Part 2|La hiperactivitat de la glicogen sintasa quinasa 3b a les cèl·lules exfoliades urinàries prediu la progressió de la malaltia renal diabètica

Feu clic aquí per a la part 1

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:emily.li@wecistanche.com

DISCUSSIÓ

Als Estats Units i altres països occidentals, la DKD continua sent l'etiologia principal del progressiumalaltia renal crònicai imposa una gran càrrega a la tresoreria i als sistemes d'atenció sanitària sense que encara hi hagi un tractament definitiu disponible.5 Fa temps que es reconeix que no tots els pacients amb diabetis procediran a desenvolupar DN5. Segons la cohort estudiada, s'estima que la DN afecta entre un 30 i un 50 per cent dels pacients diabètics. Les mesures adoptades per la pràctica clínica actual per identificar pacients diabètics amb risc de desenvolupar DKD es limiten en gran mesura als exàmens oculars per a la retinopatia i l'anàlisi d'orina per a l'albumínúria. DKD.12,13,26,27 Com a tal, hi ha una necessitat imperiosa de desenvolupar un nou biomarcador per a l'estratificació precisa de pacients diabètics amb risc de DN. El present estudi, per primera vegada, informa que GSK3b està sobreexpressat i hiperactiu al parenquimat.ronyócèl·lules tant en DN experimental com clínica, associades aprogressió de la malaltia renal. A més, és probable que la hiperactivitat de GSK3b a les cèl·lules exfoliades urinàries pugui predir la progressió de la DN.

Cistanche tubulosa prevé la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra

GSK3b, una serina/treonina-proteïna cinasa altament conservada i sensible a la redox, està implicada de manera central en la senyalització d'insulina, així com en altres vies de senyal cel·lular que són crucials per als processos fisiopatològics relacionats ambronyólesió, reparació i regeneració. En els teixits sensibles a la insulina, com el fetge i el múscul esquelètic, GSK3b és actiu en condicions basals i suprimeix l'activitat de la glucogen sintasa.19,28 La insulina inactiva ràpidament GSK3b mitjançant la fosforilació inhibidora a la serina 9, donant lloc a la biosíntesi de glicogen. Un creixent conjunt d'evidències suggereix que la desregulació de GSK3b s'associa amb la diabetis mellitus tipus 2.19,29–31. De fet, hi ha dades que indiquen la sobreexpressió i la hiperactivitat de GSK3b en els músculs de pacients diabètics31–33 i en els teixits adiposos de ratolins diabètics obesos.34 A més. , la sobreexpressió transgènica de GSK3b en els músculs esquelètics dels ratolins provoca una tolerància deteriorada a la glucosa, resistència a la insulina i hiperinsulinèmia. imiten l'acció de la insulina en línies cel·lulars i teixits.37 A més, en ratolins diabètics obesos, els inhibidors de GSK3 van millorar la sensibilitat a la insulina i l'homeòstasi de la glucosa.38ronyótradicionalment no s'ha considerat com un òrgan objectiu de l'acció de la insulina. Tanmateix, recentment evidències convincents van suggerir que la senyalització d'insulina entravaronyóles cèl·lules, en particular en els podòcits, tenen un paper clau en el manteniment del glomerular ironyóhomeòstasi.39–41 La senyalització defectuosa d'insulina als podòcits, a causa de la deficiència o la resistència a la insulina, és probablement un iniciador fonamental per a moltes de les lesions patològiques observades a la DN. A més, els estudis clínics han demostrat que la resistència a la insulina es correlaciona amb l'aparició i la gravetat de l'albuminúria fins i tot en pacients normotensos que no tenen diabetis, la qual cosa suggereix que la resistència a la insulina per se pot causar albumínúria.42 De la mateixa manera, els ratolins amb resistència a la insulina específica dels podòcits, aconseguit l'eliminació condicional del receptor d'insulina en els podòcits glomerulars, va desenvolupar albuminúria i lesions glomerulars que recapitulen la DN, malgrat l'absència d'hiperglucèmia o diabetis.41 Per contra, en animals diabètics, els sensibilitzadors de la insulina són capaços de frenar la progressió de la DN independentment del control glucèmic.43. Aquestes troballes suggereixen que la senyalització d'insulina regula la funció dels podòcits independentment dels nivells de glucosa en sang. Tanmateix, com a transductor clau de la via de senyalització de la insulina, el paper de GSK3b en la patogènesi i la progressió de la DN ha estat molt poc estudiat.

En elronyó, GSK3b s'expressa predominantment en podòcits i, en menor mesura, en cèl·lules mesangials i endotelials del glomèrul20,21 i s'expressa àmpliament per cèl·lules tubulars renals. Hi ha dades del nostre i d'altres grups que indiquen que GSK3b media la lesió autònoma dels podòcits mitjançant la integració de múltiples vies de senyalització topàtica de podòcits. diverses glomerulopaties no diabètics.21 A més, en progressiucrònicaronyómalaltia, es va trobar que GSK3b era un modulador de la lesió tubular i intersticial renal. Tanmateix, si i com està implicat GSK3b en la DN ha estat incert i intensament controvertit, tot i que el present estudi va demostrar que l'activació millorada de GSK3b en elronyói a les cèl·lules exfoliades urinàries es pot associar amb el desenvolupament o la progressió de la DKD. Per exemple, en rates amb diabetis induïda per estreptozotocina, Lin et al.46 van trobar que la inhibició de GSK3b per un inhibidor competitiu del trifosfat d'adenosina (20 Z, 30 E)-6- Bromo a la indirubina-30 -oxima ( BIO) va atenuar la proteinúria i va millorar les lesions glomerulars de la DN en absència de correcció de la hiperglucèmia, cosa que suggereix que GSK3b té un paper perjudicial en la DN. A més, en rates amb diabetis induïda per estreptozotocina, Paeng et al.22 van fer troballes similars utilitzant BIO i van concloure que l'activitat millorada de GSK3b dins dels podòcits en condicions de diabetis s'associa amb l'apoptosi dels podòcits i la pèrdua de DN. Això coincideix amb un altre estudi in vitro, on es va trobar que GSK3b mediava la desdiferenciació i lesions dels podòcits després de l'exposició a un medi alt en glucosa.47 Per contra, Mariappan et al.48 van afirmar que l'activació de GSK3b millora la diabetis induïda.ronyólesió. En el seu estudi, els ratolins diabètics induïts per estreptozotocina van ser tractats amb nitroprussiat de sodi, un donant d'òxid nítric que és capaç d'activar GSK3b. Van trobar que l'albuminúria, la hipertròfia renal i l'acumulació de matriu extracel·lular als glomèruls es van millorar en absència de millora de la hipertensió o hiperglucèmia. No obstant això, aquestes troballes contradiuen clarament les dades dels ratolins d'impacte dirigits a gens amb GSK3 constitutivament actiu que van desenvolupar albuminúria espontània i lesió dels podòcits.49 Per conciliar les troballes contradictòries, cal tenir cura d'interpretar les dades generades mitjançant l'ús d'inhibidors o activadors químics. de GSK3b. Tot i que s'ha confirmat repetidament que BIO és un inhibidor de molècules petites molt selectiu de GSK3b, el nitroprussiat de sodi no és un activador específic de GSK3b, però se sap que té un potent efecte hemodinàmic,50 que és probable que confongui la seva acció reductora de l'albuminúria i renoprotectora en ratolins diabètics. En conjunt, malgrat algunes dades contradictòries, l'evidència predominant tendeix a donar suport que probablement GSK3b està associat ambronyólesiói proteinúria en DN. Cal esmentar un parell de limitacions del present estudi. En primer lloc, les dades preclíniques només es limitaven als models murins DB/DB. Per determinar la generalització del paper de GSK3b enlesió renal diabètica, cal validar les troballes en altres models de DN, inclosos els models de DN tipus 1. En segon lloc, les observacions clíniques aquí es van derivar de cohorts retrospectives de pacients diabètics amb una mida de mostra limitada i un temps de seguiment relativament curt. És cert que es requereixen estudis multicèntrics, prospectius, aleatoris a gran escala per verificar les nostres observacions i per confirmar el poder de GSK3b a les cèl·lules exfoliades urinàries per predir el resultat de la DKD.

GSK3b, una serina/treonina-proteïna cinasa altament conservada i sensible a la redox, està implicada de manera central en la senyalització d'insulina, així com en altres vies de senyal cel·lular que són crucials per als processos fisiopatològics relacionats ambronyólesió, reparació i regeneració. En els teixits sensibles a la insulina, com el fetge i el múscul esquelètic, GSK3b és actiu en condicions basals i suprimeix l'activitat de la glucogen sintasa.19,28 La insulina inactiva ràpidament GSK3b mitjançant la fosforilació inhibidora a la serina 9, donant lloc a la biosíntesi de glicogen. Un creixent conjunt d'evidències suggereix que la desregulació de GSK3b s'associa amb la diabetis mellitus tipus 2.19,29–31. De fet, hi ha dades que indiquen la sobreexpressió i la hiperactivitat de GSK3b en els músculs de pacients diabètics31–33 i en els teixits adiposos de ratolins diabètics obesos.34 A més. , la sobreexpressió transgènica de GSK3b en els músculs esquelètics dels ratolins provoca una tolerància deteriorada a la glucosa, resistència a la insulina i hiperinsulinèmia. imitar la insulina

acció en línies cel·lulars i teixits.37 A més, en ratolins diabètics obesos, els inhibidors de GSK3 van millorar la sensibilitat a la insulina i l'homeòstasi de la glucosa.38 Tradicionalment, el ronyó no s'ha considerat com un òrgan diana de l'acció de la insulina. No obstant això, evidències convincents van suggerir recentment que la senyalització d'insulina a les cèl·lules renals, en particular als podòcits, té un paper clau en el manteniment de l'homeòstasi glomerular i renal. per a moltes de les lesions patològiques observades a la DN. A més, els estudis clínics han demostrat que la resistència a la insulina es correlaciona amb l'aparició i la gravetat de l'albuminúria fins i tot en pacients normotensos que no tenen diabetis, la qual cosa suggereix que la resistència a la insulina per se pot causar albumínúria.42 De la mateixa manera, els ratolins amb resistència a la insulina específica dels podòcits, aconseguit l'eliminació condicional del receptor d'insulina en els podòcits glomerulars, va desenvolupar albuminúria i lesions glomerulars que recapitulen la DN, malgrat l'absència d'hiperglucèmia o diabetis.41 Per contra, en animals diabètics, els sensibilitzadors de la insulina són capaços de frenar la progressió de la DN independentment del control glucèmic.43. Aquestes troballes suggereixen que la senyalització d'insulina regula la funció dels podòcits independentment dels nivells de glucosa en sang. Tanmateix, com a transductor clau de la via de senyalització de la insulina, el paper de GSK3b en la patogènesi i la progressió de la DN ha estat molt poc estudiat.

Al ronyó, GSK3b s'expressa predominantment en podòcits i, en menor mesura, en cèl·lules mesangials i endotelials del glomèrul20,21 i s'expressa àmpliament per cèl·lules tubulars renals. Hi ha dades del nostre i d'altres grups que indiquen que GSK3b media la lesió autònoma dels podòcits mitjançant la integració de múltiples vies de senyalització pàtica dels podòcits. diverses glomerulopaties no diabètics.21 A més, en la crònica progressivaronyómalaltia, es va trobar que GSK3b era un modulador de la lesió tubular i intersticial renal. Tanmateix, si i com està implicat GSK3b en la DN ha estat incert i intensament controvertit, tot i que el present estudi va demostrar que l'activació millorada de GSK3b al ronyó i a les cèl·lules exfoliades urinàries pot estar associada amb el desenvolupament o la progressió de la DKD. Per exemple, en rates amb diabetis induïda per estreptozotocina, Lin et al.46 van trobar que la inhibició de GSK3b per un inhibidor competitiu del trifosfat d'adenosina (20 Z, 30 E)-6- Bromo a la indirubina-30 -oxima ( BIO) va atenuar la proteinúria i va millorar les lesions glomerulars de la DN en absència de correcció de la hiperglucèmia, cosa que suggereix que GSK3b té un paper perjudicial en la DN. A més, en rates amb diabetis induïda per estreptozotocina, Paeng et al.22 van fer troballes similars utilitzant BIO i van concloure que l'activitat millorada de GSK3b dins dels podòcits en condicions de diabetis s'associa amb l'apoptosi dels podòcits i la pèrdua de DN. Això coincideix amb un altre estudi in vitro, on es va trobar que GSK3b mediava la desdiferenciació i lesions dels podòcits després de l'exposició a un medi alt en glucosa.47 Per contra, Mariappan et al.48 van afirmar que l'activació de GSK3b millora la diabetis induïda.ronyólesió. En el seu estudi, els ratolins diabètics induïts per estreptozotocina van ser tractats amb nitroprussiat de sodi, un donant d'òxid nítric que és capaç d'activar GSK3b. Van trobar que l'albuminúria, la hipertròfia renal i l'acumulació de matriu extracel·lular als glomèruls es van millorar en absència de millora de la hipertensió o hiperglucèmia. No obstant això, aquestes troballes contradiuen clarament les dades dels ratolins d'impacte dirigits a gens amb GSK3 constitutivament actiu que van desenvolupar albuminúria espontània i lesió dels podòcits.49 Per conciliar les troballes contradictòries, cal tenir cura d'interpretar les dades generades mitjançant l'ús d'inhibidors o activadors químics. de GSK3b. Tot i que s'ha confirmat repetidament que BIO és un inhibidor de molècules petites molt selectiu de GSK3b, el nitroprussiat de sodi no és un activador específic de GSK3b, però se sap que té un potent efecte hemodinàmic,50 que és probable que confongui la seva acció reductora de l'albuminúria i renoprotectora en ratolins diabètics. En conjunt, malgrat algunes dades contradictòries, l'evidència predominant tendeix a donar suport que probablement GSK3b està associat ambronyólesiói proteinúria en DN. Un parell de limitacions de la

cal esmentar el present estudi. En primer lloc, les dades preclíniques només es limitaven als models murins dB/dB. Per determinar la generalització del paper de GSK3b enlesió renal diabètica, cal validar les troballes en altres models de DN, inclosos els models de DN tipus 1. En segon lloc, les observacions clíniques aquí es van derivar de cohorts retrospectives de pacients diabètics amb una mida de mostra limitada i un temps de seguiment relativament curt. És cert que es requereixen estudis multicèntrics, prospectius, aleatoris a gran escala per verificar les nostres observacions i per confirmar el poder de GSK3b a les cèl·lules exfoliades urinàries per predir el resultat de la DKD.

En resum, els nostres estudis van demostrar que l'expressió renal i l'activitat de GSK3b s'amplien en la DN experimental i clínica. L'activitat de GSK3b a les cèl·lules exfoliades urinàries pot servir com a nou biomarcador per predir la progressió de la DN. Les nostres dades poden obrir el camí per a un examen a gran escala i en profunditat del valor que GSK3b a les cèl·lules exfoliades urinàries pot servir com a biomarcador pronòstic de la DN.

MÈTODES

Estudis en animals

Els estudis amb animals van ser aprovats pel Comitè i Cura d'Animals Institucionals i s'ajusten a les regulacions del Departament d'Agricultura dels EUA i a la Guia de l'Institut Nacional de Salut per a la cura humana i l'ús d'animals de laboratori. Els ratolins DB / DB mascles i els companys de camada de control db / m de 6 setmanes es van comprar al Centre de Recerca Animal Model de la Universitat de Nanjing (Nanjing, Xina) i es van allotjar a la Central Animal Facility de la Universitat de Zhengzhou. Tots els ratolins van ser alimentats ad libitum i es van matar de 8 a 10 ratolins a les edats indicades. Es van prendre mostres d'orina i sang en els moments indicats. Després de matar, es van extreure els ronyons per a un examen posterior. Els nivells d'albúmina urinària es van mesurar mitjançant un kit de quantificació d'assaig immunoabsorbent lligat a l'albúmina de ratolí (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Els nivells de creatinina en orina es van determinar mitjançant un kit d'assaig de creatinina (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Cultiu cel·lular

Els podòcits de ratolí immortalitzats condicionalment entre els passatges 21 i 25 es van cultivar al medi Roswell Park Memorial Institute 1640 suplementat amb un 10 per cent de sèrum fetal boví en condicions permissives tal com es va descriure anteriorment.22 Els subcultius dels podòcits es van sotmetre a condicions no permissives per induir la diferenciació durant 14 dies i van ser després exposat a un medi de cultiu/entorn normal que contenia 5 mM de glucosa, un medi diabètic format per glucosa (25 mM) i factor de creixement transformant b1 (2 ng/ml) o un medi de control d'alta osmolalitat que conté manitol 20 mM durant 48 hores. Les cèl·lules epitelials tubulars proximals murines i les cèl·lules mesangials glomerulars de ratolí es van mantenir en el medi d'Àguila / F12 modificat de Dulbecco complementat amb sèrum boví fetal al 5%. Les cèl·lules es van sembrar a una confluència del 70 per cent en el medi que contenia un 5 per cent de sèrum fetal boví durant 24 hores i després es van sofrir inanició de sèrum durant 24 hores més, seguida d'una exposició a un medi de cultiu/entorn normal que contenia 5 mM de glucosa, un medi diabètic que constava d'alt nivell. glucosa (25 mM) i factor de creixement transformant b1 (2 ng/ml), o un medi de control d'alta osmolalitat que conté 5 mM de glucosa i 20 mM de manitol durant 48 hores. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant l'exclusió del blau tripà. En els moments indicats, les cèl·lules es van fixar o es van recollir lisats cel·lulars per a una investigació posterior.

Transfecció transitòria de vectors

Els vectors que codifiquen el vector buit o el mutant d'hemaglutinina (HA) marcat constitutivament actiu (S9A) (S9A-GSK3b-HA/ pcDNA3) de GSK3b van ser proporcionats per la doctora Gail VW Johnson (Birmingham, AL) i van ser transfectats a podòcits cultivats, cèl·lules mesangials i cèl·lules epitelials tubulars mitjançant l'ús de Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) tal com s'ha descrit anteriorment.44 L'eficiència de la transfecció es va verificar mitjançant tinció d'immunofluorescència o immunoblot per HA a les 12 hores. Posteriorment es van recollir cèl·lules i es van preparar per a l'anàlisi de Western blot o altres assajos.

RNAi

Un grup de 3 ratolins dúplex petits d'ARN interferents específics de GSK3b: 50-CUUGUCCUGUAGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 i 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 —es van dissenyar i sintetitzar segons la seqüència de codificació completa del gen GSK3b murí (núm. d'accés GenBank BC060743.1). A més, es va utilitzar una seqüència d'ARN interferent petita remenada (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) sense semblança de seqüències amb cap seqüència de gens conegudes de ratolins, rates o humans com a control de l'ARNi. L'eficiència del silenciament gènic mediat per lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) es va avaluar mitjançant l'anàlisi d'immunoblot per a GSK3b. Es va observar una supressió satisfactòria de l'expressió de la proteïna GSK3b en podòcits cultivats, cèl·lules mesangials i cèl·lules epitelials tubulars 24 hores després de l'ARNi. A continuació, les cèl·lules es van sotmetre a un medi de cultiu/entorn normal, a un medi diabètic o a un medi de control d'alta osmolalitat durant 48 hores, tal com s'ha indicat anteriorment, abans de processar les cèl·lules per a més assajos.

Estudis clínics

La part clínica d'aquest estudi s'ajustava a les directrius ètiques de la Declaració d'Hèlsinki de 1975 i va ser aprovada pel Comitè de Revisió Institucional del Primer Hospital Afiliat de la Universitat de Zhengzhou. Els participants de la investigació humana no van ser reclutats específicament per a aquest estudi. Totes les dades clíniques es van recollir mitjançant una revisió retrospectiva de gràfics i mitjançant l'examen de seccions de teixit arxivades o mostres d'orina acumulades. Les mostres de biòpsia renal excessives o rebutjades, així com mostres d'orina fraccionades, s'han conservat habitualment a l'Institut de Nefrologia del Primer Hospital Afiliat de la Universitat de Zhengzhou. Els teixits de biòpsia renal incrustat en parafina fixats en formalina no identificats arxivats de pacients en diferents estadis de DN es van escollir aleatòriament per a l'examen. Es van obtenir mostres addicionals de ronyó sense lesions histomorfològiques de ronyons rebutjats per al trasplantament a causa d'anomalies vasculars o de teixits de biòpsia preimplantacionals i van servir com a controls normals. Per a l'estudi de cohort retrospectiu, es van examinar retrospectivament un total de 127 pacients amb diabetis mellitus tipus 2, que havien estat seguits des del 2010 amb mostres d'orina fraccionada, per incloure'ls en aquest estudi. Els pacients estudiats tenien entre 29 i 80 anys i els van diagnosticar diabetis tipus 2 segons els criteris de l'Associació Americana de Diabetis. Els criteris d'exclusió inclouen una pèrdua de seguiment, informació inadequada,ronyódisfunció, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 anys. Durant el seguiment rutinari, es van documentar dades demogràfiques, així com paràmetres clínics, incloent sexe, edat, comorbiditats, medicaments, durada de la diabetis, pressió arterial, nivell glucèmic, nivell de creatinina sèrica, dades d'anàlisi d'orina, Emirats Àrabs Units i eGFR. El resultat clínic després de 5 anys de seguiment va ser la presència o l'absència de la progressió de la insuficiència renal, que es va definir com una reducció del 25% de l'eGFR o la progressió de l'albumínúria, tal com indica l'escalada de la gravetat de l'albumínúria al llarg de diverses etapes clíniques de DN, és a dir, normoalbuminúria, microalbuminúria, macroalbuminúria o proteinúria manifesta. Tots els pacients van donar el consentiment informat per escrit.

Valoració de la morfologia renal i anàlisi immunohistoquímica

Es van tallar blocs de teixit renal de ratolí incrustats en parafina en formalina en seccions de 3- mm. Per a la histologia general, es van processar seccions per a una tinció periòdica d'àcid-Schiff. La tinció immunohistoquímica de GSK3b i p-GSK3b es va realitzar mitjançant un kit VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) tal com es va descriure anteriorment.20 Com a control negatiu, l'anticossos primari es va substituir per sèrum no immune de la mateixa espècie; no s'ha produït cap taca. Les característiques morfològiques de totes les seccions van ser avaluades per un únic observador de manera cega amb l'assistència d'un patòleg renal.

Tinció immunofluorescent

Es van fixar cèl·lules cultivades o seccions de criostat congelat i es van tacar amb anticossos primaris i es van seguir aplicant anticossos secundaris conjugats amb Alexa Fluor (Invitrogen). Com a control negatiu, els anticossos primaris van ser substituïts per IgG preimmune de la mateixa espècie; no s'ha produït cap taca. Finalment, es van tacar les seccions amb 40,6-diamidino-2-fenilindol o iodur de propidi i es van muntar amb el medi de muntatge VECTASHIELD (Vector Laboratories). Per a la microscòpia de fluorescència FL, es van analitzar totes les seccions al mateix temps per excloure artefactes a causa de la desintegració variable del fluorocrom. Les seccions es van examinar mitjançant un microscopi de fluorescència Olympus FL equipat amb una càmera digital Spot II (Olympus, Tòquio, Japó). Per a la tinció de dos colors, les imatges es van adquirir seqüencialment per evitar interferències de colorants. El programari ImageJ (Instituts Nacionals de Salut, Bethesda, MD) es va utilitzar per al postprocessament de les imatges, per exemple, l'anàlisi d'escalat, fusió i colocalització.

Morfometria computeritzada

Les imatges de la tinció d'immunohistoquímica es van capturar i digitalitzar mitjançant un sistema d'anàlisi d'imatges informatitzat que consta d'una càmera digital d'alta resolució amb un dispositiu acoblat de càrrega connectada a un microscopi (Olympus BX41, Olympus) i a un ordinador. Les imatges es mostraven amb una resolució de píxels d'1024 768 píxels (resolució espacial, 0,24 mm/píxel). Per a imatges de tinció d'immunohistoquímica de teixits renals humans, es va utilitzar el programari ImageJ per a la segmentació d'imatges, l'establiment de llindars i les mesures d'intensitat del senyal. S'han realitzat correccions manuals segons calia. En total, es van mostrejar 10 glomèruls o 10 camps tubulointersticials aleatoris per a l'anàlisi morfomètrica i les dades finals es van expressar com el valor de la densitat de píxels integrada en relació amb el grup control.

Anàlisi d'immunoblot occidental

Les cèl·lules cultivades van ser lisades;ronyóteixitso glomèruls renals aïllats es van homogeneïtzar en un tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació complementat amb inhibidors de la proteasa i es van processar mostres per a l'anàlisi d'immunoblot. Per a l'anàlisi d'immunoblot del nombre limitat de cèl·lules exfoliades a l'orina, el protocol de Western blot es va modificar tal com s'ha descrit anteriorment mitjançant l'ús dels gels NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) d'alt rendiment i membranes de transferència d'alta qualitat.25 La immunoblotting refinada podria detectar proteïnes moderadament expressades en tan sols 1000 cèl·lules. Els anticossos contra GSK3b, fibronectina, col·lagen IV, actina i gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) es van comprar a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); els contra la sinaptopodina es van comprar a PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Alemanya); i els contra ZO-1 i p-GSK3b es van adquirir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Anàlisi estadística

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 comparacions. Les dades categòriques es van comparar entre grups mitjançant la prova de chi quadrat. Es va aplicar l'anàlisi de regressió lineal per examinar les possibles relacions entre 2 paràmetres. Es van realitzar anàlisis de regressió de riscos proporcionals de Cox univariant per avaluar les associacions entre les variables rellevants i el risc de progressió de la insuficiència renal, seguides d'anàlisis multivariants pel que fa als possibles factors de confusió. Es va realitzar una anàlisi de la corba ROC i es van mesurar les àrees sota les corbes ROC per analitzar el poder de determinades variables per predir la progressió de la insuficiència renal en pacients diabètics. Les variables no distribuïdes de manera normal, com els Emirats Àrabs Units, es van transformar per logaritme per aconseguir la normalitat per a les anàlisis de regressió de riscos de proporció de Cox anàlisis de corbes ROC. Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant PSS versió 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). Valors P<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

DIVULGACIÓ

Tots els autors van declarar que no hi havia interessos en competència.

AGRAÏMENTS

Part d'aquest estudi es va presentar com a presentació oral a la KidneyWeek 2016: Reunió Anual de la Societat Americana de Nefrologia, del 15 al 20 de novembre de 2016, Chicago, IL. RG va comptar amb el suport en part de la Fundació per a la Salut. XL va comptar amb el suport d'una beca de recerca per rebre formació extramuros. ZL va comptar amb el suport de la National NaturalScience Foundation of China subvencions U1604284, 81770672 i 81873612. Els finançadors no van tenir cap paper en el disseny i la realització d'aquest estudi, la recollida i la interpretació de les dades, ni la preparació i aprovació del manuscrit.

APORTACIONS DE L'AUTOR

RG va idear les idees conceptuals. XL, ZL i RG van contribuir al disseny de l'estudi. XL, PW, BC, YG, AYG i BF van dur a terme els experiments de cultiu cel·lular. XL i ZL van realitzar els experiments amb animals i van recollir les dades de pacients diabètics. XL, LJW, DKM, LDD, ZL i van contribuir a la discussió i interpretació dels resultats. va prendre el lideratge en la redacció del manuscrit. XL, BC i BF van contribuir a l'edició de manuscrits. Tots els autors van coincidir que tot el concepte i la propietat d'aquest treball pertanyen a RG. Tots els autors van aprovar el manuscrit final.

MATERIAL COMPLEMENTARI

Mètodes complementaris.

Taula S1. Característiques dels subjectes control i pacients amb nefropatia diabètica, estratificades segons classes histològiques de nefropatia diabètica. Taula S2. Dades demogràfiques, clíniques i de laboratori de referència de la cohort retrospectiva de pacients diabètics en fase inicial sense signes de DKD. Taula S3. Dades demogràfiques, clíniques i de laboratori de pacients amb diabetis tipus 2 en fase inicial, estratificades segons els seus resultats renals després de 5 anys de seguiment. Figura S1. L'activitat renal millorada de GSK3b prediu el desenvolupament i la gravetat dediabèticronyómalaltiaen ratolins db/db. Els ratolins mascles db/db i db/m van ser seguits entre les 4 i les 13 setmanes d'edat. (A) Es va prendre mostres de sang de ratolins sense dejuni a les 4 i 7 setmanes d'edat i es van analitzar els nivells de glucosa en plasma. *P < 0.001="" enfront="" de="" ratolins="" db/m="" a="" les="" 7="" setmanes="" d'edat.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" es="" va="" mostrejar="" l'orina="" puntual="" a="" les="" 4,="" 7,="" 10="" i="" 13="" setmanes="" d'edat="" i="" es="" va="" sotmetre="" a="" un="" assaig="" d'albúmina="" urinària="" i="" creatinina="" d'orina="" per="" a="" la="" determinació="" de="" les="" proporcions="" d'albúmina="" a="" creatinina="" urinària="" (uacr).="" *="" p=""><0, 001="" versus="" ratolins="" db/m="" a="" les="" 10="" setmanes="" d'edat="" (n="" ¼="" 15-18);="" #p=""><0,001 versus="" ratolins="" db/m="" a="" les="" 13="" setmanes="" d'edat.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" tots="" els="" ratolins="" van="" rebre="" biòpsia="" renal="" oberta="" a="" les="" 7="" setmanes="" d'edat="" i="" es="" van="" processar="" mostres="" de="" biòpsia="" per="" a="" l'anàlisi="" d'immunoblot="" per="" a="" p-gsk3b,="" gsk3b="" i="" gapdh.="" (d)="" les="" immunoblots="" es="" van="" sotmetre="" a="" anàlisi="" densitomètrica.="" l'abundància="" relativa="" de="" gsk3b="" i="" p-gsk3b="" es="" va="" determinar="" com="" a="" proporcions="" densitomètriques="" de="" les="" respectives="" molècules/gapdh="" com="" a="" canvis="" de="" plec="" en="" comparació="" amb="" els="" ratolins="" de="" control="" db/m.="" l'activitat="" relativa="" de="" gsk3b="" es="" va="" calcular="" com="" a="" proporcions="" de="" p="" gsk3b="" a="" gsk3b="" com="" a="" plecs="" de="" ratolins="" de="" control="" db/m.="" (e)="" l'anàlisi="" de="" regressió="" lineal="" va="" demostrar="" una="" correlació="" positiva="" estadísticament="" significativa="" entre="" l'activitat="" renal="" de="" gsk3b="" a="" les="" 7="" setmanes="" d'edat="" en="" ratolins="" db/db="" i="" el="" desenvolupament="" i="" la="" gravetat="" de="" l'albuminúria,="" un="" segell="" distintiu="">diabèticronyómalaltiaa les 13 setmanes d'edat. R ¼ 0,699; P ¼ 0.0{{2{0}}1. (F) L'anàlisi de la corba característica de funcionament del receptor va demostrar que l'activitat renal de GSK3b en les primeres etapes de la diabetis (7 setmanes d'edat) proporciona una precisió i un poder excel·lents per predir el desenvolupament d'albuminúria i DKD a les 13 setmanes d'edat en ratolins db/db. Figura S2. La resistència a la insulina i la glucosa ambiental alta activen de manera sinèrgica GSK3b a les cèl·lules renals. (A) Els podòcits murins cultivats, (B) cèl·lules mesangials glomerulars d'orina (MMC) i (C) cèl·lules epitelials tubulars renals (TEC) es van transfectar amb oligonucleòtids de siRNA remenats (siCon) o oligonucleòtids de siRNA (siIRb) específics per a la isoforma b de el receptor d'insulina (IRB) per modelar l'estat de la resistència a la insulina in vitro. Aleshores, les cèl·lules es van exposar durant 48 hores al medi normal que contenia glucosa (NG) o al medi diabètic (HG) que contenia glucosa. Els lisats cel·lulars es van recollir i es van sotmetre a una anàlisi d'immunoblot per a IRB, p-GSK3b, GSK3b i GAPDH seguit d'una anàlisi densitomètrica de les taques. * P < 0,="" 01="" enfront="" de="" l'expressió="" irb="" en="" cèl·lules="" tractades="" amb="" sicon="" exposades="" al="" mateix="" medi="" (n="" ¼="" 3),="" #="" p="">< 0,="" 05="" enfront="" de="" la="" mateixa="" expressió="" de="" proteïnes="" al="" grup="" siirb="" +="" ng="" o="" sicon="" +="" hg="" (n="3)," &="" p="">< 0,05="" enfront="" de="" la="" mateixa="" expressió="" de="" proteïnes="" al="" segon="" grup="" +="" hg="" o="" siirb="" +="" ng="" (n="" ¼="" 3).="" figura="" s3.="" nivells="" d'expressió="" d'arnm="" de="" gsk3b="" en="" mostres="" de="" ronyó="" humà="" obtingudes="" de="" donants="" vius="" sans="" i="" pacients="" amb="" nefropatia="" diabètica.="" les="" dades="" es="" van="" derivar="" de="" www.nephroseq.org="" sobre="" la="" base="" del="" conjunt="" de="" dades="" ju="" ckd="" glom51="" i="" es="" van="" expressar="" com="" a="" intensitat="" centrada="" en="" la="" mitjana="" de="" log2.="" figura="" s4.="" l'activitat="" millorada="" de="" gsk3b="" en="" cèl·lules="" exfoliades="" urinàries="" recollides="" de="" pacients="" diabètics="" en="" fase="" inicial="" prediu="" el="" desenvolupament="" de="" la="" malaltia="" renal="" diabètica.="" (a,="" b)="" detecció="" de="" gsk3b="" i="" gsk3b="" activat="" en="" cèl·lules="" exfoliades="" urinàries="" recollides="" de="" pacients="" diabètics="" en="" fase="" inicial="" (pts)="" i="" controls="" sans="" (ctrls).="" les="" cèl·lules="" exfoliades="" urinàries="" es="" van="" recollir="" i="" lisar.="" els="" lisats="" cel·lulars="" es="" van="" processar="" per="" a="" l'anàlisi="" d'immunoblot="" per="" a="" gsk3b,="" p-gsk3b="" i="" gapdh.="" (c)="" les="" immunoblots="" es="" van="" sotmetre="" a="" anàlisi="" densitomètrica.="" l'abundància="" relativa="" de="" gsk3b="" i="" p-gsk3b="" es="" va="" determinar="" com="" a="" proporcions="" densitomètriques="" de="" les="" respectives="" molècules/gapdh="" com="" a="" canvis="" de="" plecs="" en="" comparació="" amb="" els="" controls="" (ctrls).="" l'activitat="" relativa="" de="" gsk3b="" es="" va="" calcular="" com="" a="" proporcions="" de="" p-gsk3b="" a="" gsk3b="" com="" a="" plecs="" de="" control="" normal="" (ctrls).="" (d)="" l'anàlisi="" de="" la="" corba="" característica="" de="" funcionament="" del="" receptor="" va="" demostrar="" que="" l'activitat="" relativa="" de="" gsk3b="" (proporció="" p-gsk3b/gsk3b)="" a="" les="" cèl·lules="" exfoliades="" urinàries="" recollides="" de="" pacients="" diabètics="" en="" fase="" inicial="" proporciona="" una="" excel·lent="" precisió="" per="" predir="" el="" desenvolupament="">malaltia renal diabèticaen 5 anys, amb l'àrea sota la corba (AUC) 0,886.

REFERÈNCIES

1. Umanath K, Lewis JB. Actualització sobre nefropatia diabètica: currículum bàsic 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Canvis en les complicacions relacionades amb la diabetis als Estats Units, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan per al retard o la prevenció de la microalbuminúria en la diabetis tipus 2. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Mecanismes patogenètics de la nefropatia diabètica. J Am Soc Nephrol. 2005;16(suppl 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Manifestació clínica i història natural de la nefropatia diabètica. Contrib Nefrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-seguiment anual del control intensiu de la glucosa en la diabetis tipus 2. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. La microalbuminúria i el risc de disminució precoç de la funció renal progressiva en la diabetis tipus 1. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Risc de progressió de la ERC normoalbuminúrica a la malaltia renal terminal en persones amb diabetis: l'estudi CRIC (Cohort d'insuficiència renal crònica). Am J Kidney Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. La necessitat de predictors primerencs del risc de nefropatia diabètica: és suficient la taxa d'excreció d'albúmina? Diabetis. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Baixa taxa de filtració glomerular en pacients diabètics de tipus 1 normoalbuminúrics: un indicador de lesions glomerulars més avançades. Diabetis. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Declin renal progressiu: el nou paradigma de la nefropatia diabètica en la diabetis tipus 1. Atenció a la diabetis. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Nefropatia diabètica no proteinúrica. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Desenvolupament i progressió de la nefropatia en la diabetis tipus 2: el Regne Unit Prospective Diabetes Study (UKPDS 64). Ronyó Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Biomarcadors urinaris en l'avaluació de la nefropatia diabètica precoç. J Diabetis Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. IgG4 i Smad1 urinàries són biomarcadors específics dels canvis estructurals i funcionals renals en les primeres etapes de la nefropatia diabètica. Diabetis. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. L'excreció urinària de longitud completa de megalina mediada per l'exocitosi està relacionada amb la patogènesi de la nefropatia diabètica. Diabetis. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. La glicogen sintasa quinasa 3b dicta la motilitat dels podòcits i la rotació d'adhesió focal mitjançant la modulació de l'activitat de la paxil·lina: implicacions per a l'efecte protector del liti a dosis baixes en la podocitopatia. Sóc J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. La glicogen sintasa quinasa-3: propietats, funcions i regulació. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. La glicogen sintasa quinasa-3 (GSK3): regulació, accions i malalties. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. La isoforma b de GSK3 media la lesió autònoma dels podòcits en la glomerulopatia proteïnúrica. J Pathol. 2016;239:23.