Part 2: Mapeig de la interacció epigenòmica i transcriptòmica durant la formació de la memòria i el record en el conjunt d'engrames de l'hipocamp

per a més information:ali.ma@wecistanche.com

Pls clica aquí per a la part 1

Diferents programes transcripcionals dels conjunts d'engrames durant la formació i recuperació de la memòria

Per dilucidar com els canvis en l'accessibilitat de la cromatina i les interaccions promotor-potenciador estaven afectant l'expressió gènica, vam realitzar ARN-seq nuclear (nRNA-seq) de totes les subpoblacions neuronals. La nostra anàlisi de gens expressats diferencialment (DEG) va revelar una baixa quantitat de canvis en la fase inicial en comparació amb les neurones d'estat basal (Basal vs. Early, 88 DEGs, Fig. 5a, Supplementary Table 8). Això va ser especialment inesperat donat l'extens grau d'organització de la cromatina observat en aquest punt (fig. 2a). En canvi, les neurones de la fase tardana presentaven un major nombre de DEG tot i que hi havia més similitud en l'accessibilitat de la cromatina en aquests punts de temps (fig. 5a). Per validar les nostres troballes transcripcionals, vam comparar els nostres resultats amb dades publicades prèviament de cèl·lules de gràuls DG activades 1 h després de la nova exposició32, 24 h després de FS20, i després d'estimulació prolongada (6h) de neurones corticals cultivades per ratolí amb KCl33 (Extended Data Fig. 4a). Curiosament, tot i que aquesta comparació va revelar una superposició significativa entre gens regulats del nostre conjunt de dades i 1 h després de la nova exposició32 (P = 0,006) o 24 h després de FS20 (P = 0,0005), no vam observar cap superposició significativa amb gens que estaven regulats en les cèl·lules d'engrama reactivats i els altres conjunts de dades, confirmant el paisatge transcripcional únic de les cèl·lules d'engrama reactivades durant la recuperació.

Feu clic aBeneficis de Cistanche i efectes secundaris per a la memòria

A continuació, vam aprofitar l'enfocament computacional publicat anteriorment34 que mesura els canvis en les lectures d'ARN (exons) i pre-ARNm (introns). Com era d'esperar, els canvis exònics es correlacionen amb els canvis transcripcionals globals mesurats per DEseq2 (tant l'exó com l'intró llegeixen), en tots elsmemòriafases (Dades ampliades Fig. 4b). No obstant això, el mesurament de les relacions exó/intró, indica que les transcripcions alterades (regulades amunt i avall) durantmemòriaLa consolidació (Early vs. Late) són principalment impulsades per lectures intròniques, el que suggereix que aquest perfil transcripcional reflecteix principalment transcripcions immadures que requereixen passos addicionals de processament d'ARN (Extended Data Fig. 4c). En canvi, els gens regulats durant la recuperació (tardà vs reactivats) són predominantment impulsats a partir de transcripcions exòniques, reflectint així un estat més madur d'ARN (Extended Data Fig. 4c).

Per conciliar la discrepància entre els canvis de cromatina observats i l'estat transcripcional en cada subpoblació, vam realitzar anàlisis de correlació dels DARs i DEGs, identificats durant els diferents punts de temps dememòriaFormació i record. Per a aquesta anàlisi, els DAR de les regions no codificants (intergènics i intronics) es van assignar als seus respectius promotors mitjançant l'ús de les nostres dades pc-HiC. En general, trobem una correlació baixa (P = 2,81 × 10−2) entre l'accessibilitat diferencial de la cromatina i els canvis d'expressió gènica que es produeixen en la fase inicial (Basal vs. Early, Extended Data Fig. 4d). Aquests resultats van estar en línia amb el treball anterior21, informant que les modificacions de les histones tenen poca correlació amb les alteracions transcripcionals durantmemòriaadquisició. Inesperadament, vam observar una superposició i similitud més forta entre els canvis de cromatina que es produeixen durantmemòriacodificació (Primerenca) amb el paisatge transcripcional alterat durant la consolidació de la memòria (tardà) i les neurones d'engrama reactivades (P = 1,13 × 10−8, 2,42 × 10−7, respectivament, Dades ampliades Fig. 4d). Per confirmar encara més aquesta anàlisi, vam realitzar una correlació de Pearson entre els valors log2FC dels DARs i els valors log2FC dels DEG que es van anotar a aquesta regió (les regions intergèniques es van assignar a través del conjunt de dades pc-HiC, Dades esteses fig. 4e, taula suplementària 9). La nostra anàlisi va revelar que els primers canvis en cromatina (Basal vs. Early, DAR) es van correlacionar significativament amb la regulació cap avall dels gens en la fase tardana (Early vs. Late, Extended Data Fig. 4e, línia grisa, r = −0,14, p< 0.0001).="" moreover,="" after="" parsing="" the="" degs="" to="" intronic="" and="" exonic="" reads="" we="" observed="" that="" the="" correlation="" was="" largely="" driven="" by="" intronic="" reads="" (introns="" r="−0.21," p="">< 0.0001,="" exons="" r="−0.09," p="0.02)." in="" contrast,="" early="" chromatin="" changes="" (basal="" vs.="" early,="" dars)="" showed="" positive="" correlation="" with="" degs="" from="" the="" reactivated="" cells,="" which="" was="" predominantly="" driven="" by="" exonic="" reads="" (introns="" r="−0.007," p="0.73," exons="" r="0.11," p="0.04)." this="" data="" provides="" further="" evidence="" for="" a="" priming="" event="" and="" transcriptional="" lag,="" in="" which="" chromatin="" changes="" that="" occur="" during="" the="" early="" phase="" enable="" transcriptional="" changes="" observed="" at="" a="" later="" time="" point,="" primarily="" in="" reactivated="" engram="">

Memòriala codificació, consolidació i recuperació és un procés dinàmic que requereix diverses onades de transcripció gènica retardada12,32,33. Per tant, identificar diferents programes transcripcionals en tots elsmemòriafases, vam avaluar l'expressió de cada gen des de neurones no activades (Basal) fins a primerencs (Activades d'hora), tardanes (Activades-tardanes), i neurones que es van reactivar durant la recuperació (Reactivades). Tots els gens diferencials expressats (DEG, n = 1095) que complien els criteris de tall (valor p< 0.01,="" log2(fold="" change)="">1) es van agrupar imparcialment (k-mitjana) (Fig 5b,c). Es van identificar quatre grans clústers; i) 260 gens

que estaven regulats a la fase tardana (clúster Dw-late), ii) 207 gens que estaven regulats en la fase tardana (clúster-tardà), iii) 186 gens que estaven regulats en la fase inicial, i es van mantenir al llarg de tots elsmemòriafases (Clúster estable) i iv) 438 gens

que estaven únicament regulades en les neurones reactivades, durantmemòria(Clúster de reactivació). De manera similar a la nostra comparació per parelles, els canvis transcripcionals en les neurones activades-tardanes es correlacionen més alt amb lectures intròniques, i el paisatge transcripcional de les neurones reactivades sembla ser més madur i presenta una correlació més alta amb les lectures exòniques (Dades esteses fig. 5a,b).

A continuació, vam realitzar una anàlisi d'ontologia gènica (GO) per a cada clúster (fig. 5d), per identificar vies enriquides dins de diferentsmemòriaFases. La signatura transcripcional del clúster tardà es va enriquir per als gens implicats en la regulació de la funció de sinapsi inhibidora, que s'ha demostrat que tenen un paper en l'excitabilitat neuronal35,36 (fig. 5e). En el cúmul Up-late, vam observar conjunts de gens implicats en la regulació positiva o negativa de la transcripció, com la família de fibrosarcoma musculoaponeurotic v-maf, la proteïna B (Mafb), el dit de zinc de la família del cargol 2 (Snai2) i el factor de transcripció silenciador RE1 (Rest) (Fig. 5e). Curiosament, trobem que el 15% (32/207) del promotor del gen a Dw –late cluster harbor or bé Snai2 (p-value - 1 × 10−9) o Rest (p-value - 1 × 10−3) llocs d'unió. Aquesta dinàmica de reguladors transcripcionals apunta cap a una possible interacció entre els clústers Dw- i Up-late. Cal destacar que existeixen conjunts neuronals funcionalment diferents dins d'un solmemòriaengram, en el qual els conjunts dependents de l'osteosarcoma FBJ (Fos) i la proteïna de domini PAS neuronal 4 (Npas4) experimenten diferents modificacions sinàptiques després de la CFC i impulsen comportaments guiats per la memòria en direccions oposades37. Es va demostrar que les entrades sinàptiques excitadores promouenmemòriageneralització i inhibidors promouen la discriminació de la memòria. Tot i que aquests conjunts diferents no es podrien diferenciar en l'estudi actual, aquestes observacions podrien explicar l'expressió bidireccional dels reguladors transcripcionals positius o negatius, així com els gens regulats amunt i avall implicats en l'excitabilitat neuronal.

Cistanche pot millorar la memòria

El cúmul estable es va enriquir principalment per transcripcions involucrades en citoesquelètics, remodelació d'axons i dependents de l'hipocamp.memòria38, incloent els neurofilaments polipeptíds lleugers i pesats (Neal, Neath) i miosina, polipèptid pesat 10, no muscular (Myh10) (Fig. 5d, e). Per visualitzar i fer un seguiment dels canvis relacionats amb el citosquelètic en dendrites i espines, el reporter loop-eYFP (dependent del TAM) va ser lliurat per virus adenoassociats (AAV) a la DG de ratolins d'Arc-CreERT2 (Extended Data Fig. 6a). Les nostres dades van revelar que les neurones activades tardanes i reactivades alberguen un nombre significativament més alt de bolets i espines primes (P< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">

La signatura transcripcional única de les neurones d'engrama reactivades (clúster de reactivació) es va caracteritzar principalment per categories de 'transport/unió d'ARN' i 'mecanismes translacionals de proteïnes' (fig. 5d). Aquest programa transcripcional inclou l'expressió elevada dels membres de la família kinesina 5a i c (Kif5a, Kif5c), iniciació eucariota de la traducció (Eif) factor 3 subunitat A, D (3a, 3d), subunitat factor 4 H (Eif4h), subunitat del factor 5 A (Eif5a) i proteïna ribosòmica (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (fig. 5d,e), que anteriorment es va informar que jugava un paper crucial en el transport d'ARNm al compartiment sinàptic i el control autònom de la traducció local39. Per validar encara més aquestes troballes a nivell translacional, hem mesurat l'expressió de proteïnes i la localització de tres membres de la família Eif per immunohistoquímica (IHC). Anteriorment es va informar que els membres de Serval Eif estaven específicament involucrats en la traducció en compartiments sinàptics39, per tant, vam analitzar per separat l'expressió de proteïnes en el soma i els eixos dendrita de les neurones activades (fig. 5f). Les neurones reactivades tenien una major expressió de proteïnes Eif3e en el soma, en comparació amb les neurones activades-primerenques i -tardanes (Extended Data Fig. 6c). En canvi, Eif4e va ser significativament més abundant en els eixos de les neurones reactivades, en comparació amb les neurones activades-primerenques i -tardanes (Ps<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">memòria.

L'augment de la maquinària de traducció facilita les alteracions en la forma, la mida i el nombre de la columna vertebral, donant lloc a una plasticitat sinàptica millorada39-41. A més, les espines amb diàmetres de cap més grans tenen més probabilitats de contenir ribosomes per a la síntesi local de proteïnes, densitats postsinàptiques més grans, que ancoren més receptors de glutamat d'AMPA i fan que aquestes sinapsis siguin funcionalment més fortes41,42. D'acord amb aquests informes, les neurones reactivades van presentar un major nombre de diàmetres de cap ampliat (51% de totes les espines de bolets), en comparació amb el grup Activat -late (18%) (Extended Data Fig. 6d). A més, trobem un augment significatiu tant en els nivells de proteïna Gria1 receptor 1, ionotròpic, AMPA1 (Gria1) (Extended Data Fig. 6e), com en els nivells de proteïna Gria1 només en eixos dendrítics de les neurones reactivades, en comparació amb les neurones activades -primerenques i -tardanes(fig. 5g). Col·lectivament, aquestes dades donen suport a la hipòtesi que s'estan sincronitzant diferents programes transcripcionals separats temporalment per mantenir l'excitabilitat neuronal, els canvis estructurals, la traducció de proteïnes i la plasticitat sinàptica, al llarg de la vida útil del conjunt d'engrames.

Els elements reguladors amb efectes transcripcionals oposats interactuen amb els promotors a mesura que la memòria progressa de la codificació a la memòria

A continuació, vam preguntar com la interacció promotora-potenciadora de llarg abast i l'estat de la cromatina podrien conduir als canvis coordinats d'expressió gènica observats en cadascun dels clústers transcripcionals. Per aconseguir-ho, vam mesurar l'accessibilitat de la cromatina sobre els potenciadors que interactuen amb els promotors, de cada clúster transcripcional (fig. 6a-c). A més, la puntuació d'interacció d'aquests potenciadors es va traçar conjuntament contra l'accessibilitat de la cromatina i la seva expressió gènica respectiva (Taula suplementària 10).

Cistanche pot millorar la memòria

En general, tots els clústers van mostrar un augment incremental significatiu en l'accessibilitat de la cromatina en els potenciadors. És important destacar que l'accessibilitat de la cromatina es va produir abans de la reorganització de la cromatina 3D i l'alteració de l'expressió gènica, proporcionant un major suport d'un retard transcripcional (Fig. 6a-c, Dades esteses fig. 7a,b). En concret, en el clúster reactivació, la nostra anàlisi va revelar un procés bifàsic, en el qual la fase inicial dememòriaLa formació condueix a un esdeveniment d'imprimació, on els potenciadors es tornen més accessibles, però no mostren els canvis esperats en l'expressió gènica. La reactivació de les cèl·lules d'engrama es va associar amb la reorganització de les interaccions promotor-potenciador, on els potenciadors preparats es van posar en contacte amb els seus respectius promotors en una freqüència més alta, i es va observar un augment transcripcional (Fig 6a-c). Cistanche pot millorarmemòria.

Anteriorment es va suggerir que les interaccions promotor-potenciador són altament dinàmiques, i les interaccions amb diferents potenciadors combinatoris condueixen a un canvi direccional en l'expressió gènica, depenent de si el potenciador alberga un repressor o motius activadors14, 18.Cistanche pot millorarmemòria.

Per investigar-ho, vam utilitzar crom per segregar imparcialment el genoma en diferents estats definits per llocs de motius que uneixen activadors transcripcionals1 (resposta primerenca de creixement 1 (Egr1), Ap1), repressors transcripcionals43,44 (adenoma pleiomorf semblant a 1 (Plagl1), hipermetilats en càncer 2 (Hic2), proteïna d'unió al metil cpG 2 (Mecp2), Snai2 i Rest,) o TFs que impacten bidireccionalment la transcripció i implicats en l'arquitectura del genoma 3D25, 44,45 (factor d'unió CCCTC (CTCF), factor de transcripció E2F 1 (E2f), Yy1). Això va identificar tres estats combinatoris diferents dels llocs d'unió a TF (repressor fort, activador bivalent i fort, fig. 6d, e). Curiosament, el cúmul amb una reducció de l'expressió gènica (Dw-late) va mostrar una correlació progressivament creixent des de la codificació fins a la recuperació amb potenciadors que alberguen repressors transcripcionals i motius bivalents (fig. 6d, mapa de calor superior; Dades ampliades Fig. 7c,d). Aquestes dades indiquen que, malgrat l'accessibilitat observada de la cromatina, els gens estan regulats a causa de la repressió que està sorgint d'aquests elements reguladors. Cistanche pot millorarmemòria.

En canvi, en el clúster reactivació, vam observar un enriquiment incremental per a potenciadors que alberguen activadors transcripcionals juntament amb motius que ancoren estructures de bucle (Extended Data Fig. 7c,d). Per tant, sembla que després de l'activitat neuronal, diversos promotors poden utilitzar una àmplia gamma de potenciadors diferents per establir noves interaccions promotor-potenciador que puguin coordinar de manera diferencial l'expressió gènica. En aquest model, els promotors de gens regulats per baix tracten amb potenciadors que alberguen repressors transcripcionals, mentre que els gens regulats són el resultat d'interaccions promotor-potenciadores que aporten activadors transcripcionals en estret contacte amb els respectius promotors. Col·lectivament, les nostres dades revelen una reprogramació seqüencial de l'accessibilitat de la cromatina, l'arquitectura del genoma 3D i les interaccions promotor-potenciador al llarg de la formació d'engrames (Dades ampliades fig. 8).