Interferència dels glicòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa amb l'assaig MTT

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu i Yu-Qi Gao

Resum:

L'assaig MTT, com a mètode de cribratge, s'ha utilitzat àmpliament per mesurar la viabilitat i la proliferació de cèl·lules. Tanmateix, cal tenir en compte que l'assaig MTT pot no reflectir amb precisió l'efecte deCistanche tubulosaextracte etanòlic sobre la viabilitat de les cèl·lules EA.hy926. Per investigar i identificar els components responsables de les observacions contradictòries de l'assaig MTT, l'equinacòsid i l'acteòsid, es van aïllar dos glucòsids feniletanoides principals, de l'extracte etanòlic de C. tubulosa. Les dades derivades dels assajos CCK-8, Hoechst 33342 i annexina V-FITC/PI suggereixen que el grup cafeoil present en ambdós compostos aïllats va ser responsable dels resultats contradictoris de l'assaig MTT. Aquestes dades posen l'accent en la necessitat d'utilitzar una varietat de mètodes diferents per determinar l'efecte dels agents medicinals sobre la viabilitat cel·lular per evitar generar resultats enganyosos.

Paraules clau: assaig MTT;glucòsid feniletanoide; àcid cafeic; viabilitat cel·lular; interferència

Introducció

La planta parasitàriaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (família Orobanchaceae) es troba àmpliament distribuït als països del nord d'Àfrica, àrabs i asiàtics [1]. El prové deCistanche tubulosaiCistanche deserticolaSón importants en la medicina tradicional xinesa, ja que s'han utilitzat per al tractament de la impotència, l'esterilitat, el lumbago i el restrenyiment a causa de la inèrcia del còlon [2]. A més, s'ha demostrat que l'extracte etanòlic de Cistanche tubulosa té un efecte protector significatiu contra la hipòxia cerebral en ratolins [3].

Les cèl·lules endotelials tenen un paper crucial en la patogènesi de la hipertensió pulmonar hipòxica. La línia de cèl·lules endotelials EA.hy926 és considerablement similar a les cèl·lules endotelials primàries. Durant el nostre propi estudi de l'efecte antihipòxic deCistanche tubulosaextracte etanòlic a la cèl·lula endotelial EA.hy926, vam observar que el 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) L'assaig, que s'utilitza habitualment per avaluar la viabilitat cel·lular en estudis de citotoxicitat i activitat citostàtica, va generar resultats contradictoris mostrant un augment de la viabilitat cel·lular EA.hy926 després del tractament.

Una avaluació precisa de la viabilitat cel·lular és essencial per identificar els possibles efectes citotòxics o citoprotectors d'un agent medicinal. Per tant, vam investigar quins components presents a l'extracte etanòlic de C. tubulosa poden ser responsables dels resultats contradictoris observats amb l'assaig MTT. Vam aïllar dos glucòsids feniletanoides (PhG) principals de l'extracte etanòlic de C. tubulosa, l'equinacòsid (d'ara endavant compost 1) i l'acteòsid (d'ara endavant compost 2), i vam determinar el seu efecte sobre la viabilitat cel·lular EA.hy926 mitjançant diversos mètodes. A més, per tal d'aclarir encara més quin substituent dels compostos 1 i 2 pot ser responsable dels resultats contradictoris, vam provar les seves aglicones, àcid cafeic (d'ara endavant compost 3) i 3,4-dihidroxilfeniletanol (d'ara endavant compost 4), sobre la viabilitat cel·lular EA.hy926 utilitzant els mateixos mètodes.

Resultats i discussió

Identificació de compostos

Les estructures dels dos compostos aïllats de l'extracte etanòlic de C. tubulosa es van identificar mitjançant anàlisis de ressonància magnètica nuclear (RMN) i espectrometria de masses (MS) i es mostren a la figura 1. El compost 1 es va identificar com a equinacòsid en comparació amb la RMN informada anteriorment (taula 1) i dades de MS (m/z 785 [M−H]− ) [4]. Els espectres de RMN del compost 2 eren molt similars als del compost 1, excepte per l'absència d'un grup -D-glucopiranosil (taula 1). El compost 2 (m/z 623 [M−H]−) es va identificar com a acteòsid [5]. És important destacar que tots dos compostos tenen la mateixa aglicona, que inclou àcid cafeic (compost 3) i 3,4-dihidroxilfeniletanol (compost 4).

Assajos de viabilitat cel·lular

Els assajos MTT i CCK{{0}} es van utilitzar per analitzar l'efecte dels compostos 1-4 sobre la viabilitat cel·lular EA.hy926. L'assaig MTT va demostrar que la viabilitat de les cèl·lules EA.hy926 va augmentar significativament després del tractament amb el compost 1, 2 o 3 de 25 i 50 μM (166,3 per cent i 174,1 per cent per al compost 1, 205,8 per cent i 224,3 per cent per al compost). 2 i 164,8 per cent i 189,6 per cent per al compost 3, respectivament; p <0,05), en="" comparació="" amb="" les="" cèl·lules="" de="" control="" (figura="" 2a).="" a="" més,="" una="" inspecció="" morfològica="" de="" les="" cèl·lules="" va="" determinar="" que="" el="" tractament="" amb="" el="" compost="" 1,="" 2="" o="" 3="" de="" 50="" μm="" va="" augmentar="" la="" formació="" de="" cristalls="" de="" formazà="" morat,="" que="" es="" consideren="" una="" indicació="" directa="" de="" la="" proporció="" de="" cèl·lules="" vives="" (figura="" 3).="" per="" contra,="" l'assaig="" cck-8="" va="" suggerir="" que="" la="" viabilitat="" cel·lular="" va="" disminuir="" significativament="" després="" del="" tractament="" amb="" 12,5,="" 25="" i="" 50="" μm="" de="" compostos="" 1,="" 2="" o="" 3="" (75,5="" per="" cent,="" 45,1="" per="" cent="" i="" 43,7="" per="" cent="" per="" al="" compost="" 1,="" 85,5="" per="" cent).="" 51,8="" per="" cent="" i="" 34,3="" per="" cent="" per="" al="" compost="" 2,="" i="" 64,5="" per="" cent,="" 48,2="" per="" cent="" i="" 36,4="" per="" cent="" per="" al="" compost="" 3,="" respectivament;="" p=""><0,05), en="" comparació="" amb="" les="" cèl·lules="" de="" control="" (figura="" 2b).="" el="" compost="" 4="" no="" va="" afectar="" la="" viabilitat="" cel·lular="" ni="" en="" l'assaig="" mtt="" ni="" en="" cck-8.="" la="" discrepància="" entre="" els="" resultats="" obtinguts="" amb="" els="" dos="" assajos="" suggereix="" que="" un="" dels="" dos="" assajos="" pot="" no="" reflectir="" amb="" precisió="" els="" efectes="" dels="" compostos="" 1="" i="" 2="" sobre="" la="" viabilitat="" cel·lular="">

Avaluació de l'apoptosi mitjançant tinció de Hoechst

Hoechst 33342 és una taca d'ADN permeable a les cèl·lules que s'excita per la llum ultraviolada i emet fluorescència blava entre 460 i 490 nm. La cromatina condensada de les cèl·lules apoptòtiques es tenyeix més brillant que la cromatina de les cèl·lules normals [6]. Mentre que les cèl·lules de control mostraven cromatina uniformement dispersa, orgànuls normals i membranes cel·lulars intactes, les cèl·lules incubades amb compostos 1, 2 o 3 de 50 μM durant 48 h mostraven la tinció típica de les cèl·lules apoptòtiques (figura 4A). Per contra, l'exposició de les cèl·lules a 50 μM del compost 4 no va augmentar el nombre de nuclis apoptòtics en comparació amb el tractament de control.

Anàlisi citomètrica de flux de cèl·lules apoptòtiques

L'assaig de doble tinció d'annexina V-FITC/PI identifica cèl·lules apoptòtiques mitjançant la unió d'alta afinitat de l'annexina V-FITC a la fosfatidilserina, que s'exterioritza a les cèl·lules que pateixen apoptosi [7]. En aquest assaig, les cèl·lules viables no s'uneixen ni a l'annexina V ni a la PI i, per tant, no es tenyeixen (quadrant inferior esquerre), les cèl·lules apoptòtiques primerenques es tenyeixen de verd per la unió de l'annexina V-FITC (quadrant inferior dret) i les cèl·lules apoptòtiques tardanes. es tenyeixen de verd i vermell per la unió de l'annexina V-FITC a fosfatidilserina i PI a cèl·lules necròtiques, respectivament (quadrant superior dret). Com es mostra a la figura 4B, les cèl·lules incubades amb els compostos 1, 2 o 3 de 50 μM durant 48 h, el percentatge de cèl·lules apoptòtiques va augmentar del 3,74% (cèl·lules control) al 10,32%, 12,95% i 11,30%, respectivament. En comparació amb les cèl·lules control, el compost 4 no va augmentar el percentatge de cèl·lules apoptòtiques EA.hy926.

D'acord amb els resultats obtinguts amb l'assaig CCK-8 i per la tinció de Hoechst 33342, l'assaig de citometria de flux va mostrar que els compostos 1, 2 i 3 induïen apoptosi a les cèl·lules EA.hy926. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que l'augment de la viabilitat cel·lular EA.hy926 observat amb l'assaig MTT després del tractament amb els compostos 1-3 va representar un resultat fals positiu.

Discussió

El 1983, Mosmann va desenvolupar un assaig colorimètric de microplaques MTT per mesurar la proliferació cel·lular i la citotoxicitat [8]. Aquest assaig senzill, i les seves modificacions, s'utilitzen ara àmpliament als laboratoris de biologia cel·lular d'arreu del món. Els estudis de fraccionament en cèl·lules de mamífers van indicar que el cofactor de nucleòtids de piridina reduït, NADH, és responsable de la major part de la reducció de MTT. Això va ser recolzat per estudis amb cèl·lules senceres [9]. Per tant, la reducció de MTT s'associa amb cèl·lules metabòlicament actives i no només s'acobla amb la respiració mitocondrial, sinó també amb el citoplasma i les membranes no mitocondrials, incloent el compartiment endosoma/lisosoma i la membrana plasmàtica [10]. La càrrega positiva neta de la molècula MTT és el factor principal per a la seva captació cel·lular a través del potencial de membrana plasmàtica.

En particular, l'assaig MTT de vegades pot no reflectir amb precisió l'efecte real que té un compost provat sobre cèl·lules específiques. No obstant això, no s'han identificat les estructures o grups químics que poden provocar resultats conflictius en l'assaig MTT. Estudis recents han demostrat que l'assaig MTT podria subestimar l'efecte antiproliferatiu del gallat (-)-epigallocatequina -3-, el polifenol més abundant en el te verd [11]. En estudis que van utilitzar l'assaig MTT per detectar la quimiosensibilitat tumoral, els agents quimioterapèutics anticancerígens, com l'epirubicina, el paclitaxel, el docetaxel i el mesilat d'imatinib (Gleevec), van mostrar una major viabilitat cel·lular [12, 13]. A més, diversos estudis han informat que certs extractes de plantes i polifenols actius redox podrien interferir amb l'assaig MTT, ja que redueixen directament la sal de tetrazoli MTT en absència de cèl·lules [14].

La necessitat de solubilitzar els cristalls de formazan MTT abans de l'anàlisi espectrofotomètrica en un lector de microplaques i la naturalesa del punt final inherent a la reacció limiten l'ús de l'assaig MTT a determinades aplicacions. Això va conduir al desenvolupament d'anàlegs de tetrazoli en els quals els fragments fenil estaven decorats amb grups sulfonat carregats negativament, com ara 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazoli-5-carboxamida (XTT), una sal interna carregada negativament [15] i 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-({3-carboximetoxifenil){-2-({4-sulfofenil){-2H-tetrazoli (MTS), una sal interna dèbilment àcida estretament relacionada amb MTT [16] . Aquestes modificacions van donar lloc a la producció de productes de formazan solubles en medi de cultiu que van eliminar el requisit d'un pas de solubilització abans de la quantificació. En conseqüència, a mesura que l'augment de la càrrega negativa d'aquestes molècules va reduir la seva capacitat de moure's a través de les membranes cel·lulars [17], els acceptors d'electrons intermedis (IEA), com el 1-metoxi-5-metil fenazinium metil sulfat ({{25} }}metoxi PMS) eren necessaris per facilitar la reducció del colorant tetrazol o per millorar la taxa de reducció.

Més recentment, s'ha desenvolupat una nova generació de sals de tetrazoli solubles en aigua de les quals WST-1 és el prototip [18]. WST-1, una sal interna disulfonada carregada negativament que conté un residu de iode, és més estable que XTT i MTS en presència de 1-metoxi PMS, la seva IEA obligatòria. Això va conduir a la comercialització de WST-1/1-metoxi PMS com un còmode kit de proliferació cel·lular de reactiu únic. S'han desenvolupat diverses altres sals de tetrazoli de la sèrie WST, la més útil de les quals potser és WST-8 [19]. WST-8 sembla tenir propietats de reducció cel·lular molt similars a WST-1 i es comercialitza de manera independent com a assaig CCK-8. El WST-8 és impermeable cel·lular i, per tant, es redueix extracel·lularment, mitjançant el transport d'electrons del NADH intracel·lular al WST-8 a través de la membrana plasmàtica mediat per 1-metoxi PMS. Tot i que tant la reducció de MTT com de WST-8/{1-metoxi PMS està impulsada pel NADH intracel·lular, la font de NADH sembla diferir entre aquests dos mètodes. La reducció de WST-8/{{1-metoxi PMS depèn més de la llançadora de malat/aspartat que uneix el cicle de l'àcid tricarboxílic mitocondrial-NADH amb l'espai extramitocondrial [20].

En experiments preliminars, vam confirmar que els compostos 1, 2, 3 i 4 no podien reduir directament la sal de tetrazoli MTT (no mostrada). En el present estudi, la influència directa dels propis compostos amb el reactiu es va eliminar rentant acuradament les microplaques amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) abans d'afegir la solució MTT o CCK-8, tal com s'indica als protocols del fabricant. No obstant això, els resultats obtinguts amb els dos mètodes encara eren contradictoris (figura 2). Com era d'esperar, la incubació de cèl·lules amb els compostos 1, 2 i 3 va augmentar la reducció de la sal de tetrazoli en formazà morat, en comparació amb el grup control (figura 3), cosa que suggereix que la mera reducció de la sal de tetrazoli en presència d'un compost específic. no és suficient per jutjar la capacitat del compost per interferir amb l'assaig MTT.

Per determinar si els compostos 1, 2, 3 i 4 podrien induir apoptosi a les cèl·lules EA.hy926, es van avaluar els canvis morfològics cel·lulars i l'externalització de la fosfatidilserina. En consonància amb la disminució de la viabilitat cel·lular observada amb l'assaig CCK-8, els resultats de la tinció de Hoechst i l'anàlisi de citometria de flux mitjançant l'annexina V-FITC/PI van suggerir que la inhibició del creixement observada després del tractament amb els compostos 1, 2 i 3 va ser degut, almenys en part, a l'apoptosi cel·lular EA.hy926. Els nostres resultats també van donar suport a la idea que el grup cafeoil present als dos compostos 1 i 2 era responsable dels resultats contradictoris obtinguts amb l'assaig MTT.

De manera similar a les nostres troballes, Rottlerin, un potent obridor de canals de potassi de gran conductància, no va mostrar reactivitat cap a MTT in vitro. Tanmateix, va millorar fortament la formació de cristalls de formazà dins de les cèl·lules, un resultat que estava en evident conflicte amb la inhibició de Rottlerin de NF-κB i la proliferació cel·lular observada mitjançant l'anàlisi de la incorporació de [3H]-timidina a l'ADN [21]. El mecanisme pel qual Rottlerin va millorar la reducció de MTT es va atribuir al seu efecte de desacoblament mitocondrial [22]. Rottlerin té un grup substituent d'àcid cinnamoil. En comparació amb l'àcid cinamoíl, el compost 3 té dos residus hidroxil addicionals, que es troben a C-3 i C-4. Per tant, especulem que el mecanisme pel qual els compostos 1 i 2 causen resultats conflictius en l'assaig MTT també pot estar associat amb els seus efectes de desacoblament mitocondrial. Per provar aquesta hipòtesi, calen estudis comparatius entre els compostos 1, 2 i un desacoblador químic, com la fenilhidrazona de trifluorocarbonilcianur (FCCP).

Secció Experimental

Reactius i productes químics

El compost 3 (àcid cafeic en pols, puresa=98,6 per cent) es va comprar a Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Xina). El compost 4 (3,4-dihidroxilfeniletanol-oli, puresa=98,5 per cent) es va obtenir de Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Xina). MTT i dimetilsulfòxid (DMSO) es van obtenir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). L'assaig CCK-8 es va comprar a Dojin Laboratories (Kumamoto, Japó). Els kits de detecció d'apoptosi Hoechst 33342 i annexina V-FITC/PI es van comprar al Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Xina)

Material vegetal

Les tiges de C. tubulosa es van recollir a la prefectura de Yutian, regió autònoma uigur de Xinjiang, Xina. Els exemplars de bons es van dipositar al Laboratori Clau de Medicina d'Alta Altitud, Tercera Universitat de Medicina Militar (Chongqing, Xina) i van ser autenticats per Yi Zhang de la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Chengdu (Chengdu, Xina)

Extracció i aïllament de material vegetal

Les tiges de C. tubulosa assecades a l'aire (0,6 kg) es van pols i es van extreure amb etanol al 50 per cent durant 2 h a 70 graus. Després d'eliminar el dissolvent a pressió reduïda, l'extracte etanòlic (212, 5 g) es va dissoldre i es va suspendre en aigua (2 L) i es va extreure amb n-butanol (2 L × 3). L'extracte n-butanòlic (110 g) es va cromatografiar en una columna de poliamida i es va eluir amb etanol/aigua (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) produint cinc fraccions (A-E) . La fracció B (65 g) es va fraccionar en una columna ODS; elució amb etanol: aigua (1:9) compost 1 separat (3 g). La fracció D (10,5 g) es va fraccionar en una columna ODS; elució amb etanol/aigua (1:4) compost 2 separat (1 g).

Els espectres de RMN es van registrar en un espectròmetre Bruker Avance 600 en CD3OD amb tetrametilsilà (TMS) com a estàndard intern. Els espectres de masses es van realitzar amb un espectròmetre de masses BioTOF-Q.

Cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars EA.hy926 es van obtenir de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Les cèl·lules es van cultivar en medi RPMI 1640, complementat amb un 10% (v/v) de sèrum fetal boví i un 1% (v/v) de penicil·lina-estreptomicina en un ambient humidificat amb un 5% de CO2 a 37 graus.

Viabilitat cel·lular

La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant els assajos MTT i CCK{{0}}. Els compostos 1 i 2, i les seves aglicones, àcid cafeic (3) i 3,4-dihidroxilfeniletanol (4) es van dissoldre en DMSO fins a la concentració final de DMSO <0, 1="" per="" cent="" (v/v)="" en="" medis="" de="">

Les cèl·lules EA.hy926 es van sembrar a 96-plaques de pous a 4 × 103 cèl·lules/pou. Després de la incubació durant 24 h, les cèl·lules es van tractar amb 6, 25-50 μM de compost 1, 2, 3 o 4 durant 24 h. Es va eliminar el medi de cultiu i les cèl·lules es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS). Es van afegir alíquotes (10 μL) de solució MTT d'estoc (5 mg·mL-1) a cada pou que contenia 100 μL de medi i es van incubar amb cèl·lules durant 4 h. Després de la incubació, es va eliminar el medi i es van afegir alíquotes de 150 μL de DMSO a cada pou per solubilitzar els cristalls de formazan. L'absorbància es va mesurar a 490 nm mitjançant un lector de microplaques (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, EUA). La viabilitat cel·lular es va expressar com el percentatge de reducció de MTT, assignant el valor del 100 per cent a l'absorbància de les cèl·lules de control. Tots els experiments es van realitzar tres vegades i es van presentar com a mitjana ± desviació estàndard (SD).

L'assaig CCK-8 es va realitzar seguint la literatura amb lleugeres modificacions [23]. Concretament, les cèl·lules es van tractar amb compostos 1, 2, 3 o 4 de 6, 25-50 μM durant 24 hores i es van rentar dues vegades amb PBS abans d'afegir 10 μL de solució de CCK-8 i 100 μL de medi de cultiu. Després d'incubar la microplaca a 37 graus durant 2 h, es va mesurar l'absorbància a 450 nm mitjançant un lector de microplaques. La viabilitat cel·lular es va expressar com el percentatge de cèl·lules viables respecte a les cèl·lules control (100 per cent). Tots els experiments es van realitzar tres vegades i es van expressar com a mitjana ± SD.

Avaluació de l'apoptosi per tinció de Hoechst 33342

Es van observar canvis morfològics apoptòtics mitjançant la tinció de Hoechst 33342. Breument, les cèl·lules EA.hy926 es van sembrar a 48-plaques de pous (2 × 104 cèl·lules/pou) i es van tractar amb 50 μM de compostos 1, 2, 3 o 4 durant 48 h a 37 graus, rentades dues vegades amb PBS, i es va fixar amb un 4 per cent (v/v) de paraformaldehid durant 15 min a temperatura ambient. Després d'esbandir dues vegades amb PBS, les cèl·lules es van tacar amb Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) durant 5 min a temperatura ambient i es van rentar dues vegades amb PBS. Els nuclis tenyits de Hoechst es van visualitzar mitjançant un microscopi de fluorescència (Olympus, Tòquio, Japó).

Anàlisi de l'apoptosi per citometria de flux

Les cèl·lules apoptòtiques es van detectar mitjançant la tinció doble de l'annexina V-FITC/PI i l'anàlisi de citometria de flux. Breument, després del tractament amb el compost 1, 2, 3 o 4 de 50 μM durant 48 h, es van recollir cèl·lules i es van tornar a suspendre en PBS a 1 × 105 cèl·lules · mL-1. Després de la centrifugació a 500 × g durant 5 min a 25 graus, es van afegir 195 μl de tampó d'unió d'annexina V-FITC i 5 μl d'annexina V-FITC. Després de barrejar suaument amb vòrtex, la barreja es va incubar durant 10 minuts a temperatura ambient a la foscor. Després de la centrifugació a 500 × g durant 5 min a 25 graus, es van afegir 190 μL de tampó d'unió de l'annexina V conjugada amb FITC i 10 μL de PI. Després d'una barreja suau de vòrtex, les mostres es van analitzar mitjançant un citòmetre de flux FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) en 30 minuts.

Anàlisi estadística

Totes les dades experimentals es van expressar com a mitjana ± SD. La importància de les diferències entre les mostres experimentals i el control corresponent es va avaluar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) mitjançant el programari SPSS (versió 11.5). La significació estadística es va establir a p <>

Conclusions

Els nostres resultats suggereixen que la sobreestimació del nombre de cèl·lules viables observades en l'assaig MTT podria emmascarar la citotoxicitat de certs compostos. Per tant, durant els processos de detecció de fàrmacs, recomanem utilitzar diversos mètodes per determinar l'efecte del compost específic en la viabilitat cel·lular (com ara els assaigs CCK-8 i 3 H-TdR) per evitar generar resultats enganyosos.