Part 2: La regulació epigenètica del gen circadià Per1 contribueix als canvis relacionats amb l'edat en la memòria de l'hipocamp

Contacte: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Si us plau, feu clic aquí per a la part 1

La derrota de Per1 perjudica a llarg terminimemòriaen ratolins joves.A continuació, provar si la regulació de Per1 a l'hipocamp dorsal és necessària a llarg terminimemòriaformació, vam infondre siRNA dirigit a Per1 a l'hipocamp dorsal de ratolins joves 48 h abans de l'entrenament OLM de 10-min. La infusió de siRNA Per1 va produir una reducció significativa de la proteïna PER1 a l'hipocamp dorsal, tal com es va mesurar 2 h després de la sessió de prova final (figura 4d, figura suplementària 5). Aquesta derrota relativament modesta de la proteïna PER1 (~ 30 per cent) va produir un deteriorament greumemòriaformació per a OLM; els ratolins infusionats amb Per1 siRNA no van mostrar un augment significatiu de la DI entre l'entrenament i la prova i van mostrar una preferència significativament menor per l'objecte en moviment durant la prova que els ratolins control (Fig. 4e) sense cap efecte en l'exploració total de l'objecte a la prova (Fig. 4f). i no hi ha diferència de moviment durant les sessions d'habituació prèvia a l'entrenament (figura suplementària 8c). Això demostra, per primera vegada, que la interrupció local d'un gen central del rellotge circadià de manera selectiva dins de l'hipocamp pot afectarmemòriaformació.

La sobreexpressió de Per1 milloramemòriaen ratolins envellits. Finalment,per determinar si la sobreexpressió de Per1 a l'hipocamp dorsal és suficient per millorar la relació amb l'edat.memòriadeficiències, hem regulat localment Per1 mitjançant dos mètodes complementaris. Primer, vam utilitzar un lentivirus que expressava Per1 de tipus salvatge amb una etiqueta d'epítop v5 (pLVX-v5Per1) (figura 5a, figura suplementària 6a). Per confirmar que aquest plasmidi sobreexpressa Per1, vam transfectar cèl·lules HT22 amb pLVX-v5Per1 o pLVX-EV i vam mesurar l'expressió d'ARNm de Per1. Tant a les 24 com a les 48 h després de la transfecció, l'ARNm de Per1 va augmentar significativament a les cèl·lules transfectades amb pLVX-v5Per1 en relació amb les cèl·lules transfectades amb el plasmidi de control (Fig. 5b). La transfecció de pLVX-v5Per1 també va provocar un augment significatiu de l'ARNm de Per2 (un membre de la família del rellotge del període que interacciona amb Per1) a les 24 h (figura suplementària 6b), tot i que aquest augment va ser molt menor que l'augment observat de Per1 (a 24 h, Per1: 466-augment de vegades sobre EV, Per2: 1.6-augment de vegades sobre EV). Tanmateix, la sobreexpressió de Per1 no va afectar la transcripció del gen Hes7 aigües avall més proper (figura suplementària 6c).

Per determinar si la sobreexpressió de Per1 milloramemòriarendiment en ratolins envellits, pLVX-v5Per1 es va infondre a l'hipocamp dorsal de ratolins 18-mo 2 setmanes abans del comportament. Els ratolins pLVX-v5Per1 van mostrar una millora significativamemòriaper OLM a la prova en relació amb els controls pLVX-EV (vector buit) (Fig. 5c). Només els ratolins pLVX-v5Per1 van mostrar un augment significatiu de la preferència per l'objecte en repòs en relació amb l'entrenament sense diferències de grup observades en l'exploració total a la prova (figura 5d) o en moviment durant l'habituació (figura suplementària 8d).

Després del comportament, el teixit de l'hipocamp d'un subconjunt d'animals es va processar per a la seqüenciació d'ARN per confirmar la presència de les transcripcions pLVX-EV i pLVX-v5Per1 als grups adequats in vivo (figura suplementària 7a, b, f, g).

Per complementar aquest enfocament, també hem utilitzat el sistema CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)33 per impulsar l'activació transcripcional de Per1 a l'hipocamp dorsal. Aquest sistema consta de tres components lentivirals: un catalíticamentCas9 inactiu (dCas9) fusionat amb un domini d'activació transcripcional VP64 amb una etiqueta GFP (dCas9-VP{64-GFP), un ARN d'una guia única (sgRNA) modificat per Per1 amb dos aptàmers d'ARN MS2 que poden reclutar el tercer component, una proteïna de fusió MS{2- activador transcripcional doble (MS{2-p{65-HSF1)(Fig. 5e). Els animals de control van rebre un sgRNA de control que no tenia la seqüència de 20 nucleòtids necessària per orientar el sistema SAM a Per1 (anomenat ctrl sgRNA). El muntatge d'aquests components al promotor Per1 permet que els tres dominis efectors (VP64, p65 i HSF1) impulsin la transcripció de Per1. Per confirmar, l'eficàcia de la figura 5 La sobreexpressió de Per1 a l'hipocamp dorsal millora les deficiències relacionades amb l'edat en la ubicació de l'objecte.memòria. un Esquema de la construcció de lentivirus utilitzat per sobreexpressar v{{0}}etiquetat Per1 (pLVX-v5Per1) en comparació amb el control vectorial buit (pLVX-EV). b L'ARNm de Per1 va augmentar significativament 24 i 48 h després de la transfecció de pLVX-v5Per1 a les cèl·lules HT22 en comparació amb les cèl·lules transfectades amb EV (ANOVA bidireccional: interacció de grup x punt de temps (F(1,8)=52.8, p <{{20}}.0{{40}}1), proves="" post="" hoc="" de="" sidak,="" ***p=""><0,001, n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-els="" ratolins="" que="" van="" rebre="" infusions="" hipocampals="" de="" plvx-v5per1="" van="" mostrar="" una="" memòria="" significativament="" millor="" per="" a="" olm="" que="" els="" ratolins="" que="" van="" rebre="" el="" virus="" de="" control="" plvx-ev="" (anova="" bidireccional:="" interacció="" virus="" x="" sessió,="" (f(1,29){34)="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" proves="" post="" hoc="" de="" sidak,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" tots="" els="" homes).="" d="" l'exploració="" total="" va="" ser="" similar="" per="" als="" dos="" grups="" a="" la="" prova="" (t(29)="0,57," p="0,57)." e="" esquema="" del="" sistema="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" utilitzat="" per="" impulsar="" la="" transcripció="" per1.="" a="" dalt:="" components="" individuals="" de="" sam.="" a="" baix:="" components="" muntats="" al="" promotor="" per1,="" impulsant="" la="" transcripció="" de="" per1.="" f="" l'arnm="" de="" per1="" es="" va="" augmentar="" significativament="" 48="" h="" després="" de="" la="" transfecció="" dels="" components="" crispr-sam="" a="" les="" cèl·lules="" ht22="" en="" comparació="" amb="" les="" cèl·lules="" transfectades="" amb="" l'arnsg="" de="" control="" (anova="" bidireccional:="" interacció="" de="" grup="" x="" punt="" de="" temps="" (f(1,8)="14.77)." ,="" p="">< 0,01),="" les="" proves="" post="" hoc="" de="" sidak,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." els="" ratolins="" g="" 18-mo="" que="" van="" rebre="" infusions="" hipocampals="" del="" sistema="" crispr-sam="" amb="" sgrna="" orientat="" a="" per1="" van="" mostrar="" significativament="">memòriaper a OLM en comparació amb ratolins de control EV amb sgRNA de control (ANOVA bidireccional: interacció virus x sessió (F(1,30)=5,83, p <0,05) ,="" proves="" post="" hoc="" de="" sidak,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" tots="" els="" homes).="" h="" l'exploració="" total="" va="" ser="" similar="" per="" als="" dos="" grups="" a="" la="" prova="" (t(30)="0.41," p="0.68)." les="" dades="" es="" presenten="" com="" a="" mitjana="" ±="" sem="" al="" sistema="" crispr-sam,="" vam="" transfectar="" cèl·lules="" ht22="" amb="" els="" tres="" plasmidis,="" vam="" recollir="" les="" cèl·lules="" 24="" o="" 48="" h="" després="" i="" vam="" mesurar="" l'expressió="" d'arnm="" de="" per1.="" a="" les="" 48="" h="" després="" de="" la="" transfecció,="" l'arnm="" de="" per1="" va="" augmentar="" significativament="" en="" el="" grup="" que="" va="" rebre="" arnsg="" de="" per1="" en="" comparació="" amb="" els="" controls="" (fig.="" 5f),="" confirmant="" que="" el="" sistema="" crispr-sam="" condueix="" eficaçment="" l'expressió="" d'arnm="" de="" per1.="" no="" vam="" observar="" cap="" canvi="" en="" l'expressió="" ni="" de="" l'arnm="" de="" per2="" (figura="" suplementària="" 6e)="" ni="" de="" l'arnm="" de="" hes7="" (figura="" suplementària="" 6f),="" cosa="" que="" indica="" que="" el="" sistema="" crispr-sam="" impulsa="" la="" sobreexpressió="" selectiva="" del="" gen="" objectiu,="">

A continuació, els ratolins 18-mo van rebre infusions intrahipocampals dels lentivirus CRISPR-SAM (figura suplementària 6d) i es van entrenar en OLM 2 setmanes més tard. Tal com es va observar amb la nostra sobreexpressió pLVX-v5Per1, la sobreexpressió Per1 mediada per CRISPR-SAM va millorar significativamentmemòriarendiment en ratolins infusionats amb sgRNA de Per1 en relació amb els animals de control (Fig. 5g) sense afectar l'exploració total (Fig. 5h) o el moviment durant l'habituació (Fig. 8e suplementària). Només els ratolins que van rebre l'ARNsg Per1 van mostrar un augment significatiu de la preferència per l'objecte en repòs en relació amb l'entrenament, cosa que indica que està intacte.memòriaper a les ubicacions dels objectes (Fig. 5g). Després del comportament, el teixit de l'hipocamp d'un subconjunt d'animals es va processar per a la seqüenciació d'ARN per confirmar la presència de les transcripcions CRISPR als grups adequats in vivo (figura suplementària 7c-g). En conjunt, aquests resultats demostren que la sobreexpressió de Per1 a l'hipocamp dorsal és suficient per millorar les deficiències relacionades amb l'edat en la memòria de localització d'objectes a llarg termini. Per1 és, per tant, un gen clau que és fonamental per a la formació de memòria a llarg termini, està regulat per HDAC3 i està deteriorat en el cervell envellit.

Discussió

Els nostres resultats mostren que la supressió o la interrupció de la histona deacetilasa HDAC3 repressiva pot millorar les deficiències relacionades amb l'edat tant a llarg termini.memòriai plasticitat sinàptica. A més, la supressió d'HDAC3 restaura l'expressió induïda per l'experiència del gen circadià Per1 a l'hipocamp dorsal. Com que l'expressió de PER1 a l'hipocamp és fonamental per a la formació de memòria a llarg termini (Fig. 4) i la sobreexpressió de Per1 a l'hipocamp millora els problemes de memòria relacionats amb l'edat (Fig. 5), PER1 és un mecanisme potencial mitjançant el qual millora la supressió de HDAC3.memòriai plasticitat sinàptica en ratolins envellits. De manera més àmplia, la interrupció de Per1 relacionada amb l'edat podria connectar deficiències relacionades amb l'edat tant en la memòria a llarg termini com en el ritme circadià, depenent de l'estructura.

Una de les conclusions clau de l'estudi actual va ser que els deterioraments relacionats amb l'edat en el LTP de l'hipocamp es podrien millorar amb la supressió o la interrupció d'HDAC3. Això és coherent amb el treball recent del laboratori Sajikumar que demostra que el bloqueig farmacològic d'HDAC3 també pot millorar els deterioraments relacionats amb l'edat en l'hipocamp associatiu LTP34. Curiosament, vam trobar que les rodanxes d'animals vells HDAC3flox/flox i HDAC3(Y298H) no van aconseguir el mateix nivell de potenciació que les rodanxes d'animals joves HDAC3flox/flox o HDAC3(Y298H) (Fig. 2c, f), cosa que suggereix que els cervells envellits poden tenir un sostre de plasticitat més baix que els cervells joves. Una possible explicació d'aquesta diferència de potenciació és que la pèrdua de contactes sinàptics relacionada amb l'edat en CA122 podria reduir el sostre de plasticitat a l'hipocamp envellit, ja que les menys sinapsis disponibles es saturarien més ràpidament que les sinapsis relativament abundants en el jove DH. Si aquest és el cas, enfortir el protocol d'estimulació o proporcionar atacs d'estimulació espaiats35 no hauria de millorar encara més la LTP a l'hipocamp envellit, ja que no hi ha sinapsis addicionals disponibles. Caldrà treballar més per determinar el mecanisme subjacent a aquesta diferència.

Els nostres resultats de seqüenciació d'ARN van demostrar que només un petit subconjunt de gens s'ajusta als criteris de restaurar-se al cervell envellit mitjançant la supressió de HDAC3 (Fig. 3e). Així, en lloc de recapitular el perfil d'expressió gènica del cervell jove, la supressió d'HDAC3 al cervell envellit va restaurar l'expressió induïda per l'experiència d'uns quants gens clau que són fonamentalment importants per a la formació de memòria a llarg termini, inclòs Per1. Per1 sembla estar regulat directament per HDAC3, ja que la supressió focal d'HDAC3 va restaurar l'expressió Per1 induïda per l'experiència i HDAC3 s'elimina físicament del promotor Per1 en resposta a l'entrenament OLM. A més, l'expressió Per1 és necessàriamemòria, ja que la derrota mediada per siRNA de la proteïna PER1 a la DH va deteriorar a llarg terminimemòriaformació en ratolins joves i la sobreexpressió va millorarmemòriaper OLM en ratolins envellits. En particular, ambdós sistemes lentivirals utilitzats per sobreexpressar Per1 només van transfectar un petit nombre de cèl·lules a l'àrea CA1b de l'hipocamp dorsal (figura suplementària 6a, d), cosa que fa necessari confirmar la presència d'aquestes construccions amb seqüenciació d'ARN (vegeu mètodes). ). Com que el treball anterior ha demostrat que aquesta regió precisa de l'hipocamp dorsal és fonamental per a OLM36, això demostra que fins i tot una petita alteració focal de Per1 dins d'una estructura rellevant per a la memòria pot afectar la formació de la memòria a llarg termini. Això amplia investigacions anteriors que mostren que la supressió no específica de Per1 a tot el cervell pot afectar la formació de memòria en ratolins joves6,28,29. La repressió anormal de Per1 mediada per HDAC3-al cervell envellit és, per tant, un esdeveniment clau que podria provocar deterioraments relacionats amb l'edat tant en la formació de la memòria a llarg termini com en el ritme circadià. Tot i que aquest estudi demostra clarament que Per1 és un gen important a través del qual HDAC3 regula la memòria a llarg termini en el cervell envellit, és probable que altres gens contribueixin als efectes de millora de la memòria de la supressió d'HDAC3. Altres gens proposats per mediar els efectes de HDAC3 sobre la plasticitat i la memòria sinàptica inclouen NF-κB34, FMRP37 i Nr4a226. En l'estudi actual, vam identificar tres gens addicionals (Fig. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) que, com Per1, mostren una expressió deteriorada al cervell envellit que es millora amb la supressió de HDAC3. Com aquests diferents gens contribueixen de manera única als efectes de millora de la memòria de la supressió d'HDAC3 no està clar actualment. En particular, tots aquests gens interactuen amb la via CBP/CREB, que és fonamental per a la formació de memòria a llarg termini38,39 i es troba tant amunt com a baix de PER16,28. Com que PER1 està aigües amunt de la fosforilació CREB6, és possible que la repressió mediada per HDAC3-de Per1 redueixi la fosforilació CREB, perjudicant finalment la transcripció de gens mediats per CREB com Fmrp40,41 i els membres de la família del gen Nr4a1 i Nr4a226. Comprendre la complexa dinàmica entre HDAC3, PER1 i aquests altres actors moleculars serà un objectiu important de les futures investigacions.

En l'estudi actual, hem utilitzat dos mètodes complementaris per sobreexpressar Per1 al cervell envellit: la sobreexpressió d'una construcció d'ADNc de Per1 de longitud completa mitjançant pLVX-v5Per1 i l'activació transcripcional de Per1 endògena mitjançant el sistema CRISPR-SAM. Tot i que la sobreexpressió mediada per pLVX va provocar un gran augment de l'ARNm de Per1 (figura 5b), això va anar acompanyat d'un augment de Per2, un altre membre de la família del període (figura suplementària 6b). L'expressió del gen aigües avall Hes7, però, no va canviar per pLVX-v5Per1 (figura suplementària 6c). El sistema CRISPR-SAM, d'altra banda, va produir un augment més subtil de l'ARNm de Per1 que va evitar millores fora de l'objectiu de l'expressió Per2 o Hes7 (figura suplementària 6e-f). Com que ambdós enfocaments van millorar de manera similar a llarg terminimemòriaen ratolins envellits, és poc probable que l'augment fora de l'objectiu de Per2 observat amb pLVX-v5Per1 fos la causa de la millora observada en la memòria a llarg termini.

Efectes circadians a llarg terminimemòriatradicionalment es creu que provenen de la desregulació dins del SCN, que després provoca alteracions en les estructures perifèriques implicades en la formació de la memòria, com l'hipocamp dorsal. Se sap poc sobre el paper dels gens del rellotge circadià individual en la DH, malgrat una clara connexió entre el ritme circadià i la formació de la memòria a llarg termini. La memòria està estretament relacionada amb l'hora del dia, ja que les cascades de gens relacionades amb la plasticitat mostren oscil·lacions circadianes3,6 imemòriaes pot adquirir més fàcilment en determinats períodes del cicle circadià. Per exemple, el condicionament de la por del context s'adquireix amb més força durant el dia, quan els nivells de fosforilació de MAPK assoleixen el pic3. A més, està ben documentat que l'envelliment va acompanyat d'una ruptura dels ritmes circadians, presumiblement a causa dels canvis en el rellotge circadià central, el nucli supraquiasmàtic (SCN) (per a la revisió1). Com es relaciona aquesta interrupció del rellotge circadià amb les deficiències relacionades amb l'edatmemòriaés una pregunta oberta. Els nostres resultats suggereixen que HDAC3 limita la Per1 induïda per l'experiència a l'hipocamp envellit, contribuint possiblement a les deficiències observades en la memòria a llarg termini. Per tant, la repressió epigenètica de Per1 pot representar una interfície important entre els deterioraments relacionats amb l'edat tant en la ritmicitat circadiana com en la formació de la memòria a llarg termini.

Dels gens bàsics del rellotge circadià canònic, Per1 està especialment preparat per afectar de manera espectacular l'hipocamp a llarg termini.memòria. Per1 sembla estar involucrat principalment en les vies de sortida de SCN i té un paper clau en els rellotges perifèrics aigües avall de l'SCN, com l'hipocamp42. A més, un treball recent suggereix que Per1 pot "gatejar" la formació de memòria espacial al llarg del cicle dia/nit controlant la fosforilació CREB6,28,29. De fet, la regulació de l'ARNm de Per1 de l'hipocamp s'ha observat després de l'aprenentatge del context o espacial en almenys altres tres estudis d'ARN-seq, inclòs el treball en rates, cosa que indica que Per1 normalment es regula després de l'aprenentatge entre espècies20,43,44. Juntament amb els resultats de l'estudi actual, aquest treball indica que l'expressió PER1 és de vital importància per a la formació de la memòria a llarg termini de l'hipocamp; les reduccions de PER1 que es produeixen a la nit29 o amb l'envelliment podrien afectar l'hipocampmemòria. Quedar,

investigació que implica Per1 enmemòriaLa formació s'ha basat exclusivament en els nocauts globals que pertorben l'expressió de Per1 al rellotge circadià central i altres regions, a més d'estructures rellevants per a la memòria com l'hipocamp6,28,29,45,46, cosa que fa impossible determinar si el PER1 de l'hipocamp és específicament necessari per formació de la memòria. De fet, la supressió global de Per1 afecta el ritme circadià en alguns informes42. Aquí, mostrem per primera vegada que reduir l'expressió de PER1 directament a l'hipocamp dorsal pot afectarmemòriaen ratolins joves, mentre que la sobreexpressió local de Per1 a l'hipocamp dorsal pot millorar la memòria en ratolins envellits. Com que la supressió selectiva HDAC3 (que regula Per1) a l'hipocamp dorsal no va tenir cap efecte sobre els patrons d'activitat circadiana en l'estudi actual (figura suplementària 4), i fins i tot les lesions electrolítiques de l'hipocamp dorsal són insuficients per afectar el ritme circadià47, sembla poc probable que manipular Per1 dins de l'hipocamp dorsal afecta la funció del rellotge circadià central. No obstant això, és possible que els augments de Per1 induïts per l'experiència o la sobreexpressió de Per1 mediada pel virus puguin afectar l'oscil·lació circadiana d'altres jugadors moleculars, com altres gens de rellotge, dins de les neurones de l'hipocamp, fins i tot sense afectar els patrons d'activitat circadiana. Comprendre com funciona Per1 per alterar la formació de la memòria, inclosa la identificació d'aquests socis potencials que interactuen, serà l'objectiu del treball futur.

En conjunt, aquests resultats demostren que el gen central del rellotge circadià Per1 té un paper clau dins localmemòriaestructures per alterar la formació de la memòria, un paper que és independent de la seva funció al SCN. De manera més general, això desafia la hipòtesi tradicional que els canvis circadiansmemòriaLa formació està impulsada per alteracions en el rellotge circadià central i, en canvi, dóna suport a la hipòtesi que els gens del rellotge circadià tenen un paper més autònom a les cèl·lules de l'hipocamp, possiblement detenint la formació de memòria en funció de l'hora del dia6.

Mètodes

Els ratolins. Els ratolins adults joves tenien entre 2 i 4 mesos d'edat en el moment de la prova i els ratolins envellits tenien entre 18 i 20 mesos. Tots els ratolins eren C57BL/6J o es mantenien en un fons C57BL/6 (ratolins HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox). Els ratolins tenien accés lliure al menjar i l'aigua i les llums es van mantenir en un cicle de 12 h llum/fosc. Totes les proves de comportament es van realitzar durant el cicle de llum. Tots els experiments es van dur a terme segons les directrius dels Instituts Nacionals de Salut dels EUA per a la cura i l'ús dels animals i van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Califòrnia, Irvine.

Cirurgia. Els ratolins van ser anestesiats amb isoflurà (induït, 4 per cent; mantingut 1,5–2.0 per cent) i es van col·locar a l'estereotàxic. Les agulles d'injecció es van baixar a l'hipocamp dorsal a una velocitat de 0,2 mm/15 s (AP, -2,0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, -1,5 mm en relació amb Bregma ). Dos minuts després d'arribar a la profunditat objectiu, es van infondre 1,0 ul de virus o siRNA bilateralment a la DH a una velocitat de 6 ul/h. Per a les infusions lentivirals CRISPR-SAM, es va infusionar un còctel dels tres virus fins a un volum final d'1, 5 μL per hemisferi a la mateixa velocitat. Les agulles d'injecció van romandre al seu lloc durant dos minuts després de la injecció per permetre que el virus es difongués. Aleshores, els injectors es van aixecar 0,1 mm i es van deixar reposar durant un minut més abans de ser retirats a una velocitat de 0,1 mm per 15 s. Les infusions víriques es van realitzar 2 setmanes abans de l'anàlisi del comportament, mentre que la derrota de siRNA es va realitzar 2d abans de l'entrenament13. Per a tots els experiments d'injecció, els animals es van assignar aleatòriament a les diferents condicions d'injecció (a excepció dels ratolins HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox, que es van injectar tots amb AAV-CaMKII-Cre). Per a tots els experiments de comportament, els animals de cada condició viral es van assignar aleatòriament a grups de gàbia/entrenats i totes les condicions (objectes, caixes, etc.) es van contrarestar entre grups.

Producció AAV. AAV2.1-CaMKII-Cre es va comprar a Penn Vector Core (títol: 1,81 × 1013 GC/ml). Per a AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, vam amplificar HDAC3 de tipus salvatge a partir de l'ADNc de l'hipocamp i vam clonar el producte en un pAAV-IRES-hrGFP modificat (Agilent) sota el control del promotor CMV i l'intró de la globina. L'etiqueta 3×-FLAG, l'element IRES i hrGFP es van eliminar del vector i es van substituir per una etiqueta V5, permetent una fusió C-terminal amb HDAC3 (plasmid MW91). Per crear la mutació puntual, vam canviar els nucleòtids per codificar un residu d'histidina en lloc de la tirosina a l'aminoàcid 298 (plasmid MW92). Per al control vectorial buit, la seqüència de codificació HDAC3 no estava present, però es mantenen tots els altres elements (plasmidi MW87). L'AAV es va fer pel Penn Vector Core i els títols finals es van determinar mitjançant qPCR (AAV-HDAC3 (Y298H): 6,48 × 1012 GC / ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC / ml).

Producció de lentivirus. Per al sistema CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM), es van comprar plasmidis lentivirals a Addgene per al dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) i MS2- Construccions P65-HSF{1_Higro (#61426-LVC) (títols superiors o iguals a 8 × 106 TU/ml). Per al sgRNA Per1, vam clonar i inserir una seqüència de guia antisentit corresponent a l'element CRE al promotor Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) a la columna vertebral de clonació Addgene sgRNA (MS2) (#61427). El sgRNA de control era idèntic, excepte que no es va clonar cap seqüència guia al plasmidi. Els lentivirus tant per a l'sgRNA Per1 (títol: 6,8 × 107 IFU/ml) com per a l'sgRNA de control (3,5 × 107 IFU/ml) van ser produïts pel Laboratori Lentiviral de l'Escola de Farmàcia de la USC.

Per a la construcció de sobreexpressió pLVX-V5Per1, vam amplificar Per1 de tipus salvatge de longitud completa a partir del plasmidi Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (núm. 16203) i vam clonar el producte en un pLVX-EF1 -IRES-mCherry modificat. columna vertebral (Takara, #631987). Els elements IRES i mCherry es van eliminar i es van substituir per una etiqueta V5, permetent una fusió N-terminal amb PER1 (plasmid MW206). Per al control del vector buit (EV), la seqüència de codificació PER1 no estava present, però tots els altres elements es van mantenir (Plàsmid MW93). Els lentivirus per a pLVX-v5Per1 (títol: 1,3 × 108 IFU/ml) i pLVX-EV (títol: 1,5 × 108 IFU/ml) van ser produïts pel Laboratori Lentiviral de l'Escola de Farmàcia de la USC. Totes les construccions lentivirals es van expressar sota el promotor EF1.

Verificació de cultiu cel·lular de pLVX-v5Per1 i CRISPR-SAM. Per verificar que pLVX-v5Per1 produeix una sobreexpressió d'ARNm de Per1, es van transfectar cèl·lules HT22 de ratolí (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) amb pLVX-v5Per1 o pLVX-EV (Fig. 5a) mitjançant Lipofectaine LTX (Invitrogen). De la mateixa manera, per verificar que el sistema CRISPR-SAM pot impulsar eficaçment la transcripció Per1, les cèl·lules HT22 es van transfectar amb dCas9-VP64 (lenti MS{2-P65_HSF1_Blast va ser un regal de Feng Zhang Addgene plasmidi #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast va ser un regal de Feng Zhang, Addgene plasmidi #61426), i qualsevol Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) o l'sgRNA de control no dirigit (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo backbone va ser un regal de Feng Zhang, plasmidi Addgene #61427) amb Lipofectamine LTX (Invitrogen). Les cèl·lules es van recollir després de 24 o 48 h, es van lisar i es va aïllar l'ARNm tal com es descriu anteriorment. La qRT-PCR es va realitzar tal com es descriu anteriorment mitjançant els primers i la sonda Per1, Per2 i Hes7 que figuren a la taula S4.

siRNA. Per a l'experiment de derrota de Per1, els petits ARN interferents d'Accell SMARTpool (siRNAs; Dharmacon, GE) dirigits a Per1 es van diluir fins a una concentració total final d'1 0 μM en ddH20 i es van infondre al DH (1, 0 ul / costat). Es va utilitzar el siRNA de la piscina sense orientació Accell com a control (concentració total, 10 μM) i es va infusionar de la mateixa manera. Per als experiments de siRNA, els ratolins es van manipular i habituar tal com es descriu anteriorment i es va realitzar una cirurgia l'endemà de l'últim dia d'habituació. Els ratolins van rebre un dia complet de recuperació després de la cirurgia i van ser entrenats l'endemà (~ 48 h després de la cirurgia) per garantir la màxima derrota de l'objectiu. Per garantir la derrota, els ratolins es van sacrificar ~ 1 h després de la prova i es van processar els cops de l'hipocamp dorsal amb western blots per garantir la derrota de la proteïna PER1.

Localització d'objectes i reconeixement d'objectesmemòriatasques. Per a les tasques de memòria d'ubicació d'objectes i reconeixement d'objectes, els ratolins es van manipular durant 2 min/dia durant 4 dies i després es van habituar al context durant 5 min/dia durant sis dies consecutius en absència d'objectes. Durant l'entrenament, els ratolins van ser exposats a dos objectes idèntics (vasos de 100 ml, llaunes d'espècies o portaespelmes de vidre) i es van deixar explorar durant 10 min. Durant la prova de retenció (24 h més tard per a llarg terminimemòriao 60 m més tard per a la memòria a curt termini), els ratolins es van permetre explorar durant 5 minuts. Per a la ubicació de l'objectememòria, un dels dos objectes coneguts es va traslladar a una nova ubicació. Per al reconeixement d'objectesmemòria, les ubicacions dels objectes es van mantenir constants però un dels objectes es va substituir per un nou element. L'habituació per a la memòria de reconeixement d'objectes va començar almenys una setmana després de la finalització de les proves OLM i es va utilitzar un context nou i objectes desconeguts48. L'exploració es va puntuar quan el cap del ratolí s'orientava cap a l'objecte i arribava a 1 cm o quan el nas tocava l'objecte. Es va registrar el temps total d'exploració (t) i la preferència pel nou ítem es va expressar com un índex de discriminació (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel més tfamiliar) x 100 per cent). Per a les sessions d'entrenament, l'objecte designat per moure's a la prova es va utilitzar com a objecte nou per permetre que es comparessin directament l'entrenament i la prova DI. Els ratolins que van explorar ambdós objectes durant menys de 2 s durant la prova o 3 s durant l'entrenament es van eliminar de l'anàlisi posterior. També es van eliminar els ratolins que mostraven preferència per un objecte durant l'entrenament (DI> ± 20). Les sessions d'habituació es van analitzar (per determinar la distància recorreguda i la velocitat) mitjançant el programari d'anàlisi del comportament ANY-maze (Stoelting Co). Tota l'habituació, l'entrenament, les proves i la puntuació van ser realitzades per experimentadors cecs als grups experimentals.

Context por a condicionar. Per al condicionament de la por contextual, els ratolins es van manipular primer durant 5 dies. Durant l'adquisició, els ratolins es van exposar al context durant 2 min i 28 s seguits d'un xoc de 2 s (0.75 mA), un protocol que normalment produeix una memòria robusta a llarg termini12,20. Els ratolins van romandre en el context durant 30 s addicionals abans de ser eliminats. Els ratolins van ser sacrificats 60 m després de l'entrenament juntament amb controls de la gàbia que es van manipular però no entrenats. El comportament de congelació es va mesurar mitjançant el programari Ethovision 11 (Noldus)12.

Laberint més elevat. El més-laberint va ser realitzat per un experimentador cec als grups experimentals. Una setmana després de la finalització de l'ORM, es va provar un subconjunt de ratolins al laberint plus. Dos braços del laberint estaven oberts (30 × 5 cm) i dos braços tancats (30 × 5 × 15 cm), connectats per una plataforma central (5 × 5 cm). El laberint estava elevat 40 cm per sobre del terra. Els ratolins es van provar durant 5 minuts a l'aparell, que consistia a col·locar cada ratolí a la plataforma central de cara a un dels braços oberts. Entre subjectes, el laberint es va netejar amb etanol al 70%. El percentatge de temps passat en els braços tancats i oberts es va puntuar mitjançant el programari ANY-maze.

Anàlisi del ritme circadià. Es van criar ratolins joves ({{0}}mes) i envellits (18-mes) HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox i es van allotjar sota un cicle de 12 h de llum/foscor (LD). Dues setmanes després de la infusió d'AAV-CaMKII-Cre (descrita anteriorment), els ratolins es van transferir a una sala aïllada de 12 h LD durant 7 dies. A continuació, els ratolins es van transferir a una sala d'anàlisi d'activitat protegida contra la llum, on es va analitzar l'activitat locomotora mitjançant detectors de moviment de feix òptic (Philips Respironics). L'activitat es va controlar durant 2 setmanes d'entrament del cicle LD a l'habitació protegida per la llum abans que els ratolins es canviessin a la foscor constant (DD) durant 3 setmanes addicionals. El seguiment de l'activitat va continuar durant la fase DD per determinar si la supressió d'HDAC3 a la DH va afectar els ritmes circadians endògens. Les dades es van recollir mitjançant Minimitter VitalView 5.0 i es va utilitzar el programari Clocklab (Actimetrics) per determinar l'inici de l'activitat lliure. Els valors de Tau es van calcular obtenint el pendent d'aquest inici i calculant l'ajust de mínims quadrats amb el programari Clocklab49,50.

Immunohistoquímica. Després de la finalització del comportament, els ratolins van ser sacrificats per luxació cervical i els seus cervells van ser eliminats i congelats en isopentà gelat. Es van recollir rodanxes de vint micròmetres a tot el campus dorsal del maluc, es van descongelar en portaobjectes i es van emmagatzemar a -8 0 graus. Les diapositives es van fixar amb un 4% de paraformaldehid (10-min), permeabilitzat en 0.{01 per cent de Tritó X-100 en 0,1 M PBS (5-min) , i bloquejat durant 1 h amb sèrum de cabra normal al 8 per cent (Jackson). Les diapositives es van incubar durant la nit (4 graus) en anticossos de conill contra HDAC3 (1:250, Abcam, clon Y415, ab32369) o V5 (1:1000, Abcam, ab9116) o anticossos de pollastre contra GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). L'endemà, es van rentar les diapositives i es van incubar durant 1 h a temperatura ambient amb Alexa 488 anti-conill de cabra (HDAC3 i V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) o Alexa 488 anti-pollastre de cabra (GFP). ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) a les fosques. A continuació, es van rentar les diapositives amb PBST i es van incubar durant 50 m en NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), una taca fluorescent de nissl. Per apagar l'autofluorescència no específica51, les rodanxes es van rentar en PBS amb un 0,01 per cent de Tritó, es van esbandir amb aigua i es van incubar durant 10- min en CuSO4 10 mM en tampó d'acetat d'amoni 50 mM. Les rodanxes es van esbandir de nou amb aigua, es van rentar amb PBS i es van col·locar amb el medi de muntatge VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Totes les imatges es van adquirir amb un Olympus Scanner VS110 amb un objectiu apocromàtic de 20x (obertura numèrica 0,75) amb el programari d'escàner VS110. Tots els grups de tractament es van representar a cada diapositiva i totes les imatges d'una diapositiva es van capturar amb el mateix temps d'exposició en condicions no saturants. La intensitat de l'immunoetiquetatge es va quantificar amb ImageJ mostrant la densitat òptica de la capa cel·lular a CA1 i restant una mostra de fluorescència de fons a la mateixa imatge. Per a tots els experiments AAV, es van excloure de les anàlisis els animals que no van expressar el virus a l'àrea CA1 de l'hipocamp dorsal. La imatge i la quantificació van ser realitzades per experimentadors cecs a les condicions experimentals.

Western blot. Per verificar la derrota de PER1, els ratolins de siRNA de Per1 i de control es van sacrificar 2 hores després de la prova i els cervells es van congelar. Els cervells es van seccionar coronalment i es van recollir punxons DH d'1 mm de rodanxes de 500 μm. Els punxons es van homogeneïtzar en tampó T-PER (Thermo Fisher) amb proteasa Halt i inhibidor de fosfatasa (Thermo Fisher) mitjançant un homogeneïtzador Dounce. Els lisats de proteïnes es van quantificar mitjançant un assaig de Bradford modificat (BioRad) i es van carregar 50 ug de lisat proteic total a cada carril d'un gel NuPAGE Bis-Tris al 7,5 per cent (Thermo Fisher). Els gels van funcionar durant 50 min a 200 volts i es van transferir taques durant la nit a 15 V a 4 graus a membranes de nitrocel·lulosa (Novexi, LC2001). L'endemà, les membranes es van incubar en tampó de bloqueig durant 1 h (5 per cent de llet sense greix en solució salina tamponada amb Tris amb un 0,01 per cent de Tween 20), es van rentar (0,1 per cent de Tween 20 en TBS) i després es van incubar en anticossos primaris (1:500, conill anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) al tampó d'anticossos primari (3 per cent de BSA en TBS amb 0,1 per cent de Tween) durant la nit a 4 graus. A continuació, es van rentar les membranes i es van incubar en anticossos de ratolí conjugat amb HRP al conill (1:10,000, Jackson Laboratories, específica de cadena lleugera, #211-032-171) durant 1 h. Les membranes es van rentar i es van desenvolupar amb el substrat quimioluminiscent Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Es van utilitzar múltiples exposicions de pel·lícules per verificar la linealitat. Les taques es van rentar i es van retirar durant 10 m amb Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), es van rentar de nou i després es van tornar a sondar durant la nit (4 graus) amb un anticòs de conill contra GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778). ). Les taques PER1 i GAPDH de longitud completa es mostren a la figura suplementària 5. Les densitats òptiques relatives es van calcular a partir de la pel·lícula escanejada mitjançant ImageJ (Instituts Nacionals de Salut dels EUA) per un experimentador cec a les condicions experimentals. Tots els valors es van normalitzar als nivells d'expressió de GAPDH.

qRT-PCR. Es va recollir teixit dels punxons DH (descrits anteriorment) i es va congelar a -80 graus fins al seu processament. L'ARN es va aïllar mitjançant un RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) i l'ADNc es va crear mitjançant el kit de síntesi d'ADNc Transcriptor First Strand (Roche, 04379012001). Els cebadors i les sondes es van derivar de la Roche Universal ProbeLibrary (taula S4) i es van utilitzar per a la multiplexació a la màquina Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Tots els valors es van normalitzar a Gapdh. Les anàlisis i les estadístiques es van realitzar mitjançant els algorismes propietaris de Roche i el programari REST 2009 basat en el mètode Pfaff52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 es van incloure a la nostra anàlisi. Les biblioteques d'ADNc per a cada grup es van preparar segons la Guia de preparació de mostres d'ARN TruSeq (Illumina). Es van purificar dos-cents cinquanta nanograms d'ARN total de cada ratolí amb perles magnètiques unides a un oligopoli-T i es van fragmentar amb calor. Després es va sintetitzar i purificar la primera i la segona cadena d'ADNc. Després que els extrems s'estumessin, l'extrem 3′ es va adenilar per evitar la concatenació de la plantilla durant la lligadura de l'adaptador. Per a cada grup, es va afegir un conjunt d'adaptadors únic als extrems de l'ADNc i les biblioteques es van amplificar mitjançant PCR. La qualitat de la biblioteca es va avaluar per Bioanalyzer i es va quantificar mitjançant qRT-PCR amb una corba estàndard preparada a partir d'una biblioteca de seqüenciació comercial (Illumina). Les mostres es van multiplexar, amb cada grup de comportament representat a cada cel·la de flux del seqüenciador. 10 nM de cada biblioteca es van agrupar en quatre biblioteques multiplex i es van seqüenciar en un instrument Illumina HiSeq 2500 durant una seqüenciació de 50 bp d'una sola lectura, dirigida per la instal·lació d'alt rendiment genòmic de la Universitat de Califòrnia, Irvine. Les dades de seqüenciació resultants per a cada biblioteca es van processar posteriorment per produir fitxers FastQ. A continuació, les dades es van desmultiplexar i es van filtrar mitjançant el programari Illumina CASAVA 1.8.2 i el programari intern. Es van eliminar de les anàlisis les lectures de mala qualitat (en fracassar les proves de qualitat estàndard d'Illumina) i les lectures de control alineades amb èxit amb el genoma de control PhiX. La qualitat de les seqüències restants es va avaluar encara més mitjançant puntuacions de qualitat PHRED produïdes en temps real durant el pas de trucada de base de la seqüenciació (figura suplementària 3a).

Alineació amb el genoma i el transcriptoma de referència. Les lectures de cada experiment es van alinear per separat amb el genoma de referència i el transcriptoma corresponent mitjançant alineadors de lectura curta ELAND v2e (Illumina) i Bowtie24. Al transcriptoma es van incloure lectures alineades de manera única per ambdues eines amb exons coneguts o unions d'empalmament amb no més de dos desajustos en qualsevol fragment de 25 bp de la lectura. Les lectures alineades de manera única, però amb més de dos desajustos en qualsevol fragment de 25 pb de la lectura es van eliminar de les anàlisis. De la mateixa manera, es van eliminar de l'anàlisi les lectures que coincideixen amb diverses ubicacions del genoma de referència. El percentatge de lectures assignades al genoma i al transcriptoma de referència mitjançant aquest protocol s'informa per a cada grup de rèpliques (figura suplementària 3b). Això va donar lloc a una mitjana d'aproximadament 30 milions de lectures per mostra.

Per verificar la presència dels plasmidis pLVX i CRISPR-SAM després de la infusió lentiviral, vam executar la seqüenciació d'ARN en mostres d'hipocamp d'un subconjunt de tres animals per grup seguint el comportament. Com que el nombre de cèl·lules infectades amb els lentivirus in vivo era massa petit per detectar de manera fiable la presència de les transcripcions adequades mitjançant RT-qPCR (figura suplementària 6a, d), vam utilitzar RNA-seq com a mètode més sensible per detectar la presència. d'aquestes transcripcions. Es va crear una versió actualitzada del conjunt del genoma i l'anotació del genoma afegint les seqüències i l'anotació de les construccions plasmídiques al genoma original del ratolí mm10 i a l'anotació del genoma del ratolí mm10, respectivament. Utilitzant l'eina d'alineació de lectures TopHat a la Tuxedo Suite54, les lectures es van mapar al genoma i només es van considerar els hits que eren únics per a les transcripcions de plasmidis en comparació amb el genoma endògen de referència del ratolí. A continuació, es va quantificar el nombre d'aquestes lectures coincidents per a cada construcció per a cada mostra.

Expressió gènica i anàlisi diferencial. Els nivells d'expressió gènica es van calcular directament a partir dels resultats de l'alineació de lectura per a cada rèplica. Els valors estàndard de RPKM55, lectures per quilobase de model d'exons per milió de lectures mapejades) es van extreure per a cada gen cobert per les dades de seqüenciació i cada rèplica utilitzada en aquest estudi.

Es van realitzar anàlisis transcripcionals diferencials mitjançant Cyber ​​T56,57 a cada parell de grups (gaula domèstica versus 60 m després de l'entrenament) per identificar gens regulats a l'alça o a la baixa després de l'OLM. A més dels ratolins HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox de 18-mes d'edat entrenats per a l'estudi actual, les dades de seqüenciació d'ARN processades de manera idèntica de ratolins C57 de tipus salvatge de {{1{0}}mes d'edat ( homecage i OLM entrenat de la mateixa manera que l'estudi actual) d'un estudi anterior20 es va utilitzar per a anàlisis diferencials. El nombre d'animals (rèpliques biològiques) per a cada grup va ser: Young HDAC plus/plus HC: 6, Young HDAC3 plus/plus OLM: 6, Old HDAC3 plus/plus HC: 6, Old HDAC3 plus/plus OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, Old HDAC3flox/flox OLM: 8. No es van utilitzar rèpliques tècniques. El llindar del valor p utilitzat per determinar l'expressió diferencial és 0,05 per a tots els grups. La taxa de descoberta falsa (FDR) mesurada pel valor q de Benjamini & Hochberg (BH) es va utilitzar per corregir proves múltiples, amb un llindar de FDR de 0,15. Els conjunts de gens regulats després de l'experiència (en comparació amb la gàbia) per a aquests 3 grups (tip salvatge jove, HDAC envellit plus/plus o HDAC3flox/flox envellit) es van tallar per determinar gens comuns a dos o més grups. L'enriquiment de cada grup per a l'expressió específica del teixit, els termes d'ontologia gènica58 i les vies KEGG59,60 es va avaluar mitjançant DAVID61, basant-se en gens expressats de manera diferent després del comportament. La visualització de dades es va realitzar mitjançant "matplotlib" per a Python i "ggplot" per a R.

Immunoprecipitació de la cromatina. El ChIP es va realitzar en punxons DH basats en el protocol del kit Millipore ChIP11,12,62. El teixit es va reticular amb un 1 per cent de formaldehid (Sigma), es va lisar i es va sonicar, i la cromatina es va immunoprecipitar durant la nit amb 2 ul d'anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) o 4 ul d'anti-HDAC3 (Millipore #{{{{). 13}}) o una quantitat equivalent de sèrum de conill normal (control negatiu H4K8Ac, Millipore) o IgG anti-ratolí (control negatiu HDAC3, Millipore). Després del rentat, la cromatina es va eluir de les perles i es va reticular inversament en presència de proteinasa K abans de la purificació de la columna d'ADN. Les seqüències de primers per als promotors de cada gen van ser dissenyades pel programa Primer 3 (taula S4). Es van examinar per duplicat cinc ul d'entrada, IgG anti-H4K8Ac/IgG anti-HDAC3 o immunoprecipitat IgG anti-conill/ratolí de cada animal. Per normalitzar les dades de ChIP-qPCR, hem utilitzat el mètode d'entrada del percentatge. La mostra d'entrada es va ajustar al 100 per cent i les mostres IP i IgG es van calcular com a percentatge d'aquesta entrada mitjançant la fórmula 100 * AE ^ (entrada ajustada - Ct (IP)). A continuació, es va calcular l'enriquiment de plecs com a relació entre el ChIP i la IgG mitjana. Una corba estàndard a la placa va determinar l'eficiència d'amplificació (AE).

Preparació i enregistrament de llesques. Els ratolins joves (aproximadament 3-mes) i envellits (18-mes) es van infondre estereotàxicamente amb el virus. Per al primer experiment, els ratolins HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox joves i grans van ser infusionats amb AAV-CaMKII-Cre bilateralment al DH. Per al segon experiment, es van infondre ratolins C57 de tipus salvatge joves i vells amb AAV-HDAC3 (Y298H) a la DH d'un hemisferi i el control AAV-EV a l'altre hemisferi. Dues setmanes després de la infusió (per permetre una expressió òptima del virus)2, es van col·locar rodanxes d'hipocamp transversals (320 μm) en una cambra de gravació d'interfície amb líquid cefaloraquidi artificial preescalfat (31 ± 1 graus) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM). KH2PO4, 1,5 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 i 10 mM de D-glucosa). Les rodanxes es van perfondre contínuament a una velocitat d'1,75-2 ml per minut mentre la superfície de les rodanxes s'exposava a un 95 per cent d'O2 / 5 per cent de CO2 humidificat i càlid. Els enregistraments van començar després d'almenys 2 h d'incubació.

Els potencials postsinàptics excitadors de camp (fEPSP) es van registrar a partir de l'estrat radiatum CA1b mitjançant una sola pipeta de vidre (2–3MΩ) plena de 2 M NaCl. Els polsos d'estimulació (0.05 Hz) es van lliurar a les projeccions col·laterals de la comissura de Schaffer mitjançant un elèctrode estimulant bipolar (filferro de nicrom trenat, 65 μm) situat a CA1c. La intensitat actual es va ajustar per obtenir el 50 per cent de la resposta màxima de fEPSP. Després d'establir una línia de base estable, es va induir LTP amb un únic tren de cinc ràfegues theta, en què cada ràfega (quatre polsos a 100 Hz) es va lliurar a 200 ms de distància (és a dir, a freqüència theta). La intensitat de l'estimulació no va augmentar durant el TBS. Les dades es van recollir i digitalitzar mitjançant el sistema d'adquisició de neurodades NAC 2.0 (Theta Burst).

Anàlisi estadística. Les anàlisis estadístiques es van realitzar tal com s'indica al text i les llegendes de les figures mitjançant Prism 6 (GraphPad). Els nostres enfocaments analítics es basen en treballs publicats anteriorment12,20,63,64. No es van utilitzar mètodes estadístics per predeterminar les mides de mostra, però les nostres mides de mostra són similars a les que s'utilitzen generalment en el camp, incloses les informades a les publicacions anteriors12,20,64,65. Es va suposar que la distribució de dades era normal, amb una variància similar observada entre grups, però això no es va provar formalment. Quan un experiment tenia dos grups per comparar, es van utilitzar les proves t de Student de dues cues. Quan es van comparar dos factors (com l'edat i el genotip o la sessió i el grup), les dades es van analitzar amb ANOVA de dues vies seguits de les comparacions múltiples de Sidak post hoc. Totes les anàlisis són de dues cues, amb un valor de 0,05 requerit per a la significació. Les barres d'error de totes les xifres representen SEM. Per a tots els experiments, els valors ± 2SD de la mitjana del grup es van considerar atípics i es van eliminar de les anàlisis.

Disponibilitat de dades. Les dades que donen suport a les conclusions d'aquest estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable. Les dades de seqüenciació d'ARN s'han dipositat al Gene Expression Omnibus de NCBI i són accessibles mitjançant el número d'accés GSE94832 de la sèrie GEO.

Referències

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Les alteracions epigenètiques del nucli supraquiasmàtic i de l'hipocamp contribueixen al declivi cognitiu relacionat amb l'edat. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Ritmes circadians i formació de la memòria. Nat. Reverent Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Oscil·lació circadiana de l'activitat MAPK i cAmp de l'hipocamp: implicacions per a la persistència de la memòria. Nat. Neurosci. 11, 1074–1082 (2008).

4. Chaudhury, D. i Colwell, CS Modulació circadiana de l'aprenentatge i la memòria en ratolins condicionats per la por. Comportament. Cervell Res. 133, 95– 108 (2002).

5. Kondratova, AA i Kondratov, RV El rellotge circadià i la patologia del cervell envellit. Nat. Reverent Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. i Stehle, JH Període 1 comporta la modulació circadiana de la senyalització rellevant per a la memòria a l'hipocamp del ratolí mitjançant la regulació del transport nuclear de la CREB cinasa pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA i Sweatt, JD Una hipòtesi epigenètica de la disfunció cognitiva relacionada amb l'envelliment. Neurosci de l'envelliment frontal. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. L'acetilació d'histones alterada s'associa amb un deteriorament de la memòria depenent de l'edat en ratolins. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. La inhibició de H3K9me3 millora la memòria, promou la formació de la columna vertebral i augmenta els nivells de BDNF a l'hipocamp envellit. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS i Rapp, PR. Contribucions epigenètiques a l'envelliment cognitiu: desenredar la ment i la vida útil. Aprèn Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. L'inhibidor selectiu de l'HDAC3-augmenta l'extinció del comportament de recerca de cocaïna de manera persistent. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. El context i la por auditiva estan regulades de manera diferent per l'activitat HDAC3 als subnuclis laterals i basals de l'amígdala. Neuropsicofarmacologia 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 és un regulador negatiu crític de la formació de memòria a llarg termini. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. La inhibició de la histona deacetilasa mitjançant RGFP966 allibera els frens a la plasticitat cortical sensorial i l'especificitat de la formació de la memòria. Neurosci. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Desenvolupant l'activitat catalítica oculta de les histones deacetilases de classe IIa de vertebrats. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 104, 17335–17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. La funció independent de la desacetilasa de HDAC3 en la transcripció i el metabolisme requereix un corepressor del receptor nuclear. Mol. Cel·la 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. Funcions diferents per al domini de la desacetilasa de HDAC3 a l'hipocamp i l'escorça prefrontal medial en la formació i extinció de la memòria. Neurobiol. Aprèn. Mem. 145, 94– 104 (2017).

18. Nott, A. et al. La histona deacetilasa 3 s'associa amb MeCP2 per regular FOXO i el comportament social. Nat. Neurosci. 19, 1497– 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR La histona deacetilasa 3 és necessària per al desenvolupament correcte del cervell. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. La subunitat reguladora de la cromatina específica de la neurona BAF53b és necessària per a la plasticitat i la memòria sinàptica. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Factors de transcripció en la memòria a llarg termini i la plasticitat sinàptica. Physiol. Rev. 89, 121– 145 (2009).

22. Barnes, CA Potenciació a llarg termini i envelliment del cervell. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Base de dades del navegador del genoma UCSC: actualització de 2016. Àcids nucleics Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. i Salzberg, SL Alineació ultraràpida i eficient de memòria de seqüències d'ADN curtes al genoma humà. Genoma Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Les anàlisis d'expressió de l'hipocamp revelen una associació selectiva de vies immediates-precoces, neuroenergètiques i mielinogèniques amb deteriorament cognitiu en rates envellides. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Funcions diferencials per a Nr4a1 i Nr4a2 a la memòria a llarg termini de la ubicació d'objectes versus el reconeixement d'objectes. Aprèn Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Efectes de la privació del son i l'envelliment en la memòria a llarg termini i remota en ratolins. Aprèn Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 coordina els ritmes de l'hipocamp i el processament de la memòria amb el dia. Hipocamp 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. et al. La dinàmica temporal de l'expressió gènica del rellotge de l'hipocamp del ratolí admet el processament de la memòria. Hipocamp 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Les oscil·lacions circadianes dins de l'hipocamp donen suport a la formació i la persistència de la memòria. Front Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK i McGaugh, JL Expressió gènica dependent de l'experiència a l'hipocamp de la rata després de l'aprenentatge espacial: una comparació dels gens primerencs immediats Arc, c-fos i zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Modificacions de la cromatina i la seva funció. Cel·la 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Activació transcripcional a escala del genoma mitjançant un complex CRISPR-Cas9 dissenyat. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV i Sajikumar, S. La inhibició de la histona deacetilasa 3 restableix l'etiquetatge sinàptic i la captura en l'envelliment mitjançant l'activació del factor nuclear kappa B. Sci. Rep 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Evidència sinàptica de l'eficàcia de l'aprenentatge espaiat. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. L'eliminació focal de l'hipocamp de la CBP afecta les modificacions específiques de les histones, la potenciació a llarg termini i la memòria a llarg termini. Neuropsicofarmacologia 36, ​​1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR i McMahon, LL L'augment de la potenciació a llarg termini a les sinapsis de cèl·lules grànuls dentades de la ruta medial-perforant induïda per la inhibició selectiva de la histona desacetilasa 3 requereix una proteïna de retard mental X fràgil. Neurobiol. Aprèn. Mem. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB i la memòria. Ann. Reverent Neurosci. 21, 127– 148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Rols funcionals del CREB com a regulador positiu en la formació i millora de la memòria. Cervell Res. Bou. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD i Reines, D. El gen que codifica la fràgil proteïna d'unió a l'ARN X està controlat pel factor respiratori nuclear 2 i la família de factors de transcripció CREB. Àcids nucleics Res. 34, 1205–1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Papers de CREB en la regulació de FMRP pels receptors de glutamat metabotròpics del grup I a l'escorça cingulada. Mol. Cervell 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Altered behavioral ritmes i clock gene expression in mouse with a targeted mutation in the Period1 gen. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Els canvis de metilació de l'ADN en els gens de plasticitat acompanyen la formació i el manteniment de la memòria. Nat. Neurosci. 19, 102–110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ i Sweatt, JD Reorganització epigenòmica dependent de l'experiència a l'hipocamp. Aprèn Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. i Kidokoro, Y. Un gen de rellotge, punt, té un paper clau en la formació de memòria a llarg termini a Drosophila. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 101, 16058–16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. La sensibilització i la recompensa de la cocaïna estan sota la influència dels gens i el ritme circadians. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR L'oscil·lació diürna de les activitats de la MAP (proteïna activada per mitogen) cinasa i adenil ciclasa a l'hipocamp depèn del nucli supraquiasmàtic. J. Neurosci. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Examinant la ubicació d'objectes i la memòria de reconeixement d'objectes en ratolins. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. El rellotge circadià de l'hipotàlem ventromedial controla la despesa d'energia cíclica. Metab cel·lular. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rythms in mice. Curr. Protoc. Ratolí Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA i Wessendorf, MW Reducció de l'autofluorescència semblant a la lipofuscina en teixits marcats amb fluorescència. J. Histochem. Citoquímica. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaff, MW Un nou model matemàtic per a la quantificació relativa en RT-PCR en temps real. Àcids nucleics Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaff, MW, Horgan, GW i Dempfle, L. Eina de programari d'expressió relativa (REST) ​​per a la comparació grupal i l'anàlisi estadística dels resultats d'expressió relativa en PCR en temps real. Àcids nucleics Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Anàlisi diferencial d'expressió gènica i transcripció d'experiments d'ARN-seq amb TopHat i Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. i Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Mètodes 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA i Baldi, P. Servidor web Cyber-T: anàlisi diferencial de dades d'alt rendiment. Àcids nucleics Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Un marc bayesià per a l'anàlisi de dades d'expressió de microarrays: prova t regularitzada i inferències estadístiques de canvis gènics. Bioinformàtica 17, 509–519 (2001).