb DIN. Tal com es mostra a la figura 3b, l'exposició a PS els dies 10 i 20 va ser el doble després de la incubació (30 minuts a 37 ○ C) de glòbuls sans en plasma de ratolins 129S1 / SvImJ injectats amb doxorubicina en comparació amb la incubació en plasma de ratolins sans. L'afluència de Ca2+ als eritròcits, mediada per canals catiònics no selectius dependents de voltatge i independents de la tensió,30,31 és un dels reguladors clau de la mort de les cèl·lules globules. En els eritròcits recollits els dies 20 i 30 de ratolins 129S1 / SvImJ amb DIN, es van augmentar les concentracions intracel·lulars de Ca2 + (figura 3c); això
el fenomen es va recapitular en ratolins Nphs2Dipod el dia 20 (figura suplementària S3B).
En ambdós models de ratolí, hi va haver una correlació negativa significativa del percentatge de glòbuls vermells positius amb PS, amb la gravetat de l'anèmia reflectida pels nivells d'hemoglobina (figura 3d i figura suplementària S3D). A més, hi va haver una correlació significativa amb el dany renal reflectit per la concentració d'urea plasmàtica (figura 3e i figura suplementària S3E) i en menor grau amb la proteinúria (figura 3f i figura suplementària S3F). Per compensar la pèrdua de glòbuls en l'anèmia, es va estimular la formació de nous glòbuls en ambdós ratolins, tal com indica l'augment del percentatge de reticulòcits circulants, i es va correlacionar significativament amb la magnitud dels glòbuls vermells que exposaven a PS (figura 3g i figura suplementària S3G).
Feu clicAQUÍper a la 2a part.