Part 2: Verbascoside protegeix les cèl·lules pancreàtiques contra l'estrès d'ER
Mar 05, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, més , Paola Marciani 1, més , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*
Si us plau, feu clic aquí per tornar a la part 1
3.4 Modulats de Verbascoside -Cèl·lules Activitat i Dinàmica Mitocondrial
Els assajos de viabilitat MTT suggereixen un possible impacte deverbascosiddirectament sobre els mitocondris que assegura l'acoblament de la secreció d'insulina amb l'estat nutricional i la supervivència cel·lular en aquest tipus cel·lular. La forma i el potencial de membrana són marcadors de la salut mitocondrial [42]. Primer es va avaluar el potencial de la membrana mitocondrial etiquetant les cèl·lules amb MitoSpyw Orange CMTMRos, un colorant permeable la concentració del qual depèn del potencial de la membrana mitocondrial interna, mentre que MitoSpyw Green FM es va utilitzar per normalitzar les dades a la massa mitocondrial (figura 4A, B). El potencial de membrana dels mitocondrisverbascosidLes cèl·lules tractades es van incrementar en comparació amb el control tant en condicions basals com d'estrès. Curiosament,verbascosidels metabòlits van exercir diferents efectes. L'àcid del cafè no va millorar el potencial mitocondrial, mentre que l'hidroxitirosol va provocar un deteriorament de la funció mitocondrial depenent de la dosi, d'acord amb les dades sobre la viabilitat cel·lular, aquest efecte va ser més evident després de l'exposició a H2O2 (figura S3).
Com que la funció està estrictament relacionada amb la morfologia, vam mesurar el diàmetre, l'àrea i la circularitat dels mitocondris de Feret. L'estrès oxidatiu agut promou una fisió mitocondrial extensa, donant lloc a mitocondris circulars més petits [42]. En condicions d'estrès H2O2, els mitocondris de les cèl·lules tractades amb verbascòsid eren més allargats i mostraven una superfície més gran que les de control (figura 4C, D i figura S4). La circularitat mitocondrial era menor a les cèl·lules tractades amb verbascòsid que en els controls i les diferències eren més evidents a les cèl·lules tractades amb H2O2 (figura S3), confirmant de nou el paper protector del polifenol.
La capacitat d'aquests orgànuls per modificar la seva forma en resposta a estats nutricionals o condicions estressants està sota el control dels esdeveniments de fusió i fissió i requereix motilitat mitocondrial [39]. El seguiment dels moviments dels mitocondris ens va portar a calcular la distància acumulada recorreguda i l'anàlisi va revelar un augment significatiu de la dinàmica dels mitocondris a les cèl·lules tractades amb verbascòsid en comparació amb el control, ja en condicions basals (figura 4E, F i vídeos S1-S4). L'efecte va ser més pronunciat després del tractament amb H2O2, de fet, el pretractament amb verbascòsid va revertir gairebé completament l'impacte de l'estrès oxidatiu en la dinàmica mitocondrial.
En conjunt, aquestes dades donen suport fermament al paper clau del verbascòsid per garantir la dinàmica dels mitocondris, que és crucial per promoure la ràpida adaptació d'aquest orgànul a les condicions d'estrès.
3.5 Impacte del verbascoside sobre la supervivència i la funció humana de Langerhans
Tenint en compte el potencial translacional deverbascosidAplicació en salut humana, vam verificar el seu impacte en els illots humans aïllats de Langerhans, un model més rellevant per a estudis fisiopatològics i farmacològics sobre cèl·lules. Els illots aïllats es van tractar amb 16 uM de verbascòsid durant 5 dies i es va avaluar el potencial de la membrana mitocondrial. Tal com s'informa a la figura 5A, mentre que el potencial dels orgànuls es va veure compromès en els illots humans de control després de l'exposició a H2O2, el potencial de membrana interna dels mitocondris en els illots tractats prèviament amb verbascòsid no va disminuir significativament, donant suport a la hipòtesi d'un paper protector del verbascòsid contra les ROS induïdes. disfunció cel·lular. L'anàlisi de l'expressió dels marcadors d'estrès ER va mostrar una reducció important de la fracció P-eIF2 en les dues preparacions d'illots diferents mantingudes en 16 uM de verbascòsid, confirmant la baixada d'aquesta via també en mostres humanes (figura 5D). Els efectes beneficiosos del tractament amb polifenols van ser corroborats per l'augment del contingut d'insulina observat als illots tractats amb verbascòsid en comparació amb els controls (figura 5B). La dispersió de dades als nostres experiments no va permetre demostrar cap diferència significativa de la secreció d'insulina estimulada per glucosa (GSIS) als illots tractats amb verbascòsid, tot i que sembla evident una tendència positiva tant en condicions basals com d'estrès (figura 5C).
4. Discussió
L'estrès oxidatiu i la inflamació són la base de la disfunció cel·lular que es produeix durant la T2D [43,44] com a tal, els aliments funcionals, els nutracèutics i els fitoquímics s'han investigat com a eines per prevenir la diabetis tipus 2 [45]. En aquest treball, ens vam centrar en el verbascòsid, que se sap que exerceix activitats antiinflamatòries i antioxidants a les neurones [18]. Malgrat l'alta complexitat estructural, s'han trobat verbascòsid i isoverbascòsid al plasma sanguini de rates alimentades amb extracte de Lippia citriodora juntament amb alguns metabòlits [20]. A més, s'ha detectat l'acumulació cel·lular de verbascòsid i és verbascòsid en una línia cel·lular de càncer de mama SKBR3 [23] i els estudis realitzats en cèl·lules Caco-2 demostren que quantitats moderades de verbascòsid i isoverbascòsid romanen intactes i bioaccessibles després d'una digestió in vitro. procés. A més, Caco-2 pot absorbir ambdues molècules mitjançant un transport ràpid i lineal en un rang de 10 a 100 uM [22]. No s'han informat dades sobre la biodisponibilitat del verbascòsid en humans, però els estudis esmentats anteriorment suggereixen que pot ser factible que el verbascòsid no metabolitzat travessi la barrera intestinal, circuli pel plasma sanguini i exerceixi efectes antioxidants sobre les cèl·lules endocrines del pàncrees.
Hem trobat un paper protector del verbascòsid depenent de la dosi (0.8-16 uM) a les cèl·lules clonals i humanes, tant en condicions basals com d'estrès. Aquest efecte es deu al propi verbascòsid i no als seus metabòlits àcid cafeïna i hidroxitirosol, que en realitat semblen citotòxics a la concentració de 16 uM. Les concentracions demostrades com a actives en els nostres experiments estan en línia amb les descrites en animals alimentats amb verbascòsid [20].
Tot i que no sabem si el verbascòsid actua extracel·lularment en unir-se a un receptor de membrana o s'interioritza per endocitosi i funciona intracel·lularment, les nostres dades confirmen que el verbascòsid té propietats antioxidants i antiinflamatòries i protegeix les cèl·lules contra les disfuncions associades a l'estrès ER reduint la UPR i promoció de la dinàmica mitocondrial.
De fet, vam detectar una disminució significativa del contingut de ROS a les cèl·lules tractades amb verbascòsid, que es confirma encara més per la reducció de la peroxidació lipídica mesurada mitjançant expressions de HNE i acroleïna. A diferència de la majoria dels polifenols vegetals, l'activitat d'eliminació de ROS de verbascòsid segueix principalment vies indirectes (mitjançant la regulació dels enzims que eliminan ROS) en lloc de vies directes. De fet, augmenta la transcripció gènica d'alguns enzims antioxidants mitjançant l'activació de la via Nrf2 (factor 2 relacionat amb NF-E{3}}) i mitjançant un mecanisme dependent de AhR (receptor d'hidrocarburs aril) [24,29]. Com a tal, vam trobar una expressió més gran de SOD1 a les cèl·lules tractades amb verbascòsid.
L'homeòstasi de ROS és extremadament rellevant en la patologia cel·lular. A causa de l'escassetat d'enzims antioxidants, no es pot neutralitzar una producció elevada de ROS i s'indueix el plegament incorrecte de proteïnes que promou l'estrès ER. L'estrès ER condueix a una reducció de la transcripció i la traducció d'insulina mitjançant l'activació de la UPR [44,46]. Aquesta via té l'objectiu principal de recuperar la funció ER mitjançant la reprogramació de l'expressió gènica, però, quan s'estimula en excés, desencadena l'apoptosi. Les nostres dades suggereixen que una acció important del verbascòsid és mitigar la UPR, permetent les modificacions necessàries per reparar la disfunció ER, sense causar apoptosi. Segons aquesta possibilitat, l'expressió de les proteïnes BIP, HSP70 i PERK es va reduir a les cèl·lules tractades amb verbascòsid i es va atenuar l'activació de la via PERK en resposta a l'estrès ER induït per tunicamicina. Es va informar d'una acció similar per al tirosol a la línia cel·lular d'insulinoma NIT-1 [47].
Particularment interessant és la capacitat del verbascoside per modular l'activació de la branca PERK de la UPR. A les cèl·lules, aquesta via és necessària per mantenir l'homeòstasi secretora basal i la supervivència cel·lular, i està greument desregulada en la diabetis [41,48]. Encara més intrigants, les variants comunes de PERK contribueixen al risc de prediabetis i mutacions recessives en el gen EIF2AK3 (que codifica PERK) subjacent a la susceptibilitat a la síndrome de Wolcott-Rallison caracteritzada per una diabetis neonatal permanent dependent de la insulina [49,50].
També es va detectar una regulació a la baixa de la via inflamatòria IKB -NFKB al nostre sistema en presència de verbascòsid. NFKB representa la via inflamatòria principal a les cèl·lules - i la seva activació sostinguda inicia una cascada d'esdeveniments que culminen amb la mort -cel·lular. A les cèl·lules estressades, la reducció de l'expressió de NFKB protegeix les cèl·lules pancreàtiques dels agents diabetogènics [27, 51], donant suport encara més a l'aplicació del verbascòsid en la prevenció de la diabetis. Curiosament, la senyalització PERK activa els factors de transcripció NFR2 (implicats en l'homeòstasi redox) i NFKB, explicant així els efectes antioxidants i antiinflamatoris del verbascòsid [40,52].
Les nostres dades també revelen un paper important del verbascòsid en l'activitat i la dinàmica mitocondrial.
El marcador de la qualitat operacional mitocondrial és la seva dinàmica, un procés caracteritzat per cicles coordinats d'esdeveniments de fusió i fisió que regulen el nombre, la distribució, la morfologia i el potencial de membrana mitocondrials [39]. D'acord amb aquesta possibilitat, el verbascòsid millora el potencial de membrana mitocondrial tc3 tant en condicions basals com d'estrès. De nou, l'efecte es deu al verbascòsid i no als seus metabòlits, ja que l'àcid de cafeïna no millora la funció mitocondrial i l'hidroxitirosol disminueix significativament el potencial dels orgànuls. Es va observar un augment de la dinàmica mitocondrial i els canvis en la seva morfologia mitjançant el seguiment dels moviments mitocondrials, cosa que suggereix que el verbascòsid promou un programa de mitomorfosi. La remodelació de la xarxa mitocondrial cel·lular afecta el conjunt dels supercomplexos de la cadena respiratòria, alterant així no només el metabolisme cel·lular sinó també el seu estat redox i permetent que les cèl·lules contrarestin millor l'estrès oxidatiu i la inflamació [5,37,39].
Tot i que encara es desconeix el mecanisme molecular, podem plantejar la hipòtesi que el verbascòsid, com altres polifenols, protegeix l'ADN mitocondrial reduint la concentració de ROS [53] i impedeix l'obertura del porus de transició de la permeabilitat mitocondrial [54], assegurant l'activitat mitocondrial fisiològica. Una altra possibilitat intrigant és que la modificació de la dinàmica i l'activitat dels mitocondris estigui mediada de nou per l'acció del verbascòsid sobre la UPR. De fet, una investigació recent en el camp mitocondrial indica que els llocs d'interacció ER-mitocondris tenen un paper clau en el control de la dinàmica i l'activitat mitocondrials en resposta a l'estrès oxidatiu i PERK està implicat en el fenomen [55]. La majoria d'estudis in vitro amb polifenols es van realitzar en línies cel·lulars, sovint d'origen tumoral, que difereixen de les cèl·lules originals pel que fa al metabolisme i la producció de ROS. Aquí proporcionem proves que el verbascoside exerceix un efecte protector també sobre els illots humans aïllats de Langerhans, l'objectiu final de la intervenció en diabetis. Curiosament, el polifenol mitiga l'activació de la senyalització PERK ja en condicions basals, augmentant així el contingut d'insulina i evitant les disfuncions mitocondrials mediades per l'estrès oxidatiu. Queda per dilucidar si l'efecte del polifenol sobre el contingut d'insulina reflecteix la capacitat del compost per prevenir la mort cel·lular, per mitigar l'estrès ER o per controlar directament l'expressió del gen de la insulina, com es mostra per a altres compostos polifenòlics [56]. Aquestes dades són especialment rellevants tenint en compte el possible ús del verbascòsid com a teràpia complementària en el tractament de la diabetis.
5. Conclusions
Els estudis in vitro reportats aquí sobre cèl·lules clonals i humanes indiquen que el verbascòsid exerceix efectes protectors contra les disfuncions associades a l'estrès ER, mitigant l'activació de la branca PERK de la UPR i millorant la dinàmica dels mitocondris. Com que la interrupció de l'homeòstasi ER desencadena danys a les cèl·lules i diabetis, aquestes dades proporcionen una justificació per al possible ús del verbascòsid com a nutracèutic en la prevenció i el tractament de malalties. No obstant això, cal resoldre molts problemes per a una aplicació clínica eficaç del verbascòsid. Malgrat la riquesa d'estudis de laboratori, els estudis clínics fiables que confirmen els efectes sobre la salut del verbascòsid in vivo són limitats. A més, augmentar la seva estabilitat i biodisponibilitat és obligatori per a la futura aplicació d'aquest compost en la salut humana. A partir d'aquest punt, el verbascòsid és una molècula interessant perquè la seva bastida té diferents llocs reactius que es poden modificar per química combinatòria. Esperem que la informació resultant d'aquests estudis obri vies per a la modulació terapèutica de l'estrès oxidatiu i la inflamació en condicions patològiques mitjançant l'ús de compostos naturals.
Materials suplementaris: els següents estan disponibles en línia a http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Figura S1: Efectes de l'àcid de cafeïna i hidroxitirosol sobre la viabilitat cel·lular. Figura S2: Efectes del verbascòsid sobre l'estrès ER induït per tunicamicina. Figura S3: Efectes de l'àcid de cafeïna i hidroxitirosol sobre el potencial de membrana mitocondrial. Figura S4: Anàlisi quantitativa d'imatges de mitocondris en cèl·lules tractades amb àcid de cafeïna i hidroxitirosol. Vídeo S1, S2 Vídeos: Dinàmica mitocòndria registrada en condicions basals, en absència (S1) o presència (S2) de verbascòsid. Vídeo S3, S4: Dinàmica mitocòndria registrada en condicions d'estrès oxidatiu, en absència (S3) o presència (S4) de verbascòsid.
Contribucions de l'autor: Conceptualització, AG, PM i CP; curació de dades, AG i PM; anàlisi formal, AG i PM; adquisició de finançament, CP; investigació, MC; metodologia, AM i SG; recursos, FB, RR i ADG; supervisió, CP; validació, AM, SG i MC; visualització, AG i AM; escrit—esborrany original, AG; redacció: revisió i edició, PM, AM, FB, RR, ADG, MC i CP Tots els autors han llegit i han acceptat la versió publicada del manuscrit.
Finançament: aquesta investigació no va rebre cap finançament extern.
Agraïments: ens agradaria donar les gràcies a Carlo Corino i Mario Dell'Agli pels reactius i la discussió útil.
Conflictes d'interessos: els autors declaren no conflicte d'interessos.
Referències
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: estimacions globals de prevalença de diabetis per a 2017 i projeccions per a 2045. Diabetes Res. Clin. Practiqueu. 2018, 138, 271–281. [Ref creuat]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. La diabetis a la cruïlla: rellevància de la classificació de malalties per a la fisiopatologia i el tractament. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. La biologia cel·lular de la funció sistèmica de la insulina. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Metabolisme del colesterol, funció de les cèl·lules pancreàtiques i diabetis. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Base Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Algèria, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Formació de la diferenciació i funcionament de les cèl·lules pancreàtiques: la influència de la mecanotransducció. Cel·les 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. La diabetis mellitus i la cèl·lula: els darrers deu anys. Cèl·lula 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Reducció de l'exocitosi d'insulina a les cèl·lules pancreàtiques humanes amb variants gèniques relacionades amb la diabetis tipus 2. Diabetis 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dinàmica de la secreció d'insulina en obesitat i diabetis. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [Ref creuat]
9. Roden, M.; Shulman, GI La biologia integradora de la diabetis tipus 2. Natura 2019, 576, 51–60. [Ref creuat]
