Els glucòsids de feniletanol de Cistanche Tubulosa suprimeixen l'activació de cèl·lules estel·lades hepàtiques i bloquegen la conducció de les vies de senyalització en TGF-01/smad com a possibles agents anti-fibrosi hepàtica
Mar 05, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang i Tao Liu
Resum: Cistanche tubulosaés una medicina herbal tradicional xinesa àmpliament utilitzada per regular la immunitat iglicòsids feniletanoides(CPhG) es troben entre els components principals responsables d'aquesta activitat. Estudis anteriors han indicat els efectes preventius i terapèutics dels CPhG sobre la fibrosi hepàtica induïda per l'albúmina sèrica bovina (BSA) en rates. L'objectiu de l'estudi va ser avaluar l'efecte anti-fibrosi hepàtica dels CPhG i els monòmers.equinacòsidiacteòsidinhibint l'activació de cèl·lules estelades hepàtiques (HSC), bloquejant la conducció de les vies de senyalització en el factor de creixement transformant-p1 (TGF-p1)/smad, i determinar que són activitat hepatoprotectora in vitro. La proliferació de HSC es va inhibir òbviament després del tractament amb CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacòsid (500.250.125 ^g/mL)/acteòsid (6, 3 ^g/mL), amb valors IC50 de 119.125.520.345 i g/6. mL, respectivament, en l'assaig MTT. Diferents concentracions de CPhG/equinacòsid/acteòsidno va afectar la toxicitat cel·lular a HSC segons les mesures de la lactat deshidrogenasa (LDH). Diferents concentracions de CPhG/equinacòsid/acteòsidva augmentar el nivell d'ARNm i l'expressió de proteïnes de smad7 i va disminuir els nivells d'ARNm de smad2, smad3 i l'expressió de proteïnes de smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) a HSC. En resum, aquests resultats demostren que els CPhG/equinacòsid/acteòsidpot bloquejar la conducció de les vies de senyalització en TGF-p1/smad i inhibir l'activació de HSC, cosa que suggereix queC. tubulosaPer tant, pot ser un medicament herbari potencial per al tractament de la fibrosi hepàtica.
Paraules clau: Cistanche tubulosa; glicòsids de feniletanolCistanche(CPHGs);equinacòsid; acteòsid; cèl·lules estelades hepàtiques (HSC); TGF-p1/smad
1. Introducció
esdevenen proliferatives i fibrogèniques, s'acumulen posteriorment ECM i, finalment, es diferencien en cèl·lules semblants a miofibroblasts fibrogèniques. El factor de creixement transformant-.1 (TGF-p 1) es considera el principal mediador profibrogènic. La via de senyalització relacionada amb TGF-&1 és un mecanisme important de la fibrosi hepàtica, i inclou principalment la senyalització depenent de smad i independent de smad, i es creu que la via de transducció de senyalització depenent de smad és un canal important de senyalització de TGF-p1. . Per tant, el bloqueig de la via de senyalització TGF-p1/smad pot suprimir la producció de col·lagen i, finalment, alleujar la fibrosi hepàtica, fet que ha convertit aquesta via en un objectiu important en la investigació de fàrmacs contra la fibrosi hepàtica dels darrers anys.
Malgrat l'alta incidència mundial de fibrosi hepàtica, no hi ha cap teràpia antifibrogènica generalment acceptada disponible [2-4]. Les herbes medicinals tradicionals xineses (TCHM) són de gran interès per al tractament dels trastorns hepàtics perquè alguns es poden utilitzar com a fàrmacs terapèutics en el maneig i la prevenció de la fibrosi hepàtica. Actualment, molts estudis se centren en possibles fàrmacs antifibrogènics que s'han utilitzat com a TCHM durant milers d'anys [5].
Cistanche tubulosa W (família Orobanchaceae) és una planta paràsita que es cultiva àmpliament a la regió sud de Xinjiang a la Xina [6]. La gent l'utilitza per vigoritzar els ronyons, nodrir la sang, relaxar els intestins i retardar la senescència sense efectes secundaris, i està inclòs oficialment a la Farmacopea Xinesa [7]. C. tubulosa conté una varietat de components actius, com ara glicòsids feniletanoides (CPhG), iridoides i polisacàrids. Entre els molts components actius de C. tubulous, els CPhG, que presenten una sèrie de bioactivitats (antioxidant, antifatiga, radioresistència, etc.) són els components principals característics d'aquesta planta. En els darrers anys, s'ha informat que els CPhGis tenen un excés d'efectes hepatoprotectors de Hent i poden eliminar els radicals dels arbres, protegir les membranes hepàtiques i mostrar efectes immunoreguladors, inhibició de l'apoptosi, inhibició de l'expressió de l'antigen de superfície de l'hepatitis B (HBs Ag) i hepatitis B. L'activitat de replicació de l'ADN de l'antigen (HBeAg) i del virus de l'hepatitis B (VHB), etc. El nivell d'ADN del VHB és l'índex més fiable que reflecteix directament l'activitat de replicació viral, que és el factor clau per determinar la història natural de les infeccions cròniques del VHB, el seguiment de l'efecte de la teràpia antiviral oP i l'avaluació del pronòstic de les infeccions agudes i cròniques per VHB. Els índexs de detecció serològica del VHB inclouen principalment HBsAg, HBeAg, etc. [8—11]. Tanmateix, hi ha pocs informes bibliogràfics sobre els efectes anti-fibrosi hepàtica dels CPhG. Estudis anteriors han indicat els efectes preventius i terapèutics dels CPhG sobre la fibrosi hepàtica induïda per l'albúmina sèrica bovina (BSA) en rates, però l'activitat antifibrogènica dels CPhG i els seus monòmers principals (echinacòsid i acteòsid, figura 1) mai s'han avaluat in vitro.
Cistanche tubulosa orgànica
2. Resultats
2.1. Determinació quantitativa de CPhG
CphGs aC. tubulosacontenen dos glucòsids d'alcohol feniletílic: equinacòsid i acteo, i es va detectar mitjançant l'anàlisi HPLC (figura 1) que el seu contingut en els CPhG era del 42,71% 土 0,42% i 14,27% 土 0.18 per cent, respectivament.
2.2. Activitats inhibidores de CPHG, echinacòsid i acteòsid en HSC-T6
Els CPhG, l'equinacòsid i l'acteòsid (62.5-500 卩g/mL) van inhibir la viabilitat cel·lular de l'HSC de manera dependent de la concentració. Els CPhG i l'acteòsid van mostrar una activitat inhibidora notable a les cèl·lules HSC, amb un 50% d'inhibició dels valors de l'activitat de creixement cel·lular (IC50) de 119,125 昭/mL i 6,999 昭/mL, respectivament. L'echinacòsid va mostrar una activitat inhibidora moderada (IC50,520,345 昭/mL; Taula 1 i Figura 2).
2.3. Toxicitat cel·lular de CPhGs, Echin acoside i Acteorida sobre HSC
La lactat deshidrogenasa (LDH), un enzim citoplasmàtic estable present a totes les cèl·lules, s'allibera ràpidament al sobrenedant del cultiu cel·lular després d'un dany a la membrana plasmàtica. L'activitat enzimàtica en el sobrenedant del cultiu es correlaciona amb la proporció de cèl·lules lisades [12]. Tal com es mostra a la taula 2, quan es van tractar amb diferents: concentracions de C PhG, equinacòsid i acteòsid, tot i que l'activitat de LDH va mostrar un lleuger augment en comparació amb el grup de coirtrol cel·lular, la diferència no va ser estadísticament significativa (p > 0,05). ), cosa que indica que la majoria de les membranes cel·lulars mantenen la seva integritat, i la inhibició de CPhGs, echinacòsid i acteòside a HSC no es deu a una toxicitat cel·lular inespecífica.
2.4. Efecte dels CPHG, Echinacoside i Acteosde sobre la proliferació de HSC induïda per TGF-^i
La proliferació, activació i diferenciació de HSC estan regulades per una varietat de factors. Entre els diferents factors implicats en la fibrosi hepàtica, es considera que el TGF{{0}} és el més important, ja que pot activar l'HSC, promoure la diferenciació de miofibroblasts, augmentar la síntesi de l'ECM i inhibir la degradació de l'ECM i alliberar quimiocines i citocines implicades en la fibrosi hepàtica [13]. En aquest estudi, a excepció del grup control, es van estimular els HSC estacionaris amb TGF-P1 in vitro per simular la formació de fibrosi hepàtica precoç i per investigar l'efecte dels CPhG, l'echinacòsid i l'acteòsid sobre el TGF-p1- proliferació de HSC induïda. Com es mostra a la taula 3, en comparació amb el grup control, el grup TGF-61 va promoure significativament la proliferació de HSC (p <0.01). en="" comparació="" amb="" el="" grup="" tgf-p1,="" tgf-p1="" més="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p=""><0,05), tgf{{18}="" }="" més="" equinacòsid="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p=""><0,05), tgf-p1="" més="" acteòsid="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tots="" van="" inhibir="" notablement="" la="" proliferació="" de="" hscs="" induïts="" per="" tgf-|3="" 1="" en="" diferents="">
2.5. Expressions d'ARNm smad2) smad3 i smad7 després de la intervenció de CPhG, ochmacoside i acteaside en HSC
Smad3 i smad2 són efectors clau aigües avall de la via de senyalització TTGF-p [14, 15], i smad7 és un inhibidor de la senyalització smad. Teòricament, l'augment de l'expressió de smad7 o la disminució de l'expressió de smad2/smad3 poden bloquejar la conducció de les vies de senyalització a TGF-p 1/smad. Com es mostra a la figura 3, l'anàlisi quantitativa de PCR en temps real va mostrar que l'expressió d'ARNm de smad2 i smad3 indicava un nivell més baix, mentre que smad7 indicava nivells més alts en el grup control, en comparació amb el grup TGF-|31. Al grup TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), el nivell d'ARNm de smad2 (p <0).{{37 }}5)="" i="" smad3="" (p=""><0, 01)="" es="" van="" reduir="" significativament="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" tgf-pf,="" i="" fins="" i="" tot="" van="" ser="" similars="" al="" grup="" control;="" mentrestant,="" el="" nivell="" d'arnm="" de="" smad7="" va="" augmentar="" significativament="" al="" grup="" tc="" (50,="" 75.100="" 卩g/ml)="" (p=""><0,05, p=""><0,05, p=""><0,01, respectivament).="" malgrat="" això;="" l'expressió="" smad7="" va="" indicar="" una="" tendència="" ascendent="" al="" grup="" tc="" 25="" 卩g/ml="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" tgf-p1="" (figura="">
Mentrestant, en comparació amb el grup TGF-p1, l'expressió de l'ARNm smad2 i smad3 es va reduir significativament a la TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) (p <{23}}.01) i="" les="" expressions="" d'arnm="" smad7="" van="" augmentar="" significativament="" al="" grup="" te="" (125,="" 250.500="" 昭/ml)="" (p=""><0, 01)="" (figura="" 4)="" .="" de="" la="" mateixa="" manera,="" el="" grup="" ta="" (0,="" 75,="" 1,="" 5,="" 3,="" 0,="" 6,="" 0="" ^="" g/ml)="" també="" va="" mostrar="" la="" mateixa="" tendència="" (figura="">
2.6. Influència dels CPhG, Echinacoside i Ac)eòsids en la via de senyalització T GF-^i/smad en HSC
La via de senyalització TGF-p 1/smad depèn de smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) i smad7, on p-smad2, p-smad3 són les formes activades de smad2 i smad3. En aquest estudi, es van analitzar els nivells de proteïnes d'omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 i smad7. L'anàlisi de Western blot va detectar augments dels nivells de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 per part de TGF-p1, i la inhibició d'aquests augments per CPhGs, ec hinacoside i acteòside; Mentrestant, l'anàlisi de wesiern blot va revelar nivells de smad7 regulats per CPhG, echinacòsid i acteòside. (Fi guras 6-8).
Com es mostra a la figura 6, en comparació amb el grup c on2rol (les expressions de proteïnes de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 van augmentar significativament i l'expressió de la proteïna smad7 es va reduir al grup TGF-p1. En el TC (25) , 50, 75, 100 昭/mL) grups de fàrmacs, el smad/ (figura 6A), p-smad2 (figura 6B), smad 3 (figura 6C), p -smad3 (Figura 6D) les expressions eren significativament inferiors a les del grup TGF-p1 (卩 < 0, 01) i l'expressió de la proteïna smad7 (Figura 6E) era superior a la del grup TGF-S1 (p < 0, 01) (Figura 6).
Al mateix temps, es van mesurar les expressions de la proteïna smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 i smad7 després de la intervenció d'echinacòsid i acteòside en HSC. Com es mostra a les figures 7 i 8, els nivells d'expressió de proteïnes smad2, smad3, p-smad2 i p-smad3 es van inhibir significativament (p <0.05 o="" p=""><0,01). ),="" el="" nivell="" d'expressió="" de="" la="" proteïna="" smad7="" va="" ser="" elevat="" (p=""><0, 01),="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" tgf-p="" 1="" (figures="" 7="" i="">
3. Discussió
La fibrosi hepàtica és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat a tot el món, però actualment hi ha opcions terapèutiques molt limitades disponibles per a aquesta malaltia, per tant, és molt important per a nosaltres buscar dianes potencials per a la intervenció terapèutica per prevenir el desenvolupament de la fibrosi hepàtica. 16]. Recentment, els investigadors han descobert que diversos medicaments a base d'herbes tenen efectes hepatoprotectors d'antifibròtics. Molts TCHM com les píndoles de Fufang Biejia Ruangan [17] i la decocció de Xiao-chai-hu (shosaiko to al Japó) [18,19] s'han utilitzat àmpliament per tractar la fibrosi hepàtica a la Xina, Corea i Japó durant milers d'anys. C. tubulosa conté una varietat de components actius que inclouen CPhG, iridoides i polisacàrids. Com a una de les bases materials eficaços de C. tubulosa, els CPhG posseeixen una excel·lent activitat hepatoprotectora, però hi ha informació limitada sobre els efectes antifibròtics dels GPhC i els seus compostos relacionats. En aquest estudi, es va investigar com els CPhG, l'echinacòsid i l'acteòsid suprimeixen l'activació de HSC i bloquegen la conducció de la via de senyalització en TGF-p1/snaad com a possibles agents anti-hepàtics de fibrosi in vitro.
La lesió hepàtica de qualsevol etiologia conduirà en última instància a l'activació dels HSC, que pateixen transdiferenciació a cèl·lules fibrogèniques semblants a miofibroblasts [20]. És a dir que els miofibroblasts
es deriven de l'activació i proliferació de HSCss [21], i es considera el mediador de la formació de fibrosi hepàtica. Per aquest motiu, hem realitzat estudis in vitro per comparar les taxes de viabilitat cel·lular dels HSC exposats a CPhG, equinacòsid i acteòsid. Els resultats van mostrar que l'efecte inhibidor de l'acteòsid sobre HSC era el més fort i l'efecte dels CPhG era millor que el de l'echinacòsid. Els sèrums medicats amb CPhG, equinacòsid i acteòsid van inhibir la proliferació de HSC de manera dependent de la dosi.
La LDH és un enzim citoplasmàtic de les cèl·lules vives i no pot penetrar a la membrana cel·lular en circumstàncies normals. Quan les cèl·lules estan danyades, la permeabilitat de la membrana augmenta i la LDH s'allibera a l'exterior de la cèl·lula. Normalment, la LDH pot detectar el grau de dany cel·lular [{{0}}]. La investigació va demostrar que l'activitat LDH de CPhGs, equinacòsid i sèrum medicat amb acteòsids només va mostrar un lleuger augment en comparació amb el grup de control cel·lular, i la diferència no va ser estadísticament significativa (p> 0, 05), cosa que indica que la major part de la membrana cel·lular va mantenir la seva integritat. , i la inhibició dels HSC per CPhG, equinacòsid i acteòsid no es deu a una toxicitat cel·lular inespecífica.
Quan es produeix una lesió hepàtica, els hepatòcits activats poden alliberar TGF-pi que al seu torn activa HSC-T6, per tant, TGF-pi té una estreta relació amb la fibrosi [25-27]. En aquest estudi, els CPhG, l'echinacòsid i l'acteòsid es podrien considerar una estratègia terapèutica atractiva per a la inhibició de la proliferació de HSC després que els HSC fossin estimulats amb wTGF-pi in vitro. Especulem que els CPhG, l'equinacòsid i l'acteòsid es poden utilitzar com a tipus de tractament i/o prevenció de la fibrosi hepàtica i inhibeixen la formació de fibrosi hepàtica precoç. La formació de fibrosi hepàtica és un procés complex d'afectació multifactorial i multicel·lular. En aquest procés patològic, les interaccions cèl·lula-cèl·lula, cèl·lula-citocines i cèl·lula-matriu constitueixen una xarxa feixuga. En aquesta xarxa, el desenvolupament de la fibrosi hepàtica es pot regular mitjançant diferents vies i mitjans de senyalització. TGF-pi és un activador clàssic de l'HSC i un mediador clau en la patogènesi de la fibrosi hepàtica [28]. Els CPhG, l'equinacòsid i l'acteòsid poden inhibir les expressions d'ARNm i proteïnes relacionades amb la via TGF-pi/smad en HSC.
El TGF-pi exerceix els seus efectes cel·lulars a través de la via de senyalització smad, i s'ha considerat un mediador clau en el desenvolupament de la fibrosi i la inflamació del fetge. En unir-se el TGF-pi al receptor TGF-p-tipus II, la cinasa del receptor tipus II fosforila el domini GS del receptor TGF-p tipus I, donant lloc a l'activació del receptor tipus I [29]. Mitjançant l'acció de p-smad2 i p-smad3 en dos residus de serina al motiu SSXS del seu terminal C, les reaccions aigües avall de la via de senyalització smad s'activen mitjançant l'activació del receptor tipus I [30]. P-smad2 i p-smad3 formen complexos oligomèrics amb smad4, després entren al nucli i exerceixen la seva activitat de transcripció biològica. Així, les proteïnes smad transmeten senyals directament des de la cinasa receptora al nucli [3i]. D'altra banda, smad7 es combina fermament amb el receptor TGF-pi, la qual cosa comporta la incapacitat d'activar smad 2/3 així com la inhibició de les vies de transducció del senyal [32]. Smad7 pot actuar per inhibir el p-smad2 i p-smad3, la translocació nuclear dels complexos smad activats i l'activació de (CAGA) (9)-MLP-Luc, donant lloc a una disminució de l'expressió de col·lagen I i una inhibició completa de la transducció del senyal TGF-p [33,34]. Els nostres resultats van demostrar que els CPhG, l'echinacòsid i l'acteòsid poden disminuir les expressions d'ARNm smad2 i smad3 i augmentar l'expressió d'ARNm smad7; inhibeixen les expressions de proteïnes smad2, p-smad2, smad3 i p-smad3 i augmenten l'expressió de la proteïna smad7, cosa que suggereix que els CPhG, l'equinacòsid i l'acteòsid també tenen un paper en la inhibició de l'activació de HSC i, per tant, inhibeixen la fibrosi hepàtica, destacant un potencial antifibròtic. mecanisme.
Es va demostrar que la seqüència dels efectes hepatoprotectors dels tres agents de prova era acteòsid > CPhGs > echinacòsid. Per tal d'aclarir encara més les raons de les diferències en el mecanisme pel qual els CPhG, l'equinacòsid i l'acteòsid protegeixen contra la fibrosi hepàtica, es van analitzar les seves estructures químiques. La part de glicòsid d'alcohol fenetílic sembla ser una estructura essencial per a l'efecte hepatoprotector [35]. L'acteòsid (C29H36Oi5) és un doble glucòsid, i l'equinacòsid (C35H46O20) és un triglicòsid, és a dir, l'equinacòsid té un glucòsid addicional en la seva estructura en comparació amb l'acteòsid, la qual cosa comporta un augment de la seva mida espacial. L'hepatoprotectora o inhibició de l'activitat HSC de l'acteòsid és millor que la de l'echinacòsid, que pot ser degut a l'existència d'un impediment estèric.
protegir el fetge: extracte de cistanche
4. Secció Experimental
4.1. Productes químics i reactius
TGF-pi es va comprar a Peprotech (Rocky Hill, NJ, EUA). La línia cel·lular HSC-T6 es va comprar a Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Xina). El dimetil sulfòxid (DMSO) es va comprar a Sigma Inc. (St. Louis, MO, EUA). Els primers Smad2, smad3 i smad7 van ser produïts per Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Xangai, Xina). El kit de síntesi d'ADNc de la primera cadena de Revert Aid es va comprar a Thermo Scientific (Xangai, Xina). El kit de PCR verd Quantifast SYBR es va comprar a QIAGEN GmbH (Hilden, Alemanya). L'anticòs p-smad2 (ser465/467), el mAb de conill Smad3 (C67H9) i el mAb de conill p-smad3 (ser423/425) es van comprar a Cell Signaling Technology (Boston, MA, EUA). L'anticòs Smad7 es va comprar a Boster (Wuhan, Xina). L'anticòs policlonal Smad2 i l'anticòs monoclonal p-actina es van comprar a Proteintech (Wuhan, Xina). La detecció d'anticossos primaris es va fer mitjançant una solució d'anticossos de 2 graus (Alk-Phos. Conjugated, Anti-conill) i una solució d'anticossos de 2 graus (Alk-Phos. Conjugated, Anti-ratolí) adquirida a Invitrogen™ (Carlsbad, CA, EUA). El kit d'assaig de lactat deshidrogenasa era del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Xina).
4.2. Material vegetal
C. tubulosa es va recollir a Tulufan, a la regió autònoma de Xinjiang Uirghur a la Xina, el maig de 2006. Els materials vegetals van ser identificats com a C. tubulosa per Jiang He, Institut de Matèria Mèdica de Xinjiang. Es va dipositar un exemplar de val a l'Institut de Matèria Mèdica de Xinjiang a la Xina.
4.3. Aïllament i purificació de CPhG i els seus compostos
Els rizomes secs i tallats a rodanxes de C. tubulosa (6,0 kg) es van extreure consecutivament tres vegades a reflux amb etanol al 70 per cent (4,8 L) i després es va eliminar el dissolvent dels extractes combinats per per produir l'extracte d'etanol (1,146 kg). Els extractes d'etanol es van purificar per resina AB-8 per obtenir l'extracte brut de feniletanol glicosids (CPhG s). Després de dissoldre's en aigua, l'acte extret es va purificar mitjançant cromatografia de resina macroporosa d'absorció AB-8 per obtenir els costats totals de feniletanol glico de C. tubulosa (CPhGs, 210 g). Els CPhG es van aplicar a una columna ODS OP{{10}} i es van eluir successivament amb mescles de MeOH-H?. (0:1 -^1:0). Els eluates es van combinar en cinc subfraccions segons el comportament de TLC mitjançant el sistema de dissolvents CHCh-MeOH-H? (6:4:0,5). Les taques es van visualitzar després de la polvorització amb 1 per cent de FeCih. Es van purificar repetidament diverses fraccions mitjançant cromatografia en columna Sephadex LH-20 amb metanol com a eluent, i es van aïllar dos glicòsids de feniletanol dels CPhG. Les seves estructures es van confirmar com a echinacòsid (C35H46O20) i acteòsid (C29H36O15) mitjançant MS, 1H- i MC-NMR [35], les pureses es van determinar que eren del 99, 17 per cent i del 98, 92 per cent, respectivament, per UV-HPLC. Les estructures de l'echinacòsid i l'acteòsid es mostren a la figura 9.
4.5. Determinació quantitativa de CphG
Es va utilitzar cromatografia líquida (HPLC) (LC{{0}}Un instrument HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Japó) per analitzar el contingut d'echina còsida i un cteòsid en els CPhG. Es va utilitzar una columna Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) a 30 graus. Es va utilitzar una fase mòbil isocràtica que consisteix en metanol-acetonitril -1 per cent d'àcid acètic (15:10:75, v/v/v) durant 40 minuts, a un cabal de 0,6 ml/min, amb UV. detecció a 334 nm.
4.6. Cultiu cel·lular
Les cèl·lules HSC es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (Glucosa alta) (DMEM, Pequín, Xina) complementat amb un 10 per cent de sèrum boví fetal (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, EUA), 10 0 UI/mL de penicil·lina i 100 ^g/mL d'estreptomicina (HyClone, Logan, UT, EUA) en una incubadora humidificada a 37 graus amb un 5 per cent de CO2. Aquestes cèl·lules es van subcultivar regularment amb una solució de tripsina al 0, 25 per cent (1x) (HyClone, Logan, UT, EUA) i el medi es va canviar cada 2 dies. Inicialment, les cèl·lules es van cultivar amb DMEM que contenia un 10 per cent de FBS durant 48 h. A continuació, el medi es va substituir per DMEM sense FBS per morir de fam les cèl·lules durant 12 h. Aquestes cèl·lules es van propagar durant 48 h i, després de 48 h, el sèrum es va morir de fam amb un 0,5 per cent de FBS durant 12 h abans d'afegir 5 ng/mL de TGF-&1,
4.7. Determinació dels valors IC50
Després d'una incubació durant la nit en un medi de fam que contenia {{0}},5 per cent de FBS, les cèl·lules HSC es van sembrar en una placa de 96-pou a una densitat de 5 x 104 cèl·lules/ml durant 24 h. Les cèl·lules HSC es van tractar amb CPhG, equinacòsid i acteòsid a diferents concentracions (0, 3,90625, 7,8125, 15,625,31,25, 62,5, 125, 250 i 500 ^ g / ml) durant 48 h. Cada concentració tenia quatre pous. Al final del tractament, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromur de difeniltetrazoli] (Sigma; 5 mg/mL) es van afegir i les cèl·lules es van incubar durant 4 h més. Es va afegir DMSO (200 rL) a cada pou després d'eliminar el sobrenedant. Després d'agitar la placa durant 10 min en un agitador, els valors IC50 es van obtenir mesurant l'absorbància a una longitud d'ona de 490 nm mitjançant un instrument d'etiquetatge enzimàtic (Benchmark PLUS, Hercules, CA, EUA), aquest assaig es va fer per triplicat. Els valors IC50 de CPhGs, equinacòsid i acteòside van ser de 119,125, 520,345 i 6,999 Rg/mL, respectivament.
4.8. Els efectes de la inhibició de la proliferació cel·lular i la viabilitat cel·lular
Les cèl·lules HSC van estar exposades a diferents concentracions de CPhGs (25,50,100 Rg/mL), echinacòsid (125,250,500 Rg/mL) i acteòsid (1,5,3, 6 Rg/mL). Es van aplicar diferents concentracions de CPhG, equinacòsid i acteòsid a la placa en quatre pous consecutius i es van incubar durant 48 h. Els efectes d'inhibició de la proliferació cel·lular i el nivell de viabilitat cel·lular (basat en la mesura de l'activitat LDH alliberada de les cèl·lules danyades al sobrenedant [36]) es van determinar mitjançant un assaig MTT. La taxa d'inhibició es va calcular mitjançant la fórmula següent [37]:
Taxa d'inhibició (per cent) " [1 — (absorbància mitjana del grup experimental/absorbància mitjana del grup control en blanc)] x 100 per cent
Segons les instruccions del kit,
LDH (U/L) {{0}} (DO mesurada - DO control)/(OD estàndard - DO en blanc) x 0,2 mmol/L x 1000
El nostre estudi preliminar va demostrar que els CPhG, l'equinacòsid i l'acteòsid no van afectar la viabilitat cel·lular.
4.9. Activitats antiproliferatives per TGF-^1
Durant molt de temps s'ha considerat que l'HSC activat per TGF-p1 està associat a la fibrosi hepàtica i s'ha proposat la inhibició del creixement de l'HSC com a mètode per tractar la fibrosi hepàtica [36,38]. Els efectes antiproliferatius de CPhG, equinacòsid i acteòside sobre HSC activats per TGF-p1 es van determinar mitjançant un assaig MTT [39]. Utilitzant els procediments i les concentracions de fàrmacs descrits, el
Els grups experimentals incloïen el grup control, el grup TGF-pi, el TGF-pi més diferents grups de fàrmacs de concentració. Tots els grups de cèl·lules excepte el grup control es van cultivar amb DMEM que contenia 5.0 ng/mL TGF-p1 (sense FBS) durant 24 h. L'activitat inhibidora de la proliferació cel·lular es va calcular com a 100 x (absorbància del compost tractat - absorbància de la llum de fons)/(absorbància del model - absorbància de la llum de fons).
4.10. Transcripció inversa-reacció en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El nivell d'expressió d'ARNm de smad2, smad3 i smad7 es va determinar mitjançant PCR en temps real. Per determinar l'expressió d'ARNm a les cèl·lules HSC, les cèl·lules (5 x 104 cèl·lules) es van sembrar en plaques de sis pous amb 3.0 mL de DMEM amb un 10 per cent de FBS i es van incubar durant la nit a 37 graus i 5 per cent de CO2. Després de canviar el medi de cultiu a DMEM sense sèrum, es van afegir CPhG (100,50,25 卩g/mL), equinacòsid (500.250.125 昭/mL) i acteòsid (6, 3,1,5 µg/mL) als pous. Després d'incubació durant 48 h amb CPhGs i composicions de monòmers, es va extreure l'ARN total mitjançant el reactiu TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) i es va agitar vigorosament amb cloroform durant 15 s. Després de deixar reposar a temperatura ambient durant 3 min, el lisat es va centrifugar a 12,000 xg durant 15 min a 4 graus. L'ARN de la fase aquosa es va precipitar amb isopropanol i la fase aquosa superior es va transferir a un nou tub de microcentrífuga. L'ARN es va precipitar afegint un 0,75 per cent d'etanol, després del qual el tub de microcentrífuga es va centrifugar a 12,000 xg a 4 graus durant no més de 5 min. El sobrenedant es va eliminar i l'ARN es va assecar a temperatura ambient durant 5-10 min. Els primers (Sangon) es van dissenyar mitjançant Batch Primer 3 i es mostren a la taula 4. Els resultats es van normalitzar amb l'ARNm del gen p-actina de la casa com a control intern i es presenten com a nivells relatius d'ARNm. Les reaccions es van realitzar amb 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 parell d'imprimadors pM, 8,5 aigua destil·lada i 2,5 rL d'ADNc.
Cada reacció en cadena de la polimerasa es va realitzar en les condicions següents: 95 graus durant 3 min, després 40 cicles de 10 s a 95 graus, 30 s a 55 graus i 10 s a 55 graus -95 graus per a l'extensió, seguits de una única mesura de fluorescència. Els resultats finals es van descriure amb els valors relatius (2_AACt). El càlcul i l'anàlisi es van realitzar mitjançant el sistema de detecció de PCR en temps real iQ5.
4.11. Anàlisi Western Blot
Els extractes de cèl·lules senceres es van preparar mitjançant un tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) amb un 1% d'inhibidor de proteasa Halt i còctels d'inhibidor de la fosfatasa Halt a un 1% (Thermo Fisher Scientific, Inc.). La proteïna total es va utilitzar per a la detecció de smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 i smad7. La concentració de proteïnes es va mesurar i quantificar pel mètode Bradford. La proteïna (10-30 Rg) es va separar en un gel SDS-PAGE de l'10 per cent i es va transferir a membranes de fluorur de polivinilidè (PVDF) (Millipore, Boston, MA, EUA). Les membranes es van bloquejar durant 1 h a temperatura ambient amb un 5% d'albúmina sèrica bovina i els anticossos primaris (anticòs policlonal smad2, anticòs p-smad2, mAb de conill smad3 i mAb de conill p-smad3, dilució 1:1000; mAb de conill de smad7, 1). : 200 dilució, anticossos monoclonals de p-actina, dilució 1:5000) es van incubar a 4 graus durant la nit. El corresponent Alk-Phos. Els anticossos secundaris conjugats es van incubar a temperatura ambient. Finalment, les membranes es van rentar tres vegades amb 1 x Tris-HCl salina amb un 0,1 per cent de Tween 20, i els senyals es van escanejar i visualitzar mitjançant un sistema d'imatge GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). L'anàlisi densitomètrica es va realitzar a les proteïnes d'interès i es va normalitzar a p-actina mitjançant el programari GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). La p-actina es va utilitzar com a control intern.
4.12. Anàlisi estadística
Les dades es van expressar com a mitjanes 土 desviació estàndard (SD). Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). L'anàlisi probit es va utilitzar per analitzar els valors IC50. La importància de la diferència es va calcular mitjançant una prova ANOVA unidireccional i es van considerar que els valors amb p <0, 05="" eren="" estadísticament="">
5. Conclusions
En conclusió, els CPhG de C. tubulosa i els seus components equinacòsid i acteòsid mostren efectes antifibròtics significatius. Entre ells, l'activitat de l'acteòsid és la més potent, mentre que l'activitat dels CPhG es troba entre els dos compostos. La inhibició de l'activació de la senyalització TGF-p1/Smad pot ser el mecanisme subjacent pel qual els CPhG protegeixen contra la malaltia hepàtica crònica associada a la fibrosi, i l'echinacòsid i l'acteòsid són la base efectiva del material antifibròtic de C. tubulosa.
Agraïments:Aquesta investigació va comptar amb el suport de la National Natural Science Foundation of China (81260624). Els autors volen expressar el seu sincer agraïment al professor Tao Liu per la seva millora en la redacció d'aquest article.
Contribucions de l'autor:TL, JZ, S.-PY, LM i S.-LZ van concebre i dissenyar els experiments. S.-PY, TL i JZ van analitzar les dades. S.-PY i JZ van escriure el manuscrit. TL, LM i JZ van revisar el manuscrit. Tots els autors van llegir i aprovar el manuscrit final.
Conflictes d'interès:Els autors declaren no conflicte d'interessos.
Referències
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Desenvolupament de fitomedicina per a malalties del fetge. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Mecanismes de la malaltia: Mecanismes de la fibrosi hepàtica i implicacions terapèutiques. Nat. Clin. Practiqueu. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Lipòcits hepàtics: les principals cèl·lules productores de col·lagen del fetge normal de rata. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Reversió de la fibrosi hepàtica一Real o fantasia? H叩atologia 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Comprensió del mecanisme de la fibrosi hepàtica i possibles enfocaments terapèutics. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Pere, H.; corb; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. A Flora of China, 23a ed.; Comitè Editorial de Flora of China: Acadèmia Xinesa de Ciències, Beijing, Xina, 2013; pàgines 1-16.
7. Comissió de Farmacopea Xinesa del Ministeri Sanitari de la República Popular de la Xina. Farmacopea xinesa; Part 1; Editorial de la indústria química: Beijing, Xina, 2010; pàg. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; Ell, L. Efecte del roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) sobre la toxicitat reproductiva en ratolins induïda per glicòsid de Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Barbeta. Med. 2014, 34, 324-332. [Ref creuat]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE i inhibidors de l'agregació plaquetària de Tamarix hohenackeri Bunge (planta hoste d'Herba Cistanches) que creix a Xinjiang. Farmacognició. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Millora de la colitis induïda per sulfat de dextrano de sodi en ratolins per extracte de Cistanche tubulosa enriquit amb equinacòsid. Phytother. Res. 28 de 2014 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches estimula el cicle redox del glutatió cel·lular mitjançant espècies reactives d'oxigen generades a partir de la respiració mitocondrial en cardiomiòcits H9c2. Farmàcia. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martín, A.; Clynes, M. Fosfatasa àcida: punt final per a les proves de toxicitat in vitro. Cèl·lula Vitro. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [Ref creuat]
13. Lechuga, CG; Hernández-Nazara, ZH; Domínguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincón, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 modula l'expressió de la metaloproteinasa-13 de la matriu a les cèl·lules estelades hepàtiques mitjançant mecanismes complexos que impliquen p38MAPK, PI3-quinasa, AKT i p70S6k. Am. J. Physiol. Gastrointest Hepa Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load regula la formació òssia i l'expressió de l'esclerostina mitjançant un mecanisme dependent de TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun s'associa amb l'oncoproteïna Ski i suprimeix l'activitat transcripcional Smad2. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Ell, M.; Scott, C.; et al. Un circuit genòmic del receptor de vitamina D/SMAD porta la resposta fibròtica hepàtica. Cel·la 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Efectes de les píndoles de Fufang Biejia Ruangan sobre la fibrosi hepàtica in vivo i in vitro. Món J. Gastroenterol. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. La medicina herbal Sho-saiko-to (TJ-9) augmenta les metaloproteinases de la matriu d'expressió (MMPs) amb una expressió reduïda d'inhibidors de teixits de metaloproteinases (TIMP) en cèl·lules estelades de rata. Ciència de la vida. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY El paper del TGF-01 i les citocines en la modulació de la fibrosi hepàtica per Sho-saiko-to en el model lligat de conductes biliars de rata/s. J. Etnofarmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Marcadors bioquímics, components extracel·lulars en fibrosi hepàtica i cirrosi. Nig. QJ Hosp. Med. 17, 2007, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Font i paper dels miofibroblasts en la fibrosi hepàtica. Barbeta. Pharmacol. Bou. 27, 2011 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Model d'isquèmia-reperfusió a la medul·la espinal de rata: estudi de viabilitat cel·lular i senyalització d'apoptosi. Int. J. Clin. Exp. Patol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toxicitat de les nanopartícules i una visió general dels models experimentals actuals. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
