Part 1: l'acteòsid suprimeix l'osteoclastogènesi mediada per RANKL mitjançant la inhibició de la inducció de C-Fos i la via NF-KB i atenuant la producció de ROS
Mar 05, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Resum
Nombrosos estudis han informat que les citocines inflamatòries són mediadors importants per a l'osteoclastogènesi, provocant així una reabsorció òssia excessiva i osteoporosi.Acteòsid d'herba de cistanche, el principal compost actiu de Rehmannia glutinosa, que s'utilitza àmpliament en la medicina tradicional oriental, té potencials antiinflamatoris i antioxidants. En aquest estudi hem trobat queacteòsidva inhibir notablement la diferenciació i formació d'osteoclasts a partir de macròfags de medul·la òssia (BMM) i macròfags RAW264.7 estimulats per l'activador del receptor del lligand del factor nuclear kappaB (NF-kB) (RANKL).ActeòsidEl pretractament també va prevenir la reabsorció òssia per part dels osteoclasts madurs de manera dependent de la dosi. L'acteòsid (10 mM) va atenuar l'activació estimulada per RANKL de la cinasa p38, les cinases regulades per senyal extracel·lular i la cinasa N-terminal c-Jun, i també va suprimir l'activació de NF-kB inhibint la fosforilació de la subunitat p65 i l'inhibidor kBa. A més, augments mediats per RANKL en l'expressió de c-Fos i factor nuclear de cèl·lules T activades, citoplasmàtica 1 (NFATc1) i en la producció de factor de necrosi tumoral-a, interleucina (IL)-1b , i IL-6 aparentment es van inhibir pel pretractament d'acteòsids. A més, oralacteòsidva reduir la pèrdua òssia induïda per l'ovariectomia i la producció de citocines inflamatòries per controlar els nivells. Les nostres dades suggereixen que l'acteòsid inhibeix la diferenciació i la maduració dels osteoclasts dels precursors osteoclàstics suprimint l'activació induïda per RANKL de proteïnes quinases activades per mitògens i factors de transcripció com NF-kB, c-Fos i NFATc1. Col·lectivament, aquests resultats suggereixen que l'acteòsid pot actuar com un agent anti-resortiu per reduir la pèrdua òssia bloquejant l'activació dels osteoclasts.
Introducció
L'os es remodela constantment per l'activitat equilibrada dels osteoclasts i osteoblasts [1]. Els osteoclasts sorgeixen de cèl·lules precursores hematopoietiques del llinatge monòcit/macròfag, mentre que els osteoblasts són del llinatge mesenquimal [2]. L'activació anormal dels osteoclasts o la reducció de l'osteoblastogènesi poden alterar l'homeòstasi òssia i, finalment, provocar malalties com l'osteoporosi, l'artritis i el càncer d'os [3,4]. L'osteoporosi és una malaltia òssia comuna que augmenta el risc de fractura. La forma més comuna d'osteoporosi és causada per la deficiència d'estrògens en les dones menopausiques. Els medicaments com els corticoides i els antiepilèptics també poden provocar un desequilibri entre la reabsorció i la formació òssia, que pot provocar osteoporosi [5].
Per tractar l'osteoporosi s'han utilitzat molts inhibidors anti-resorptius, com ara bisfosfonats, calcitonina, estrògens i moduladors selectius del receptor d'estrògens. Aquests inhibidors mantenen la massa òssia inhibint la funció dels osteoclasts [6]. La teràpia de substitució d'estrògens és el tractament més popular per prevenir i tractar l'osteoporosi postmenopàusica. Tanmateix, la teràpia de substitució d'estrògens a llarg termini pot augmentar el risc de càncer d'endometri i de mama. Per tant, molts investigadors han centrat els seus esforços a desenvolupar un nou agent anti-resorpció que no tingui efectes secundaris [7-10]. Com que els osteoclasts funcionen en la reabsorció òssia, la inhibició específica dels osteoclasts s'ha considerat l'objectiu principal en nombrosos estudis.
Els osteoclasts són cèl·lules gegants multinucleades formades per progenitors mononuclears de la família de monòcits/macròfags mitjançant la proliferació, diferenciació i fusió seqüencials de cèl·lules precursores hematopoietiques [11]. El factor estimulador de colònies de macròfag (M-CSF) i l'activador del receptor del lligand del factor nuclear (NF)-kB (RANK) (RANKL) són factors essencials per a la diferenciació dels osteoclasts [12]. A més, diverses citocines inflamatòries, com el factor de necrosi tumoral (TNF) i la interleucina (IL)-1b, contribueixen a l'osteoclastogènesi modulant la inducció de RANKL, osteoprotegerina i M-CSF [7,13]. La unió de RANKL al receptor RANK de la superfície cel·lular dóna lloc a complexos de factors associats a RANKL/RANK/TNFR (TRAF) que activen seqüencialment NF-kB i proteïnes cinases activades per mitògens (MAPK), inclosa la cinasa c-Jun N-terminal (JNK), p38. cinasa i cinasa extracel·lular relacionada amb el senyal (ERK) [14]. Aquesta activació té un paper clau en la mediació de la diferenciació, activació i supervivència dels osteoclasts. RANKL també activa l'expressió de factors de transcripció com ara un factor nuclear de cèl·lules T activades, citoplasmàtica 1 (NFATc1) i c-Fos, que són essencials per al desenvolupament dels osteoclasts [7,9]. Per tant, la senyalització RANKL es considera l'objectiu principal dels agents anti-resortius que suprimeixen l'activació dels osteoclasts i la pèrdua òssia.
Acteòsidés el principal compost actiu de Rehmannia glutinosa, que s'utilitza àmpliament en la medicina oriental tradicional [15,16]. L'acteòsid és un fort antioxidant i té activitats antihepatotòxiques, antiinflamatòries i antinociceptives [17–20]. Abans vam trobar que l'acteòsid disminueix l'activitat de la tirosinasa i la biosíntesi de melanina mitjançant la regulació de la senyalització ERK [21], protegeix contra el dany gingival mediat per espècies reactives d'oxigen (ROS) [22] i suprimeix el dany cel·lular mediat per micotoxines [23]. Aquests efectes estan estretament relacionats amb la capacitat dels nucleòsids per eliminar ROS i regular la senyalització mediada per MAPK. En particular, es suggereix que ROS mediari les vies de senyalització induïdes per RANKL i els esdeveniments cel·lulars als osteoclasts. El pretractament amb antioxidants va inhibir l'activació induïda per RANKL de NF-kB, ERK i IkBa, suprimint així l'osteoclastogènesi [24]. Aquestes troballes suggereixen fortament que, a més de l'activitat antiinflamatòria, l'activitat antioxidant és crucial per a un agent anti-resorpció, de manera que l'acteòsid pot suprimir l'osteoclastogènesi induïda per RANKL.
En el present estudi, vam explorar si l'acteòsid té un efecte terapèutic sobre la pèrdua òssia. Es van examinar els efectes de l'acteòsid sobre la diferenciació dels osteoclasts i la reabsorció òssia i els mecanismes cel·lulars relacionats mitjançant sistemes experimentals in vitro i in vivo.
L'acteòsid de Cistanche suprimeix l'osteoclastogènesi induïda per RANKL
Materials i mètodes
Declaració Ètica
Les pràctiques d'ús i cura dels animals van ser aprovades pel Comitè d'ètica de la Universitat Nacional de Chonbuk en la cura i l'ús d'animals de laboratori (permís núm. CBU 2010-0007). Tots els experiments d'aquest estudi es van dur a terme segons les directrius del Comitè d'Ús i Cura d'Animals de la Universitat.
Ratolins, productes químics i articles de laboratori
Es van comprar ratolins ICR femelles de quatre setmanes a Orient Bio Inc. (Seül, Corea) i es van allotjar a 2261uC i un 5565 per cent d'humitat en un cicle de 12 hores de llum/foscor amb accés gratuït a menjar i aigua. L'acteòsid (3,4-dihidroxi-bfenetil-Oa-rhamnopiranosil-(1R3)-4-O-cafeoil-bD-glucopiranòsid; C29H36O15) (Fig. S1) es va aïllar de les fulles de Rehmannia glutinosa. L'acteòsid es va dissoldre en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) abans del seu ús. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 i M-CSF es van comprar a R & D Systems (Minneapolis, MN, EUA). Els anticossos específics de c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa i b-actina es van obtenir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). ). Els anticossos per a p-p38 i p38 es van comprar a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Els kits EIA d'assaig de calci i osteocalcina (OC) es van comprar a BioAssay Systems (Hayward, CA, EUA) i Biomedical Technologies (Stoughton, MA, EUA), respectivament, per determinar els paràmetres bioquímics sèrics. El kit d'assaig de fosfatasa àcida resistent al tartrat de ratolí (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, EUA) també es va utilitzar per mesurar el nivell sèric de TRAP5b. Llevat que s'especifiqui el contrari, es van obtenir productes químics addicionals de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA) i els articles de laboratori eren de SPL Life Sciences (Pochun, Corea del Sud).
Cultius cel·lulars
Les cèl·lules de medul·la òssia es van obtenir de les tíbies i els fèmurs de ratolins ICR femenins de 6 setmanes segons els mètodes descrits anteriorment [25]. La suspensió de medul·la òssia es va incubar en un plat de cultiu de 100-mm en presència de 50 ng/ml de M-CSF. Després de 3 dies, es van utilitzar cèl·lules adherents com a macròfags de medul·la òssia (BMM) per induir la diferenciació osteoclàstica. Algunes cèl·lules de medul·la òssia també es van incubar durant 48 h sense M-CSF, i les cèl·lules adherides es van cultivar en un medi diferenciador d'osteoblasts, tal com es descriu en un altre lloc [25]. Les cèl·lules de macròfags RAW264.7 es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS), L-glutamina 2 mM i antibiòtics. Aquestes cèl·lules es van utilitzar com a línia cel·lular de contrapartida per a BMM per explorar l'efecte de l'acteòsid sobre l'osteoclastogènesi.
Diferenciació osteoclàstica i tinció TRAP
Els BMM es van tractar prèviament amb diverses concentracions (0-50 mM) deacteòsiddurant 2 h abans d'estimular amb 100 ng/ml RANKL. Els medis de cultiu es van substituir per medis frescos els dies 2 i 5. Després de 7 dies d'incubació, els cultius es van fixar en paraformaldehid tamponat amb PBS al 4% i es van tacar amb TRAP mitjançant un kit Sigma Aldrich segons les instruccions del fabricant. Les cèl·lules positives amb TRAP es van comptar mitjançant microscòpia òptica i les cèl·lules que contenien 3 o més nuclis es van considerar osteoclasts. Les cèl·lules RAW 264,7 també es van exposar a 100 ng/ml de RANKL després del pretractament amb acteòsid durant 2 h, i després de 7 dies d'incubació, les cèl·lules es van processar per a la tinció de TRAP.
Mesura de la viabilitat cel·lular
La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant un reactiu -8 de sal de tetrazoli soluble en aigua (WST). En resum, les cèl·lules BMM o RAW264.7 cultivades en un medi de creixement que contenia un 10% de FBS i antibiòtics es van tractar amb acteòsid 10 mM o un compost fenòlic com ara quercetina, luteolina, apigenina o gallat d'epigalocatequina (EGCG). El reactiu WST-8 es va afegir als cultius després de 48 h d'incubació. Després d'incubar durant 4 h addicionals, es va mesurar l'absorbància específica de WST-8- a 450 nm mitjançant un lector de microplaques (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, EUA).
Assaig de reabsorció òssia
Els BMM (16105 cèl·lules/ml) es van suspendre en a-MEM que contenia 50 ng/ml de M-CSF i 100 ng/ml de RANKL, després es van dividir en una placa de 24-pou recoberta de nanocristalls de fosfat de calci (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Corea del Sud) a una densitat de 26104 cèl·lules/cm2 amb i sense acteòsid. Després d'incubar durant 7 dies, les cèl·lules es van retirar de les plaques amb un 5% d'hipoclorit de sodi i es va observar la formació de pous sota un microscopi òptic. L'àrea resorbida també es va mesurar amb un analitzador d'imatges i es va expressar com a percentatge del valor de control.
Anàlisi Western Blot
Els lisats de proteïnes sencers es van preparar en un tampó de lisi tal com es descriu en un altre lloc [26]. Les proteïnes citosòliques i nuclears es van preparar tal com es va descriure anteriorment [25]. Es van separar quantitats iguals d'extracte de proteïnes en un 12-15 per cent de SDS-PAGE i es van borrar a membranes de difluorur de polivinil. Les taques es van sondar amb anticossos primaris durant la nit a 4uC abans de la incubació amb anticossos secundaris en tampó de bloqueig durant 1 h. Les taques eren
desenvolupat amb quimioluminescència millorada (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Regne Unit) i exposat a pel·lícules de raigs X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, EUA).
Assaig d'activitat MAPK
Les cèl·lules es van tractar prèviament ambacteòsiddurant 2 h i després estimulat amb RANKL durant un -30 min addicional. Les activitats MAPK es van determinar mitjançant kits d'assaig immunomètric, com ara el kit d'assaig de cinasa p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, EUA), el kit d'assaig enzimàtic p-ERK (Dissenys d'assaig) i el kit ELISA sandvitx p-SAPK/JNK (Cell Signaling Technology, MA, EUA). Tots els procediments van seguir les instruccions del fabricant i es va mesurar l'absorbància mitjançant un lector de microplaques.
Assaig de canvi de mobilitat electroforètica (EMSA)
Les reaccions d'unió a proteïnes d'ADN es van realitzar durant 30 min a temperatura ambient, amb 10-15 mg de proteïna en 20 ml de tampó que contenia 1 mg/ml de BSA, 0,5 mg/ml de poli (dI-dC), 5 per cent de glicerol , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30,000 cpm d'oligonucleòtids marcats amb [a-32P] dCTP i el fragment de Klenow d'ADN polimerasa. Les mostres es van separar en gels de poliacrilamida al 6%, que es van assecar i es van exposar a una pel·lícula de raigs X (Eastman Kodak Co.) durant 12-24 h a 270 uC. Les seqüències d'encebador d'oligonucleòtids específiques per a NF-kB eren 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 i 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
Assaig de luciferasa NF-kB
Els macròfags RAW264.7 de les plaques de 24-pous es van transfectar amb 0,8 mg de vector reporter kB-luciferasa utilitzant 2 ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant. A les 24 h després de la transfecció, les cèl·lules es van estimular amb RANKL en presència i absència d'acteòsid durant 24 h. Les cèl·lules es van tornar a suspendre en 100 ml de tampó de lisi del reporter
(Promega, Madison, WI, EUA). Es van col·locar quantitats iguals de mostres de proteïnes en microplaques 96-pous i es van barrejar amb substrat de luciferasa. La luminescència es va mesurar mitjançant un luminòmetre de microplaques (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanya). En aquest experiment, es va utilitzar un pèptid inhibidor de NF-kB permeable (BIOMOL, Butler Pike, PA, EUA) com a inhibidor de kB positiu.
Mesura de citocines
Les cèl·lules BMM o RAW264.7 es van estimular amb RANKL en presència d'acteòsid a les plaques de cultiu de 24-pous. Després de 48 h d'incubació, es van recollir els sobrenedants de cultiu i es van avaluar mitjançant ELISA mitjançant kits OptEIATM específics de TNF-a-, IL-1b- i IL-6- segons les instruccions del fabricant.
Reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa en temps real (RT-PCR)
L'expressió d'ARNm de marcadors osteoclàstics, com ara c-Fos, NFATc1 i TNF-a, es va determinar mitjançant RT-PCR en temps real. En resum, l'ARN total es va extreure dels macròfags amb el reactiu Trizol segons les instruccions del fabricant (Invitrogen). L'ADNc es va sintetitzar amb 1 mg d'ARN total mitjançant SuperScript Reverse Transcriptase II i primers (Invitrogen). Es va utilitzar Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) per detectar l'acumulació de producte de PCR durant el cicle amb el sistema de detecció de seqüències ABI 7500 (Applied Biosystems). Després de la desnaturalització a 95 uC durant 10 min, la PCR va ser
realitzat mitjançant quaranta 3-cicles de desnaturalització a 95uC durant 15 segons, recuit a 60uC durant 1 seg i extensió a 72uC durant 30 segons. Totes les reaccions de PCR es van realitzar almenys per triplicat, i els nivells d'expressió es van normalitzar al gen HPRT de la casa en la mateixa reacció. Aquest estudi va utilitzar les mateixes seqüències d'imprimació descrites en altres llocs [7].
Mesura de ROS intracel·lular
Es va preparar una solució de reserva de 29,79-diclorodihidrofluoresceïna-diacetat (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Alemanya) en DMSO i es va emmagatzemar a 220 uC a la foscor. En resum, es van cultivar BMM (106 cèl·lules/ml en plaques de 6-pous) amb 50 ng/ml de M-CSF durant 24 h i després es van tractar amb diverses concentracions (0-10 mM) deacteòsid2 h abans de l'estimulació amb 100 ng/ml RANKL. Després d'1 h de co-incubació, aquestes cèl·lules es van incubar posteriorment amb DCFH-DA 25 mM durant 30 min. La fluorescència verda de la 29,79-diclorofluoresceïna (DCF) es va registrar a 515 nm (FL 1) mitjançant un sistema FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EUA) i 10,000 es van comptar els esdeveniments per mostra.
Inducció de l'osteoporosi induïda per ovariectomia
Per a aquest estudi es van utilitzar ratolins ICR femenins (6 setmanes d'edat). Els ratolins van rebre una operació simulada (Sham, n =10) o una ovariectomització quirúrgica (OVX, n=20) sota anestèsia. Una setmana després de la cirurgia, els ratolins OVX es van dividir aleatòriament en 2 grups de 10 ratolins cadascun: OVX bilateral i OVX bilateral suplementat amb 200 ml.
PBS que conté 1 mM d'acteòsid per via oral (grup AC). L'acteòsid oral es va administrar una vegada cada 3 dies durant 8 setmanes després de la cirurgia i
es va administrar la mateixa quantitat de PBS als grups Sham i OVX. Després d'1 dia de l'última administració, es van sacrificar els ratolins i després es van analitzar els paràmetres bioquímics del sèrum i l'estructura òssia 3-dimensional.
Determinació de paràmetres bioquímics sèrics
Es van recollir mostres de sang mitjançant punció cardíaca i es va recollir sèrum per centrifugació. Les mostres de sèrum es van emmagatzemar a 280 uC per a l'anàlisi de paràmetres bioquímics. Els nivells sèrics d'IL-1b i IL-6 es van estimar utilitzant el kit ELISA tal com es descriu anteriorment, mentre que l'activitat de la fosfatasa alcalina (ALP) es va determinar mitjançant un assaig colorimètric bioquímic que mesura la quantitat de p -nitrofenol produït a partir d'un substrat de fosfat de p-nitrofenol, tal com es descriu en un altre lloc [27]. Per estimar els biomarcadors de formació i reabsorció òssia, també es van determinar els nivells sèrics de OC, calci i TRAP5b segons les instruccions dels fabricants.
Anàlisis d'estructura òssia i paràmetres morfomètrics
Els fèmurs dels ratolins (grups Sham, OVX i AC) es van disseccionar i es van omplir de solució salina fisiològica per a proves mecàniques. La resistència mecànica del fèmur es va mesurar tal com es descriu en un altre lloc [28]. La càrrega de fractura es va registrar com la força màxima en newtons en el punt en què es va fracturar la diàfisi mitjana del fèmur dret. A més, es va analitzar histomorfomètricament el fèmur lleuger de cada animal mitjançant un sistema de tomografia per microordinador (micro-TC) (sistema de raigs X de microfocus SkyScan 1076, Kontich, Bèlgica). En resum, els ossos en un emmagatzematge de formaldehid del 4 per cent es van assecar superficialment sobre un teixit de paper abans d'embolicar-los en "pel·lícula adhesiva" de plàstic o en parafilm, per evitar l'assecat durant l'escaneig. Cada os embolicat amb plàstic es va col·locar en tubs d'escuma de plàstic/poliestirè que es van muntar verticalment horitzontalment a la cambra de mostres de l'escàner 1076 per a
imatge micro-TC. L'escaneig es va dur a terme amb una tensió de font de 100 kV i un corrent de font de 140 mA amb una resolució de 35 mm.
Es van reconstruir models tridimensionals dels ossos trabeculars del fèmur mitjançant SkyScan CT Analyzer versió 1.11. Els paràmetres estructurals com ara la densitat mineral òssia trabecular (DMO, g/cm3), percentatge de volum ossi (volum ossi (BV)/volum de teixit (TV), percentatge), gruix (Tb.Th, mm), separació (Tb.Sp). , mm) i el nombre (Tb.N, 1/mm) es van mesurar.
Assaig de diferenciació i mineralització osteogènica Les cèl·lules de medul·la òssia cultivades en plaques de cultiu de {{{{10}}}}pous es van tractar amb DAG (dexametasona 10 nM, àcid ascòrbic 50 mM i b-glicerofosfat 20 mM) al presència d'acteòsid 10 mM. Després de 2 setmanes de diferenciació, les cèl·lules es van fixar amb etanol al 70% (vol/vol) amb gel durant 1 h i es van tacar amb un 0, 2% de vermell d'alizarina S en aigua destil·lada durant 30 min a temperatura ambient. Després que les cèl·lules es van decolorar i assecar a l'aire, es van avaluar les plaques de cultiu cel·lular mitjançant microscòpia lleugera mitjançant un microscopi invertit (Nikon TS100, Japó). Per quantificar la quantitat de colorant vermell, la taca es va eluir amb un 10% de clorur d'acetilpiridini agitant durant 20 min i es va mesurar l'absorbància a 560 nm. La quantitat de calci dipositat a les capes cel·lulars també es va mesurar mitjançant un kit de calci C (Wako Chemical Inc. Osaka, Japó) segons les instruccions del fabricant. A més, l'expressió de marcadors d'ARNm específics d'os, com ara el factor de transcripció relacionat amb runt-2 (Runx2), osterix, sialoproteïna òssia (BSP) i OC es va determinar mitjançant RT-PCR en temps real. Els cebadors d'oligonucleòtids d'aquests marcadors es van dissenyar amb mides de productes inferiors a 200 pb utilitzant Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) tal com es descriu en altres llocs [27].
cistanche acteòside augmenta la formació òssia
Resultats
L'acteòsid inhibeix la formació d'osteoclasts pels macròfags d'una manera dependent de la dosi
Per verificar l'efecte de l'acteòsid sobre la diferenciació de BMM en osteoclasts, les cèl·lules es van cultivar amb diverses concentracions (0-20 mM) d'acteòsid durant 7 dies en presència de 50 ng/ml M-CSF i 100 ng/ml. RANKL. L'acteòsid va reduir el nombre d'osteoclasts de manera dependent de la dosi. Quan les cèl·lules van ser pretractades amb acteòsid 10 mM durant 2 h, el nombre d'osteoclasts va disminuir un 43 per cent en comparació amb les cèl·lules complementades amb M-CSF i RANKL (Fig. 1A). La figura 1B mostra la diferenciació d'osteoclasts mediada per RANKL i la seva inhibició mitjançant el tractament combinat amb acteòsid. D'acord amb aquest resultat, el pretractament d'acteòsid va disminuir la diferenciació estimulada per RANKL de les cèl·lules RAW264.7 i la formació d'osteoclasts (Figs. 1C i D). Quan es va comparar el potencial antiosteoclàstic de l'acteòsid en BMM amb els potencials antiosteoclàstics de diversos compostos fenòlics a la mateixa concentració (10 mM), la luteolina va mostrar la major activitat (Fig. 2A). Tanmateix, la luteolina, la quercetina o la pròpia apigenina van disminuir la viabilitat de les cèl·lules (Fig. 2B). Tots els compostos van inhibir la diferenciació osteoclàstica pels macròfags RAW264.7 amb les següents activitats relatives: luteolina. quercetina=apigenina .
Cistanche acteòsid Inhibeix osteoclast